• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高脂飲食小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型特征分析和肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究*

    2020-05-13 05:40:38董志霞程金年宛新建上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心200233
    胃腸病學(xué) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:膽汁酸膽汁膽固醇

    莊 謙 董志霞 葉 欣 程金年 宛新建上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心(200233)

    背景:高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型是膽囊結(jié)石成因及其防治研究常用的動(dòng)物模型。目的:探討高脂飲食小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型特征并進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。方法:20只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組,分別予普通飼料喂養(yǎng)(對(duì)照組)和成石飼料喂養(yǎng)[成石飲食(LD)組]。喂養(yǎng)8周后觀察膽囊結(jié)石形成情況,檢測(cè)血脂和膽囊膽汁脂質(zhì)成分,采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)篩選模型小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因,并進(jìn)行GO和KEGG富集分析。采用real-time PCR驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果:LD組小鼠膽囊膽固醇結(jié)石成石率為100%,對(duì)照組無(wú)結(jié)石形成。LD組小鼠存在明顯的肝大和肝臟脂肪變性,血清總膽固醇、三酰甘油水平以及膽囊膽汁膽固醇含量、膽固醇飽和指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析共篩選出1 330個(gè)差異表達(dá)基因。KEGG分析顯示差異表達(dá)基因主要在脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路富集。GO分析顯示脂肪酸代謝過(guò)程相關(guān)通路是顯著富集的類型。肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和real-time PCR均顯示LD組小鼠肝臟組織中膽汁酸合成相關(guān)基因CYP7A1、CYP8B1、CYP7B1表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論:膽囊膽固醇結(jié)石小鼠存在顯著膽固醇、膽汁酸和脂肪酸代謝紊亂。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可篩選出膽固醇結(jié)石形成過(guò)程中發(fā)揮作用的差異表達(dá)基因,為相關(guān)研究提供參考。

    膽結(jié)石是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)患病率高達(dá)20%[1],我國(guó)報(bào)道的患病率為7%~10%[2],且因人口老齡化、飲食西方化等因素的影響,近年我國(guó)膽結(jié)石發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。根據(jù)所含膽固醇比例不同,膽囊結(jié)石可分為膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石和混合性結(jié)石,我國(guó)以膽固醇結(jié)石最為常見[3]。在膽囊膽固醇結(jié)石的成因及其防治研究中,高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型是常用動(dòng)物模型之一,造模方法為喂飼C57BL/6小鼠4~8周的高膽固醇、高膽酸、高脂肪飼料,成石率可達(dá)100%[4-5],模型動(dòng)物可出現(xiàn)與膽囊結(jié)石患者相似的病理生理學(xué)變化。盡管目前對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石發(fā)生的病理生理學(xué)過(guò)程已有較深入的認(rèn)識(shí),如腸肝循環(huán)膽固醇-膽汁酸代謝異常、膽汁膽固醇過(guò)飽和等[6-8],但對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石形成的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚。因此,本研究成功建立了高脂飲食小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型,并進(jìn)行模型特征和肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,以期為膽固醇結(jié)石的成因研究以及尋找潛在的防治靶點(diǎn)提供參考。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

    SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠20只,6周齡,購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào): SCXK(滬)2018-0006],飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)屏障環(huán)境中。成石飼料(含15%脂肪+1.25%膽固醇+0.5%膽酸)、普通飼料(含0.02%膽固醇;南通特洛菲飼料科技有限公司)??偰懝檀紲y(cè)定試劑盒、總膽汁酸試劑盒、三酰甘油測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);磷脂測(cè)定試劑盒(富士膠片和光純藥株式會(huì)社);Trizol總RNA抽提試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR)、real-time PCR試劑盒(AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix;南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

    二、方法

    1. 動(dòng)物模型建立:實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)1周普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為2組,每組10只,分別予普通飼料喂養(yǎng)(對(duì)照組)和成石飼料喂養(yǎng)[成石飲食(lithogenic diet, LD)組]。環(huán)境條件:12 h光照和12 h黑暗交替,溫度21~25 ℃。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食,每周記錄體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

    2. 組織標(biāo)本采集:喂養(yǎng)8周后,所有小鼠隔夜禁食12 h,稱重并編號(hào);腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)麻醉,摘取眼球留取全血,冰上靜置后3 000 r/min離心10 min,收集上層血清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩ni椎脫臼處死小鼠,打開腹腔,觀察并記錄膽囊膽固醇結(jié)石形成情況。完整剝離膽囊,稱重,以密度為1 g/mm3近似計(jì)算膽囊體積[9],留取膽囊膽汁待測(cè)。肝臟和膽囊以4%多聚甲醛固定或液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    3. 血脂和膽囊膽汁脂質(zhì)檢測(cè):吸取血清,采用總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè);吸取混勻的膽囊膽汁,采用總膽固醇、總膽汁酸、磷脂測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。操作均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。分別計(jì)算膽汁中膽固醇、膽汁酸和磷脂摩爾濃度占三者摩爾濃度之和(即膽汁總脂質(zhì)摩爾濃度)的百分比,根據(jù)Carey表計(jì)算膽汁膽固醇飽和指數(shù)[10]。

    4. 肝臟和膽囊組織學(xué)檢查:肝臟、膽囊組織4%多聚甲醛固定、脫水、透明、包埋、切片,常規(guī)行HE染色,肝臟組織另行油紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。使用Image-Pro Plus軟件(v6.0)分析油紅染色切片中紅色脂滴面積占整個(gè)視野面積的百分比,進(jìn)行油紅染色定量。

    5. Illumina 高通量測(cè)序和分析:由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行小鼠肝臟組織 RNA提取和檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)檢和上機(jī)測(cè)序,并進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控和基因表達(dá)分析。

    ①建庫(kù)測(cè)序:每組取5只小鼠的肝臟組織提取RNA并檢測(cè),濃度和總量達(dá)標(biāo)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。以磁珠富集真核生物mRNA,將mRNA打斷成短片段,以mRNA為模板依次合成cDNA第一鏈和第二鏈;繼而對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行3’-末端腺苷酸化,再連接測(cè)序接頭,最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集cDNA。文庫(kù)構(gòu)建完成后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢,合格后通過(guò)Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

    ②生物信息學(xué)分析:對(duì)測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行過(guò)濾,得到干凈、有效、高質(zhì)量的clean reads。應(yīng)用Hisat2軟件(v2.0.6)將由測(cè)序數(shù)據(jù)得到的reads比對(duì)參考基因組,進(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋和定量。應(yīng)用edgeR軟件(v3.3.3)分析基因在各樣本中的差異表達(dá)情況,并進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正,得到校準(zhǔn)后P值。以校準(zhǔn)后P值<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)>2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。應(yīng)用R語(yǔ)言(v4.0.2)繪制展現(xiàn)差異表達(dá)結(jié)果的火山圖和熱圖。

    基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology, GO; http://www.geneontology.org/)可對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述。從生物過(guò)程(biological pro-cess)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三個(gè)層面對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,確定差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能。同理,應(yīng)用京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG; https://www.kegg.jp/)對(duì)各個(gè)信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因數(shù)目和富集情況進(jìn)行KEGG富集分析。本研究使用clusterProfiler軟件(v3.16.1)進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析。

    6. Real-time PCR驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá):以Trizol試劑提取肝臟組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)試劑說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系,檢測(cè)膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)、微粒體甾醇12α-羥化酶(sterol 12α-hydroxylase, CYP8B1)、氧甾醇7α-羥化酶(oxysterol 7α-hydroxylase, CYP7B1)、甾醇27α-羥化酶(sterol 27α-hydroxylase, CYP27A1)表達(dá)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    表1 肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因PCR引物序列

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、小鼠一般情況和膽囊膽固醇結(jié)石形成率

    喂養(yǎng)8周后,對(duì)照組小鼠膽囊中未見結(jié)石,膽汁澄清透亮;LD組小鼠膽囊中可見鵝卵石樣或不規(guī)則形態(tài)結(jié)石形成,膽汁混濁,可見大量膽固醇結(jié)晶(圖1A),成石率為100%。兩組小鼠造模期間體質(zhì)量無(wú)明顯差異(P=0.465;圖1B);LD組膽囊體積大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;圖1C);兩組肝質(zhì)量/體質(zhì)量比分別為6.75%±0.45%和4.87%±0.21%,LD組明顯大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;圖1D),表明成石飼料可致小鼠肝臟體積增大。

    **兩組間比較,P<0.01

    二、小鼠血脂、膽囊膽汁脂質(zhì)成分和肝臟、膽囊組織學(xué)改變

    與對(duì)照組相比,LD組小鼠血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P=0.02;圖2A)。

    LD組小鼠膽囊膽汁內(nèi)膽固醇占總脂質(zhì)的百分比高于對(duì)照組,膽汁酸占總脂質(zhì)的百分比低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P=0.03;圖2B);膽固醇占比升高、膽汁酸占比降低,導(dǎo)致膽汁膽固醇飽和指數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;圖2C)。

    兩組間比較,*P<0.05, **P<0.01

    對(duì)照組小鼠肝臟組織HE染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯病變,LD組則可見大量脂肪變性空泡,提示肝臟脂肪變性(圖3A);油紅染色LD組紅色脂滴面積占視野面積百分比高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;圖3B),提示肝臟脂質(zhì)沉積。與對(duì)照組相比,LD組小鼠膽囊壁明顯增厚(圖3C)。

    **兩組間比較,P<0.01A:肝臟HE染色(×150);B:肝臟油紅染色(×300);C:膽囊HE染色(完整視圖,×50;局部放大視圖,×200)圖3 對(duì)照組與LD組小鼠肝臟、膽囊HE染色和肝臟油紅染色比較

    三、肝臟差異表達(dá)基因篩選

    以P<0.05和差異表達(dá)倍數(shù)>2為標(biāo)準(zhǔn),共篩選出1 330個(gè)LD組肝臟組織相對(duì)于對(duì)照組的差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因420個(gè),下調(diào)基因910個(gè),據(jù)此繪制火山圖(圖4A),熱圖展示了差異表達(dá)最顯著的前50個(gè)基因(圖4B)。

    圖4 LD組小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因火山圖(A)和熱圖(B)

    四、差異表達(dá)基因KEGG富集分析和GO功能富集分析

    對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在19條通路顯著富集(圖5A),主要富集于脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路。GO功能注釋、富集分析顯示,在生物過(guò)程分組,脂肪酸代謝過(guò)程相關(guān)通路是顯著富集的類型;在細(xì)胞組分分組,細(xì)胞膜等與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的細(xì)胞組分是顯著富集的類型;在分子功能分組,甾體羥化酶活性、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等相關(guān)通路是顯著富集的類型(圖5B)。

    圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析(A)和GO富集分析(B)

    五、Real-time PCR 驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)

    肝臟組織中膽汁酸合成相關(guān)基因CYP7A1、CYP8B1和CYP7B1在LD組的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02,P<0.01,P<0.01),兩組間CYP27A1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;圖6)。上述基因表達(dá)情況的real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果與肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果一致。

    兩組間比較,*P<0.05, **P<0.01

    討 論

    目前觀點(diǎn)認(rèn)為,膽汁膽固醇過(guò)飽和是膽固醇結(jié)石形成的首要條件[8]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)8周成石飼料喂養(yǎng)后,小鼠膽囊膽汁中膽固醇含量明顯增加。小腸是膽固醇吸收的主要場(chǎng)所,成石飼料中的膽酸可顯著促進(jìn)小腸膽固醇吸收[5]。過(guò)量的膽固醇吸收使小鼠血清總膽固醇以及其他脂質(zhì)含量明顯增加。此外,成石飼料喂養(yǎng)的小鼠還表現(xiàn)為肝大和顯著的肝臟脂肪變性,肝臟分泌進(jìn)入膽汁的膽固醇增多,最終導(dǎo)致膽汁膽固醇含量增加,促進(jìn)膽汁膽固醇過(guò)飽和發(fā)生和結(jié)石形成。盡管成石飼料中含有15%的脂肪,但本研究中LD組小鼠造模過(guò)程中體質(zhì)量的變化與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異。既往研究也發(fā)現(xiàn),在高脂飲食中額外添加0.5%膽酸可在不影響小鼠進(jìn)食量的情況下顯著抑制和逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加,其機(jī)制可能與膽酸與G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1)結(jié)合,進(jìn)而通過(guò)環(huán)腺苷酸(cAMP)介導(dǎo)甲狀腺激素激活、增加能量消耗有關(guān)[11-12]。因此,添加膽酸是膽固醇結(jié)石模型與許多其他高脂飲食模型的重要不同之處,在參考其他無(wú)膽酸高脂飲食模型的研究結(jié)果時(shí),應(yīng)考慮如有膽酸存在,對(duì)結(jié)果會(huì)有何種影響。

    轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有 RNA的總和,轉(zhuǎn)錄組學(xué)能從整體水平研究基因功能,篩選出差異表達(dá)基因,為在分子水平尋找潛在致病基因提供了極大的便利[13]。本研究通過(guò)Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)小鼠肝臟組織RNA進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析,探討成石飼料誘導(dǎo)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成的潛在機(jī)制。結(jié)果共篩選出1 330個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因420個(gè),下調(diào)基因910個(gè)。膽汁酸主要由肝細(xì)胞通過(guò)經(jīng)典途徑和替代途徑合成。經(jīng)典途徑由CYP7A1啟動(dòng),替代途徑由CYP27A1啟動(dòng),CYP8B1、CYP7B1也在膽汁酸合成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。Real-time PCR驗(yàn)證顯示,膽汁酸合成限速酶CYP7A1在LD組小鼠肝臟組織中表達(dá)下調(diào), CYP8B1、CYP7B1表達(dá)亦顯著下調(diào),提示模型小鼠自身膽汁酸合成顯著受抑,推測(cè)可能與成石飼料中的膽酸激活核受體法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR),進(jìn)而抑制CYP7A1等基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)[15-16]。既往研究發(fā)現(xiàn)普通飼料喂養(yǎng)的小鼠膽汁中存在大量親水性膽汁酸?;?β鼠膽酸(tauro-β-muricholic acid, T-βMCA)[14],而經(jīng)成石飼料喂養(yǎng)后,疏水性膽酸鹽替代了膽汁中原先含量最高的T-βMCA,膽汁疏水性增加,進(jìn)而促進(jìn)膽汁膽固醇過(guò)飽和發(fā)生[5,17]。膽固醇結(jié)石與胰島素抵抗以及非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病等代謝相關(guān)疾病存在密切聯(lián)系[7,18],有學(xué)者認(rèn)為膽固醇結(jié)石是代謝綜合征的一種表現(xiàn)形式[19]。本研究KEGG分析進(jìn)一步顯示,LD組小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因主要在脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路富集;GO分析提示脂肪酸代謝過(guò)程相關(guān)通路是顯著富集的類型。因此,膽汁酸、脂肪酸等代謝紊亂可能是膽囊膽固醇結(jié)石形成的重要因素。

    綜上所述,本研究探討了高脂飲食誘導(dǎo)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型的特征,并通過(guò)肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出在膽固醇結(jié)石形成過(guò)程中發(fā)揮作用的差異表達(dá)基因,研究結(jié)果提示模型小鼠存在自身膽汁酸合成障礙以及膽固醇、脂肪酸代謝紊亂,可能與膽固醇結(jié)石形成密切相關(guān),為膽固醇結(jié)石成因及其防治研究提供了參考。

    猜你喜歡
    膽汁酸膽汁膽固醇
    膽汁酸代謝與T2DM糖脂代謝紊亂的研究概述
    保健醫(yī)苑(2022年1期)2022-08-30 08:39:52
    降低膽固醇的藥物(上)
    中老年保健(2022年3期)2022-08-24 02:58:40
    降低膽固醇的藥物(下)
    中老年保健(2022年4期)2022-08-22 02:59:58
    妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:28
    總膽汁酸高是肝臟出問(wèn)題了嗎?
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:26
    膽汁酸代謝在慢性肝病中的研究進(jìn)展
    膽固醇稍高可以不吃藥嗎等7題…
    超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺置管引流術(shù)在膽汁瘤治療中的應(yīng)用
    新生兒膽紅素和總膽汁酸測(cè)定的臨床意義
    在线亚洲精品国产二区图片欧美| 青春草亚洲视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女边吃奶边做爰视频| 性色avwww在线观看| 91精品国产国语对白视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 一个人免费看片子| 欧美最新免费一区二区三区| 久久99蜜桃精品久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 青春草国产在线视频| 国产在线一区二区三区精| 蜜桃在线观看..| 岛国毛片在线播放| 一区二区三区精品91| 中国三级夫妇交换| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品自拍成人| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 色视频在线一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av日韩在线播放| 少妇人妻 视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品一区二区三区视频在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人一区二区在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲美女视频黄频| av国产精品久久久久影院| 国内精品宾馆在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 欧美日韩精品成人综合77777| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费看av在线观看网站| av有码第一页| 亚洲av男天堂| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av网站免费在线观看视频| 一级片'在线观看视频| 五月天丁香电影| 一级爰片在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av不卡在线播放| 18禁观看日本| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 成年动漫av网址| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产 一区精品| 亚洲天堂av无毛| 有码 亚洲区| 一二三四中文在线观看免费高清| 另类精品久久| 国产精品不卡视频一区二区| 男女边摸边吃奶| 黑人高潮一二区| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av男天堂| 久久久久国产网址| 中文天堂在线官网| 亚洲av男天堂| av不卡在线播放| 中文字幕免费在线视频6| av视频免费观看在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| freevideosex欧美| 国产男女内射视频| 欧美日韩av久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产欧美亚洲国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美国产精品一级二级三级| 老司机影院成人| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在现免费观看毛片| 少妇精品久久久久久久| av.在线天堂| 草草在线视频免费看| 久久热在线av| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜免费观看性视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品乱久久久久久| 99久国产av精品国产电影| 高清欧美精品videossex| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲成人av在线免费| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 桃花免费在线播放| 一级毛片我不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 国产在线免费精品| 久久这里只有精品19| 校园人妻丝袜中文字幕| 老司机亚洲免费影院| 在线观看www视频免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜福利,免费看| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜91福利影院| 性色av一级| 男人添女人高潮全过程视频| 国产av码专区亚洲av| 久久久久视频综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品国产国语对白av| 日本91视频免费播放| 男女免费视频国产| 国产精品一区二区在线不卡| 飞空精品影院首页| 欧美xxⅹ黑人| 久久影院123| 国产成人欧美| 成人免费观看视频高清| 一边亲一边摸免费视频| 蜜桃国产av成人99| av.在线天堂| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲美女搞黄在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人二区视频| 欧美xxⅹ黑人| 看免费av毛片| 精品亚洲成国产av| 一级,二级,三级黄色视频| xxxhd国产人妻xxx| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 国产片内射在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 满18在线观看网站| 视频中文字幕在线观看| 日本欧美视频一区| 91国产中文字幕| 美女福利国产在线| 赤兔流量卡办理| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 久久av网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲av免费高清在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 99热网站在线观看| 久久精品夜色国产| 大陆偷拍与自拍| 国产激情久久老熟女| 久久久久久人人人人人| 国产熟女欧美一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av在线老鸭窝| 欧美日韩精品成人综合77777| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 秋霞伦理黄片| 日本色播在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 色94色欧美一区二区| 在线观看三级黄色| 久久久久久久国产电影| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费黄频网站在线观看国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲成人手机| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产精品专区欧美| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 色94色欧美一区二区| 九色成人免费人妻av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产成人一区二区在线| 高清av免费在线| 晚上一个人看的免费电影| 日本黄大片高清| 黄片播放在线免费| 久久狼人影院| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费日韩欧美在线观看| 九草在线视频观看| 国产视频首页在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品熟女久久久久浪| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 少妇精品久久久久久久| 人人妻人人澡人人看| 老司机影院成人| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品人妻久久久影院| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久97久久精品| h视频一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 最近的中文字幕免费完整| 国产成人精品在线电影| 日韩三级伦理在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久久久久免费av| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 婷婷成人精品国产| 午夜日本视频在线| 99久国产av精品国产电影| 国产在线视频一区二区| 在线观看国产h片| av在线app专区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品久久久精品久久久| 久久久久国产网址| 久久影院123| 少妇精品久久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品蜜桃在线观看| 大香蕉久久成人网| 熟女人妻精品中文字幕| 免费观看av网站的网址| 男男h啪啪无遮挡| 久久久精品免费免费高清| 人人妻人人澡人人看| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品 国内视频| av国产久精品久网站免费入址| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 婷婷色av中文字幕| 日韩人妻精品一区2区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 制服诱惑二区| 少妇 在线观看| 波野结衣二区三区在线| 午夜免费鲁丝| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩一区二区三区影片| 欧美精品一区二区大全| 亚洲综合精品二区| 成人免费观看视频高清| 午夜免费鲁丝| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲在久久综合| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 成年美女黄网站色视频大全免费| 黄色毛片三级朝国网站| 尾随美女入室| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩视频在线欧美| 十分钟在线观看高清视频www| 免费看av在线观看网站| 久久免费观看电影| 99久久精品国产国产毛片| 欧美日本中文国产一区发布| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 97精品久久久久久久久久精品| 免费高清在线观看日韩| 91在线精品国自产拍蜜月| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 9热在线视频观看99| 少妇高潮的动态图| 天堂8中文在线网| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 青春草国产在线视频| 国产免费福利视频在线观看| 久久午夜福利片| 免费在线观看完整版高清| 精品午夜福利在线看| 18禁动态无遮挡网站| 伊人亚洲综合成人网| 午夜91福利影院| 黄色配什么色好看| 国产av国产精品国产| 蜜桃在线观看..| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜影院在线不卡| 亚洲成国产人片在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 91国产中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 22中文网久久字幕| av线在线观看网站| 99热国产这里只有精品6| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品aⅴ在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 少妇高潮的动态图| 久久韩国三级中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 午夜免费鲁丝| 捣出白浆h1v1| 黄色怎么调成土黄色| a级片在线免费高清观看视频| 一边亲一边摸免费视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲av.av天堂| 免费黄网站久久成人精品| 男人操女人黄网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美精品一区二区大全| 欧美精品亚洲一区二区| 99热全是精品| 男的添女的下面高潮视频| 在现免费观看毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 黑丝袜美女国产一区| 男男h啪啪无遮挡| www.av在线官网国产| 国产成人av激情在线播放| 国产精品国产av在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 另类亚洲欧美激情| www.熟女人妻精品国产 | 观看美女的网站| 熟女av电影| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 人妻 亚洲 视频| 国产成人精品婷婷| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 97在线视频观看| 亚洲三级黄色毛片| xxx大片免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 在线观看三级黄色| 日韩一区二区视频免费看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看人妻少妇| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩电影二区| 激情五月婷婷亚洲| 国产毛片在线视频| 视频中文字幕在线观看| 黄色配什么色好看| 久热这里只有精品99| 中国三级夫妇交换| 免费少妇av软件| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜影院在线不卡| 有码 亚洲区| 精品人妻在线不人妻| 97在线视频观看| av视频免费观看在线观看| 免费av中文字幕在线| 久久久精品免费免费高清| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 91精品三级在线观看| 观看美女的网站| 高清视频免费观看一区二区| 青青草视频在线视频观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 看免费成人av毛片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品久久久久久久电影| 我要看黄色一级片免费的| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 最后的刺客免费高清国语| 香蕉丝袜av| 久久国内精品自在自线图片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av播播在线观看一区| 亚洲成人一二三区av| 男人操女人黄网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲丝袜综合中文字幕| av一本久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人av激情在线播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 美女中出高潮动态图| 亚洲内射少妇av| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线天堂中文资源库| 毛片一级片免费看久久久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩免费高清中文字幕av| 免费观看av网站的网址| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 在线观看免费视频网站a站| 新久久久久国产一级毛片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线精品无人区一区二区三| 日韩av免费高清视频| 韩国精品一区二区三区 | 最近手机中文字幕大全| 尾随美女入室| 97超碰精品成人国产| 久久这里只有精品19| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲精品,欧美精品| 国产成人精品无人区| 久久ye,这里只有精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产av精品麻豆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩一区二区视频免费看| 中国三级夫妇交换| 亚洲精品国产av蜜桃| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国内精品宾馆在线| 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久精品精品| 考比视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品人妻一区二区三区麻豆| 99热国产这里只有精品6| 性色av一级| 亚洲一区二区三区欧美精品| 老司机亚洲免费影院| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲久久久国产精品| 久久久久视频综合| 丁香六月天网| 精品一区在线观看国产| 国产在线免费精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av欧美aⅴ国产| 另类精品久久| 国产成人免费观看mmmm| 成人午夜精彩视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩av久久| 香蕉国产在线看| 亚洲少妇的诱惑av| 精品久久国产蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久久精品免费免费高清| 午夜免费鲁丝| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 97精品久久久久久久久久精品| 免费观看a级毛片全部| 十八禁高潮呻吟视频| 大片电影免费在线观看免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 嫩草影院入口| a级毛片在线看网站| 国产精品蜜桃在线观看| xxx大片免费视频| 亚洲国产精品999| 精品卡一卡二卡四卡免费| 高清黄色对白视频在线免费看| 韩国高清视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 免费看不卡的av| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产一级毛片在线| 日本黄色日本黄色录像| 婷婷色综合www| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩av免费高清视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产在视频线精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 99久久人妻综合| 一边亲一边摸免费视频| 成年人免费黄色播放视频| 高清欧美精品videossex| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产不卡av网站在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 免费观看在线日韩| 亚洲av综合色区一区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产又色又爽无遮挡免| 久久精品国产综合久久久 | 欧美3d第一页| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人一区二区在线| 高清不卡的av网站| 在线看a的网站| 免费看av在线观看网站| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 一级黄片播放器| 五月伊人婷婷丁香| 成年女人在线观看亚洲视频| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品久久久久久久久免| av又黄又爽大尺度在线免费看| 赤兔流量卡办理| 亚洲高清免费不卡视频| 18在线观看网站| 自线自在国产av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲经典国产精华液单| 秋霞在线观看毛片| 美女国产视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 美国免费a级毛片| 大香蕉久久成人网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产亚洲最大av| 欧美日韩综合久久久久久| 一二三四在线观看免费中文在 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av福利一区| 九草在线视频观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲成人手机| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 老女人水多毛片| 中国国产av一级| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 老熟女久久久| 亚洲国产精品一区三区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美另类一区| 亚洲人成77777在线视频| 少妇熟女欧美另类| 日韩三级伦理在线观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99热网站在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲精品456在线播放app| 久久久国产一区二区| videosex国产| 少妇熟女欧美另类| 黑人高潮一二区| 岛国毛片在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 成人国语在线视频| 在线天堂中文资源库| 51国产日韩欧美| 日韩大片免费观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲伊人久久精品综合| 另类亚洲欧美激情| 高清欧美精品videossex| av福利片在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 最近手机中文字幕大全| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久欧美国产精品| 亚洲四区av| 少妇人妻 视频| 人妻一区二区av| 9热在线视频观看99| 亚洲综合色惰| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 女人精品久久久久毛片| 免费看光身美女| 97精品久久久久久久久久精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产乱来视频区| 大片电影免费在线观看免费| 免费高清在线观看日韩| 久热久热在线精品观看| 欧美精品av麻豆av| 在线看a的网站| 日日啪夜夜爽|