原發(fā)性膽汁性膽管炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

徐雅菲， 趙志斌， 廉哲雄

1 華南理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 廣州 510006； 2 廣東省人民醫(yī)院， 廣州 510000

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種由免疫系統(tǒng)對(duì)肝內(nèi)中小膽管上皮細(xì)胞特異性攻擊引起的自身免疫性肝病，多發(fā)于中老年女性，其發(fā)病原因和機(jī)制尚不清楚。通?；颊哐鍖W(xué)特征包括高滴度的抗線粒體抗體(AMA)，高水平的ALT、ALP和高水平的促炎性細(xì)胞因子，如IFNγ、TNFα等。肝臟組織學(xué)特征包括門靜脈區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，早期的膽管周圍肉芽腫形成、肝門靜脈區(qū)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和選擇性中小膽管破壞(也稱為非化膿性破壞性膽管炎)，晚期可發(fā)展為纖維化，最終可能進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，但病情嚴(yán)重程度和時(shí)間進(jìn)展在患者之間差異很大[1]。其中AMA是PBC高度疾病特異性的血清指標(biāo)，90%～95%的PBC患者可測(cè)到AMA陽(yáng)性，對(duì)于PBC的診斷有非常重要的意義，然而AMA滴度與PBC疾病嚴(yán)重程度無關(guān)，其在PBC疾病發(fā)展中的作用尚不清楚[2]。為了加深對(duì)PBC疾病本身的認(rèn)識(shí)，同時(shí)幫助臨床醫(yī)師在探究PBC疾病機(jī)制和尋找新療法的研究中更科學(xué)、合理地選擇工具，本文討論了多種PBC動(dòng)物模型的建模原理和疾病特征。

1 基因編輯小鼠

基因編輯小鼠通過基因編輯技術(shù)對(duì)特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾，引起免疫調(diào)節(jié)缺陷，使其自發(fā)產(chǎn)生類似于PBC的自身免疫反應(yīng)，常用的基因編輯PBC小鼠模型研究進(jìn)展如下。

1.1 TGFβ Ⅱ型受體(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ, dnTGFβRⅡ)小鼠 dnTGFβRⅡ小鼠在CD4啟動(dòng)子的控制下，過表達(dá)顯性失活dnTGFβRⅡ，通過干擾TGFβ和TGFβ Ⅰ、Ⅱ型受體組成的功能信號(hào)復(fù)合體的組裝，特異地阻斷T淋巴細(xì)胞中的TGFβ信號(hào)通路[3]。

該模型模擬了人類PBC疾病早期的關(guān)鍵臨床特征，在PBC免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究中得到廣泛應(yīng)用。血清學(xué)上，dnTGFβRⅡ小鼠自發(fā)產(chǎn)生AMA。22～24周齡時(shí)，分別有100%、95%和68%的小鼠血清顯示抗PDC-E2、OGDC-E2和BCOADC-E2抗體陽(yáng)性。組織病理學(xué)上，肝臟門靜脈區(qū)有中度至重度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，也可見B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞，并且其浸潤(rùn)程度與膽道破壞相關(guān)。此外，小鼠血清中IFNγ、TNFα、IL-6和IL-12p40水平升高，這也與人類PBC血清細(xì)胞因子譜相似。進(jìn)一步過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CD8+T淋巴細(xì)胞是導(dǎo)致dnTGFβRⅡ小鼠PBC樣癥狀的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，而CD4+T淋巴細(xì)胞主要與小鼠并發(fā)的結(jié)腸炎相關(guān)[3]。

最新的研究[4]表明，雌性dnTGFβRⅡ小鼠肝臟中出現(xiàn)更嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，具有更高水平的炎癥因子。該小鼠模型的缺點(diǎn)是門靜脈區(qū)未見明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽腫[5]。另外，小鼠模型中未見循環(huán)IgM的持續(xù)升高，而是出現(xiàn)IgA水平升高[3]。該小鼠主要的并發(fā)癥是3～4月齡出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥性腸病，其胃、十二指腸、胰腺和腎臟中也觀察到輕度單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)[3]。

1.2 腺嘌呤尿嘧啶富集元件(adenylate uridylate-rich element, ARE)-Del-/-小鼠 ARE-Del-/-小鼠，通過缺失IFNγ基因3′端非翻譯區(qū)的ARE而導(dǎo)致IFNγ的慢性持續(xù)表達(dá)[6]。

ARE-Del-/-小鼠發(fā)病具有明顯的性別傾向性，雌性不僅發(fā)病率高于雄性，且疾病嚴(yán)重程度更高。雌性8～10周齡的ARE-Del-/-小鼠血清中可檢測(cè)到高滴度的抗PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的AMA；相比之下，8～10周齡的雄性小鼠僅可檢測(cè)到抗PDC-E2抗體，并且隨年齡增長(zhǎng)而消退，在20周齡時(shí)3個(gè)表位的AMA均不能檢測(cè)到。肝臟病變方面，20周齡的雌性小鼠顯示有中度至重度的門靜脈淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而雄性小鼠僅有輕度至中度浸潤(rùn)。此外，雌性小鼠的門靜脈和小葉炎癥、小膽管破壞和肉芽腫形成更為嚴(yán)重，部分可見輕度纖維化，而在雄性小鼠中纖維化程度較低或檢測(cè)不到。20周齡的雌性ARE-Del-/-小鼠總膽汁酸上調(diào)，其AST和ALT水平均顯著升高。促炎細(xì)胞因子方面，雌性小鼠血清中IFNγ和TNFα水平也更高。此外，過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)表明CD4+T淋巴細(xì)胞是導(dǎo)致肝門靜脈炎癥的主要致病細(xì)胞[7]。

肝臟RNA測(cè)序顯示，雌性小鼠比雄性更富集1型和2型IFN信號(hào)及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)基因，這可能是ARE-Del-/-小鼠表現(xiàn)出雌性傾向的原因[7]。該模型與臨床PBC不同的是檢測(cè)不到ALP，且肝纖維化程度較輕。由于ARE-Del-/-小鼠在4個(gè)月大時(shí)產(chǎn)生抗DNA抗體并表現(xiàn)出腎小球腎炎的特征，它也被作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的動(dòng)物模型[6]。

1.3 NOD.c3c4小鼠 NOD.c3c4小鼠是非肥胖型糖尿病(non obesity diabetic, NOD)模型的同源小鼠，在3號(hào)和4號(hào)染色體上插入B6/B10品系來源的胰島素依賴性糖尿病抗性等位基因[8]。

NOD.c3c4小鼠在9～10周齡時(shí)，有56%自發(fā)產(chǎn)生抗PDC-E2的自身抗體，但隨著年齡的增長(zhǎng)AMA水平下降。值得注意的是，部分小鼠抗PDC-E2自身抗體呈陰性，但可見明顯的組織學(xué)性自身免疫性膽道疾病。病理上，膽道上皮細(xì)胞受累區(qū)域有CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和pDCA1+樹突狀細(xì)胞等浸潤(rùn)，可見破壞性膽管炎。部分小鼠還顯示出其他與人類PBC類似的癥狀，包括嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮樣肉芽腫樣病變和早期肝纖維化。該小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞單獨(dú)均可以致病，說明T淋巴細(xì)胞在疾病過程中的關(guān)鍵作用[8]。

該模型最大的缺點(diǎn)是自身免疫的初始攻擊位置與臨床不同。臨床上PBC發(fā)病起于免疫系統(tǒng)對(duì)肝內(nèi)中小膽管的攻擊，而NOD.c3c4小鼠的初始損傷是由發(fā)生在膽總管界面的免疫反應(yīng)引起的。隨著疾病的進(jìn)展，NOD.c3c4小鼠的病理從膽總管擴(kuò)散到肝內(nèi)膽管，并表現(xiàn)出膽總管炎癥擴(kuò)張和囊性病變。20～30周齡的NOD.c3c4小鼠中發(fā)現(xiàn)明顯的肝臟膽道多囊病[8]。另外，該模型檢測(cè)不到ALP，血清中IgM和IgA均升高，AMA發(fā)生率較低等原因限制了NOD.c3c4小鼠在研究中的應(yīng)用。

1.4 Scurfy小鼠 Scurfy小鼠由于Foxp3基因突變引起Foxp3蛋白的缺失，導(dǎo)致Foxp3+Treg細(xì)胞完全消失，從而打破肝臟免疫耐受[9]。

3～4周齡的Scurfy小鼠血清均可檢測(cè)到高滴度的IgG、IgA和IgM型抗PDC-E2自身抗體。此外，小鼠肝實(shí)質(zhì)和大部分肝門靜脈區(qū)域都有中度到重度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且與膽管損傷密切相關(guān)。該小鼠肝臟部分匯管區(qū)的膽管消失，在肝實(shí)質(zhì)中觀察到不同程度的炎癥壞死變化，并可見中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。小葉間膽管被炎性細(xì)胞包圍，并呈退行性改變。該小鼠模型膽管損傷主要由CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)[9]。另外，Scurfy小鼠血清中炎癥因子TNFα、IFNγ、IL-6、IL-12p40和IL-18水平顯著升高[10]。

Scurfy小鼠的局限性是免疫耐受打破嚴(yán)重，自發(fā)全身性的自身免疫性疾病，且壽命只有4周左右，不利于對(duì)PBC發(fā)病過程及進(jìn)展機(jī)制的探究[10]。

1.5 IL-2Rα (CD25)-/-小鼠 IL-2Rα/CD25可以轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的信號(hào)，并且是Treg細(xì)胞增殖、發(fā)育和活化的關(guān)鍵因子[11]。

IL-2Rα-/-小鼠血清均可檢測(cè)到IgG和IgA型的抗PDC-E2自身抗體。血清中細(xì)胞因子IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12p40水平升高[12]。病理上，肝門靜脈區(qū)有中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致膽管破壞。其浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞主要是CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，CD8+T淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)并從門靜脈區(qū)進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。此外，IL-2Rα-/-小鼠肝臟還有輕度界面肝炎，肝小葉可見少量CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞，少數(shù)情況下中央靜脈附近有明顯浸潤(rùn)。

IL-2Rα-/-小鼠肝臟病理與人類PBC不同的是，沒有肉芽腫或嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。與缺乏IL-2R其他成分的小鼠一樣，該小鼠模型會(huì)發(fā)生嚴(yán)重貧血、淋巴組織增生性自身免疫性疾病和潰瘍性結(jié)腸炎樣疾病[13]，然而與人類結(jié)腸炎相關(guān)的肝膽疾病是原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)，而不是PBC。在IL-2Rα-/-小鼠模型中，CD4+T淋巴細(xì)胞的缺失可抑制其結(jié)腸炎癥，而CD8+T淋巴細(xì)胞的缺失可減輕其膽管損傷和肝門靜脈炎癥[13]。在8～20周齡，大約25%的IL-2Rα-/-小鼠因重度貧血死亡[12]。

1.6 IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠 IL-12p40可調(diào)節(jié)許多T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[14]，而IL-2Rα-/-小鼠模型中觀察到血清IL-12p40水平升高[12]。在IL-2Rα-/-小鼠的基礎(chǔ)上敲除IL-12p40發(fā)現(xiàn)IL-12p40發(fā)揮雙重作用：IL-12p40的缺失一方面抑制了IL-2Rα-/-模型并發(fā)的結(jié)腸炎，另一方面加重了自身免疫性膽管炎，并促進(jìn)其向肝纖維化發(fā)展，由此形成一個(gè)新的PBC小鼠模型[15]。

IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠表現(xiàn)出比IL-2Rα-/-模型更嚴(yán)重的肝門靜脈炎癥和膽管損傷，肝門靜脈區(qū)浸潤(rùn)大量CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，部分小鼠出現(xiàn)門靜脈高壓和肝纖維化。ALT水平顯著高于IL-2Rα-/-模型鼠。并且IL-12p40的缺失導(dǎo)致IFNγ反應(yīng)增強(qiáng)，肝臟中TNFα也上調(diào)[15]。此外，部分小鼠發(fā)生脾腫大[15]，而在PBC患者中，發(fā)生門靜脈高壓癥的患者存在脾腫大現(xiàn)象[16]。相比于IL-2Rα-/-模型，IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠肝臟浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞都增多，其中CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)記憶性細(xì)胞亞群比例增加[15]。CD4抗體治療和CD4缺陷的IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠PBC樣癥狀無緩解，而CD8抗體治療和CD8缺陷的IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠肝臟炎癥被抑制，說明CD8+T淋巴細(xì)胞是該模型鼠的主要致病細(xì)胞[17]?！?/p>

與人類PBC常見的情況相似，IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠并發(fā)干燥綜合征[17]。干燥綜合征是一種以眼睛、口腔和其他黏膜組織過度干燥為特征的自身免疫性疾病。這兩種疾病都由過度活化的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞導(dǎo)致上皮結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷引起，因此被認(rèn)為是具有重疊特征的自身免疫性上皮炎[18]。該模型的另一個(gè)并發(fā)癥是自身免疫性骨髓纖維化，表現(xiàn)出貧血和髓外造血的特征，但臨床PBC患者并沒有這樣的并發(fā)癥[19]。

15月齡的Ae2a,b-/-小鼠中80%自發(fā)地產(chǎn)生了抗PDC-E2的AMA，且血清IgM和IgG水平升高。6月齡的小鼠中檢測(cè)到ALP升高，15月齡時(shí)更高，隨著時(shí)間的推移，它們的免疫反應(yīng)性有增加的趨勢(shì)。大約三分之一的小鼠有廣泛的肝門靜脈炎癥，但程度不一，部分在受損的小葉間膽管周圍可觀察到單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度纖維化，偶爾出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。嚴(yán)重病變的肝臟顯示門靜脈區(qū)有大量CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，且圍繞受損的膽管分布。該模型也有脾腫大現(xiàn)象[23]。

2 誘導(dǎo)小鼠模型

誘導(dǎo)小鼠模型，通過打破對(duì)特異性自身抗原或抗原模擬物的耐受性，來誘導(dǎo)自身免疫性膽管炎。誘導(dǎo)效果受動(dòng)物本身?xiàng)l件、自身抗原或抗原模擬物的性質(zhì)和佐劑等變量影響。

2.1 2-辛炔酸(2OA)-BSA免疫小鼠 研究[24-26]表明AMA能和一些分子模擬物發(fā)生交叉反應(yīng)，其中篩選出了2OA，它能被AMA識(shí)別為一種高活性的半抗原。2OA在自然界中不存在，但這種化合物的甲基和乙基酯廣泛應(yīng)用于香水、口紅、肥皂、洗滌劑、乳霜、乳液和許多常見的食品調(diào)味料[25-27]。由此在C57BL/6小鼠上建立2-辛炔酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin, 2OA-BSA)誘導(dǎo)小鼠模型[28]。

經(jīng)2OA-BSA免疫8周后，100%的小鼠血清出現(xiàn)抗PDC-E2抗體陽(yáng)性。免疫12周后，肝門靜脈中有大量的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，門靜脈區(qū)損傷膽管周圍?？梢娏馨图?xì)胞輕度浸潤(rùn)，以及與臨床PBC相似的導(dǎo)管減少、散在于門靜脈區(qū)和肝實(shí)質(zhì)的上皮樣肉芽腫，肝實(shí)質(zhì)也有小區(qū)域的輕度局灶性壞死現(xiàn)象。免疫4～12周的小鼠血清中均檢測(cè)到TNFα和IFNγ明顯升高。免疫小鼠肝組織中CD4+T淋巴細(xì)胞比例降低，同時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞比例增加，并且CD8+T淋巴細(xì)胞參與了2OA-BSA免疫小鼠膽管炎的免疫發(fā)病機(jī)制[28]。

2OA-BSA誘導(dǎo)小鼠模型的缺點(diǎn)包括檢測(cè)不到膽汁淤積酶和不能進(jìn)展為肝臟纖維化[28]。此外，利用另一種對(duì)膽道疾病易感性更高的小鼠品系NOD.1101小鼠，建立2OA-BSA誘導(dǎo)模型，結(jié)果顯示更嚴(yán)重的PBC樣癥狀。免疫僅2周后，100%的NOD.1101小鼠血清均呈現(xiàn)抗PDC-E2抗體陽(yáng)性。與2OA-BSA免疫的B6小鼠相比，2OA-BSA免疫的NOD.1101小鼠肝門靜脈炎癥中觀察到大量的粒細(xì)胞，與人類PBC早期肝臟的粒細(xì)胞浸潤(rùn)相似[29]。

總的來說，該模型適于用來探究導(dǎo)致肝臟浸潤(rùn)和產(chǎn)生AMA的PBC早期發(fā)病過程，并且疾病表型與所用的動(dòng)物背景和佐劑密切相關(guān)。

2.2 2OA-poly I∶C聯(lián)合免疫小鼠 聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid, poly I∶C)是一種病毒RNA模擬物，通過TLR-3誘導(dǎo)IFNα免疫應(yīng)答[30]。poly I∶C免疫模型誘導(dǎo)8周后，在小鼠肝門靜脈區(qū)觀察到明顯的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫16周后，在80%～100%的poly I∶C注射小鼠血清中檢測(cè)到AMA陽(yáng)性。伴有血清ALT和ALP升高[31-32]。但poly I∶C誘導(dǎo)模型疾病較輕，膽管上皮細(xì)胞未見結(jié)構(gòu)改變[32]，只能模擬早期的PBC癥狀。

在2OA誘導(dǎo)模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用poly I∶C免疫可以誘導(dǎo)更明顯的PBC樣癥狀[33]。雖然小鼠的自身抗體水平與單獨(dú)2OA-BSA免疫模型相似，但在肝臟病理上，poly I∶C聯(lián)用顯著促進(jìn)了2OA免疫小鼠的疾病進(jìn)展，包括淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肉芽腫和膽管損傷。尤其是聯(lián)合免疫小鼠在肝門靜脈區(qū)和肝實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小鼠出現(xiàn)肝纖維化。此外，血清炎性細(xì)胞因子IFNγ、TNFα、IL-12p40和IL-6的水平顯著升高。在poly I∶C單獨(dú)免疫小鼠中肝臟沒有顯示明顯的CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但poly I∶C聯(lián)用使2OA免疫小鼠的肝臟中聚集了更多的效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞，表明poly I∶C不能單獨(dú)誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化，但能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟，這可能是poly I∶C促進(jìn)2OA免疫小鼠PBC疾病進(jìn)展的原因。另外，poly I∶C給藥導(dǎo)致的炎性粒細(xì)胞積累可能加重小鼠局部肝臟炎癥和2OA-BSA誘導(dǎo)的自身免疫性膽管炎[33]。

3 小結(jié)

PBC發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前一般認(rèn)為這種慢性肝病是由基因和環(huán)境誘導(dǎo)因子共同作用導(dǎo)致的，并且大約三分之一的PBC患者會(huì)合并其他自身免疫性疾病[34]。目前僅有熊去氧膽酸和奧貝膽酸兩種對(duì)癥藥物，并且藥物治療只能緩解病情、減慢疾病發(fā)展速度，尚無治愈PBC的方法[35]。因此需要更深入地探究PBC的發(fā)病機(jī)制，加強(qiáng)對(duì)這種疾病的理解，并尋找新的治療靶點(diǎn)。

由于PBC早期臨床組織樣本較難獲得，基于動(dòng)物模型的研究對(duì)于探究PBC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和開發(fā)新的治療方案顯得尤為重要。在對(duì)PBC疾病機(jī)制的探究過程中，有許多動(dòng)物模型起到了重要作用。然而，迄今為止，沒有一個(gè)單一的模型完全模仿人類PBC的所有病理特征。表1列出了不同PBC模型的造模原理、優(yōu)缺點(diǎn)、并發(fā)癥和主要致病細(xì)胞，對(duì)部分模型給出了選擇建議。了解PBC動(dòng)物模型的建模原理和疾病特征，既有利于加深對(duì)PBC疾病特性的認(rèn)識(shí)，也有助于研究者對(duì)研究工具的選擇。

表1 不同PBC模型特點(diǎn)比較

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐雅菲、趙志斌、廉哲雄參與起草和修改文章關(guān)鍵內(nèi)容。