線粒體穩(wěn)態(tài)與血管性癡呆的關(guān)系及中醫(yī)藥干預(yù)作用

秦秀德

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 300150)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指由一系列腦血管因素引起腦損傷所致的癡呆綜合征[1]，是繼阿爾茨海默病后的第2大癡呆性疾病[2]，是迄今為止唯一可以防治的癡呆[3]。每7 s就有1例新發(fā)的癡呆患者。發(fā)達(dá)國(guó)家中65歲以上人群中癡呆患病率約為5%～10%，而VD的患病率約每5年左右就會(huì)加倍[4]。就我國(guó)而言，目前約有740萬(wàn)名老年性癡呆患者，據(jù)估算，如不采取積極措施進(jìn)行有效的干預(yù)，到2030年，這一數(shù)字將會(huì)增長(zhǎng)到1 800萬(wàn)左右[5]。慢性腦低灌注是血管性癡呆的一個(gè)重要原因，然而，血管性癡呆的病理機(jī)制迄今為止仍未完全闡明，目前FDA仍無(wú)批準(zhǔn)用于治療血管性癡呆的藥物[6]。線粒體為機(jī)體產(chǎn)生自由基的源泉，線粒體氧化應(yīng)激與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死密切相關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧時(shí)激活活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，在VD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有中間橋梁作用[7]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦線粒體功能障礙可明顯破壞腦部神經(jīng)細(xì)胞的Ca2+動(dòng)態(tài)平衡，損傷神經(jīng)功能并最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙[8]。深入研究VD發(fā)病的關(guān)機(jī)機(jī)制，對(duì)于新藥研制及指導(dǎo)臨床診療均具有非常重要的意義。中醫(yī)藥長(zhǎng)期用于VD的治療，在VD的治療方面有眾多臨床療效顯著的方藥。因此，本文擬就線粒體穩(wěn)態(tài)與VD的關(guān)系及中醫(yī)藥基于影響線粒體功能而治療VD的機(jī)制研究進(jìn)行論述。

1 血管性癡呆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線粒體穩(wěn)態(tài)的相關(guān)研究

1.1 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬線粒體腫脹

線粒體水腫或腫脹是基于形態(tài)學(xué)方面表明線粒體的功能障礙。姚國(guó)恩等采用改良Pulsinelli's四血管阻斷法建立Wistar大鼠(雌雄不拘)血管性癡呆大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的線粒體腫脹，線粒體嵴紊亂[9]。趙小貞等采用2-VO法制備雌性SD大鼠VD模型，結(jié)果顯示，VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)組織線粒體腫脹、嵴斷裂、模糊或消失,微管斷裂、排列紊亂[10]。劉錫棐等通過(guò)投射電鏡觀察Pulsinelli's四血管阻斷改良法所致VD的SD大鼠(6月齡大鼠,雌雄各半)海馬組織切片，發(fā)現(xiàn)部分神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體明顯水腫[11]。劉錫棐等采用電灼燒針?lè)忾]阻斷SD大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈,雌大鼠摘除左側(cè)卵巢,雄大鼠摘除左側(cè)睪丸,制成血管性癡呆模型大鼠。結(jié)果表明，VD大鼠的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)突起水腫，線粒體固縮，而海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體水腫、嵴斷裂[12]。唐紅梅等采用2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)VD模型大鼠額葉皮層神經(jīng)元線粒體線粒體明顯水腫破裂，線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體部分固縮[13]。

1.2 VD大鼠海馬神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元線粒體膜電位水平下降

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生的關(guān)鍵細(xì)胞器，其正常產(chǎn)能有賴于膜電位的穩(wěn)定。膜電位異常會(huì)影響線粒體進(jìn)行氧化磷酸化，誘發(fā)能量生成障礙[14]。細(xì)胞凋亡常伴有線粒體膜電位的下降，膜電位的下降可能是細(xì)胞凋亡的先兆[15]。趙冉冉等采用2-VO法復(fù)制雄性Wistar大鼠VD模型，對(duì)VD大鼠海馬組織切片超微結(jié)構(gòu)觀測(cè)顯示，海馬組織線粒體腫脹，嵴消失，排列紊亂。進(jìn)一步以JC-1作為線粒體探針，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，VD組大鼠海馬組織中線粒體膜電位與假手術(shù)組相比明顯下降(P<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示，VD組海馬線粒體膜電位與Morris水迷宮5天逃避潛伏期平均值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.693，P=0.001)，與目標(biāo)象限停留時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.598，P=0.001)[16]。

1.3 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬線粒體數(shù)量減少

線粒體輕微受損可由線粒體動(dòng)力學(xué)進(jìn)行對(duì)抗；而損害嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞將啟動(dòng)線粒體自噬機(jī)制整體清除損傷，維持線粒體穩(wěn)態(tài)[17]。線粒體數(shù)量減少是各種損傷影響線粒體穩(wěn)態(tài)進(jìn)而導(dǎo)致線粒體自噬、凋亡最直接的表現(xiàn)形式。趙憲林等采用2-VO方法對(duì)Wistar雄性大鼠制作血管性癡呆模型，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體數(shù)量減少[18]。呂佩源等采用2-VO法制作雄性昆明小鼠VD模型，對(duì)海馬組織進(jìn)行超薄切片，電子投射顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元胞核變化尚輕微時(shí),核周體胞質(zhì)中的多種細(xì)胞器,如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和多聚核糖體就已有不同程度減少,并出現(xiàn)大小不等的空泡。病變嚴(yán)重時(shí),可見(jiàn)殘存的線粒體空泡化或均質(zhì)化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)離散,多聚核糖體消散[19]。

1.4 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬線粒體COX活性下降

細(xì)胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)被公認(rèn)是線粒體的標(biāo)志酶，在線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP中，COX是非常關(guān)鍵得一種酶[20]。COX是神經(jīng)元內(nèi)源性代謝興衰的重要標(biāo)志，神經(jīng)元的功能活動(dòng)與其活性密切相關(guān)。趙晴等的研究表明，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法，制備雄性Wistar大鼠慢性前腦缺血大鼠模型，在造模術(shù)后VD大鼠海馬組織COX活性明顯低于正常大鼠。VD大鼠海馬組織線粒體COXⅡ基因有5處突變，與正常對(duì)照組比，新出現(xiàn)2處突變；VD大鼠海馬組織線粒體COXⅢ基因新出現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)[21-22]。且經(jīng)自由基清除劑依達(dá)拉奉治療后，VD大鼠海馬線粒體COX活性及COXⅡ表達(dá)明顯增加[22]。劉雨霞等采用2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究結(jié)果表明，VD大鼠CytC表達(dá)水平明顯升高[23]。白雪等的研究表明，與模型組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性明顯升高，COXⅡmRNA表達(dá)明顯增加。據(jù)此認(rèn)為祛風(fēng)通竅方對(duì)VD大鼠線粒體功能的保護(hù)作用可能與其改善VD大鼠線粒體COX活性，增加COXⅡmRNA的表達(dá)有關(guān)[24]。

1.5 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Na+-K+-ATP酶活性下降

楊牧祥等采用2-VO雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立雄性昆明小鼠VD模型，發(fā)現(xiàn)模型小鼠海馬組織線粒體局部水腫的嵴的數(shù)量減少，排列比較紊亂，大部分線粒體嵴與膜融合；將腦組織勻漿后用生物化學(xué)法測(cè)ATP酶活力，結(jié)果顯示，腦皮質(zhì)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活力與假手術(shù)組相比明顯降低(P<0.05)[25]。

1.6 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體自噬

線粒體對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，線粒體功能障礙時(shí)，細(xì)胞一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)比例上調(diào)，將激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)通路，誘導(dǎo)自噬小體的生成，導(dǎo)致線粒體清除途徑紊亂[26]。劉斌等采用改良Pulsinelli's四血管阻斷(4-VO)法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究結(jié)果表明，造模后1周時(shí)VD大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)電子密度增加，核膜凹陷，胞核濃縮明顯，可見(jiàn)有少量正常的線粒體及空泡變的線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核周見(jiàn)微空泡形成，多聚核糖體解聚，高度腫脹，細(xì)胞器稀少，出現(xiàn)自噬體，呈圓形，大多位于細(xì)胞核旁，初級(jí)溶酶體數(shù)量增多；在造模4周時(shí)自噬體、溶酶體數(shù)量顯著增多，有時(shí)可見(jiàn)自噬體包裹的線粒體殘?bào)w，并可見(jiàn)到自噬現(xiàn)象的發(fā)生[27]。

1.7 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線粒體氧化應(yīng)激水平增高

1.8 VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線粒體凋亡相關(guān)信號(hào)改變

通過(guò)抑制線粒體氧化應(yīng)激及相關(guān)凋亡信號(hào)通路可以實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[32]。陳天智等通過(guò)2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，VD組海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，而Bax蛋白表達(dá)顯著升高；激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示VD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中CytC與線粒體標(biāo)志性蛋白TOM20的共表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少；p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)基因蛋白于VD造模術(shù)后14、21天的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高。表明血管性癡呆早期神經(jīng)元線粒體產(chǎn)生的損傷可能與PUMA介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)[33]。

表1 血管性癡呆大鼠線粒體改變情況

2 相關(guān)的中醫(yī)藥對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的干預(yù)作用

2.1 減輕線粒體水腫

劉錫棐等的研究表明，補(bǔ)腎活血為主要功效的康欣膠囊可明顯減輕VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體水腫[11]。劉錫棐等的另外一項(xiàng)研究結(jié)果表明，經(jīng)康欣膠囊干預(yù)后，VD大鼠的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)微管螺旋狀排列，線粒體正常；海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體輕度水腫[12]。參芎化瘀膠囊組海馬CA1區(qū)多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞核染色質(zhì)分布比較均勻，與模型組相比，胞質(zhì)內(nèi)線粒體及其他細(xì)胞器基本正常，偶可觀察到少量的染色質(zhì)凝集，線粒體發(fā)生輕度腫脹[34]。唐紅梅等的研究表明，與模型組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組額葉皮層神經(jīng)元細(xì)胞輕微變形，基質(zhì)內(nèi)顆粒減少，線粒體嵴清晰，可見(jiàn)輕微水腫，正常線粒體多見(jiàn);低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞變形得到一定的改善，但仍有大部分線粒體水腫明顯，線粒體固縮變性相對(duì)較少[13]。

2.2 增加線粒體數(shù)量

孔祥怡等采用2-VO法制作Wistar雄性大鼠VD模型(線粒體數(shù)量減少)，采用人參皂苷進(jìn)行治療，結(jié)果表明，VD大鼠經(jīng)干預(yù)1個(gè)月后，神經(jīng)細(xì)胞核染色淺，可見(jiàn)少量異染色質(zhì)位于核膜或散在分布于細(xì)胞核中，線粒體數(shù)量較多、偶見(jiàn)空泡狀；經(jīng)治療3個(gè)月后，神經(jīng)細(xì)胞核染色淺，偶可見(jiàn)異染色質(zhì)，細(xì)胞的核仁清晰，細(xì)胞內(nèi)線粒體較多，偶可見(jiàn)空泡化[35]。睿祺片(藥物組成:首烏、蜂膠、荷葉、珍珠母粉等)可增強(qiáng)原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞線粒體活性,提高線粒體的數(shù)量，并認(rèn)為其在防治血管性癡呆等神經(jīng)退行性疾病方面具有一定的應(yīng)用前景[36]。

2.3 提高ATP酶活力

ATP是腦組織的主要能量來(lái)源。楊牧祥等研究表明，低劑量醒腦啟智組VD小鼠的線粒體局部水腫的嵴的數(shù)量明顯減少，排列較為紊亂，部分的線粒體嵴與膜融合；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見(jiàn)有脫顆?，F(xiàn)象，細(xì)胞間的緊密連接模糊不清，吞飲小泡減少，部分雙層核膜融合消失，部分核間隙擴(kuò)大。高劑量醒腦啟智組的少數(shù)線粒體嵴出現(xiàn)斷裂融合，粗面內(nèi)網(wǎng)形態(tài)正常，無(wú)脫顆粒現(xiàn)象。高劑量醒腦啟智組腦皮質(zhì)細(xì)胞ATP酶活力比其他組明顯升高[25]。

2.4 提高線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶的活力

線粒體呼吸鏈酶容易受到腦缺血的損傷，在2-VO法制作的VD模型大鼠中，線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性較正常組明顯降低，線粒體膜電位發(fā)生去極化，同時(shí)ROS含量升高[37]。腦缺血缺氧可導(dǎo)致CytC從神經(jīng)元的線粒體內(nèi)釋放至細(xì)胞漿中[38]，由此進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡或凋亡[39]。LiH等通過(guò)2-VO法建立VD模型，經(jīng)針灸治療發(fā)現(xiàn)海馬線粒體呼吸復(fù)合酶(復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ)活性和Cyt C氧化酶Ⅳ的表達(dá)顯著增加。此外，針刺治療后線粒體生物能參數(shù)如線粒體呼吸控制率和膜電位PDHA1的表達(dá)明顯改善[37]。Zhang X等應(yīng)用三焦針?lè)ㄖ委煻喙Ｋ佬园V呆(MID)大鼠，其研究結(jié)果表明，針刺治療可改善MID大鼠的呼吸控制水平、磷氧比值及線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶的活性[40]。

2.5 通過(guò)線粒體凋亡通路啟動(dòng)抗凋亡機(jī)制

近年也出現(xiàn)了基于對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)通路調(diào)節(jié)作用抗凋亡的研究。孫邈等采用2-VO法制備雄性SD老年大鼠VD模型，并研究復(fù)智膠囊對(duì)線粒體凋亡通路的影響，其研究表明，較之模型組，復(fù)智膠囊高、低劑量組和安理申組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均得到提升，逃避潛伏期和游泳路程均有縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增多，Cleaved Caspase-3表達(dá)下降，促凋亡基因Bax降低，并且凋亡抑制基因Bcl-2升高，Bcl-2/Bax的比值改變(P<0.05)。由此認(rèn)為復(fù)智膠囊對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能是基于通過(guò)線粒體凋亡通路啟動(dòng)抗凋亡機(jī)制[41]。

2.6 提高線粒體復(fù)合物的活性

謝守嬪等采用2-VO法制備Wistar雌性VD模型，并用中藥復(fù)方歸芪聰志湯進(jìn)行治療。結(jié)果表明，與模型組比較，歸芪聰志湯中劑量組大鼠海馬組織線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量明顯升高，除歸芪聰志湯中劑量組的線粒體復(fù)合物Ⅰ與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義外，其他均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05);歸芪聰志湯中劑量組大鼠大腦皮層其他部位線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ的活性均升高，其中線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，ATP含量均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)[42]。

3 小結(jié)與展望

VD多因心腦血管病變、出血、缺血或缺氧性腦損傷等系列因素導(dǎo)致患者腦組織損害，引發(fā)智力障礙與認(rèn)知障礙綜合征，影響患者的生活質(zhì)量[2,43]，是腦血管病導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要臨床類型[44]。VD發(fā)病率與患者年齡呈正相關(guān)，伴隨人口老齡化的加劇，VD發(fā)病率呈現(xiàn)較快增長(zhǎng)的趨勢(shì)，給家庭及社會(huì)造成較大的負(fù)擔(dān)[45]。我國(guó)血管性癡呆病人數(shù)量較大，防治任務(wù)艱巨[5]。VD的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為缺血性或出血性腦卒中以及各種原因引起的腦缺血缺氧等原因均可導(dǎo)致VD的發(fā)生。由腦缺血缺氧產(chǎn)生的過(guò)量自由基可影響生物體膜磷脂中不飽和脂肪酸含量，從而導(dǎo)致過(guò)氧化及MDA產(chǎn)生，進(jìn)而引起腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，最終導(dǎo)致以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的癡呆的發(fā)生[46]。目前無(wú)論是手術(shù)或是藥物方面都沒(méi)有完全治愈AD的有效方法，而VD是迄今為止唯一可以防治的癡呆，其早期治療具有可逆性[47]。線粒體功能障礙正在成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病病因?qū)W中最新興的病理過(guò)程之一,神經(jīng)退行性疾病的主要病理特征是線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡,保護(hù)線粒體功能已被認(rèn)為是減輕神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制最有效的治療方法[48]?，F(xiàn)代藥理研究表明，中醫(yī)藥治療VD具有一定療效[49],具有多靶點(diǎn)、多途徑治療特征，在VD防治方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，中西醫(yī)聯(lián)合治療VD較單純西醫(yī)治療呈現(xiàn)出更為明顯的優(yōu)勢(shì)[50]。本文通過(guò)系統(tǒng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前中醫(yī)藥基于線粒體保護(hù)方面防治血管性癡呆的機(jī)制包括減輕神經(jīng)元線粒體水腫、增加線粒體數(shù)量、提高ATP酶活力、提高線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶的活力、通過(guò)線粒體凋亡通路啟動(dòng)抗凋亡機(jī)制、提高線粒體復(fù)合物的活性等方面。雖然目前已經(jīng)有一定數(shù)量的研究探索中醫(yī)藥基于線粒體保護(hù)防治VD的機(jī)制，但仍存在一定的問(wèn)題：1)較多的集中在傳統(tǒng)中藥復(fù)方方面的研究，而基于現(xiàn)代中藥新藥創(chuàng)制理論的中藥組分研究及中藥活性單體組分的研究相對(duì)較少；2)目前的研究較多的停留在對(duì)線粒體形態(tài)、線粒體數(shù)量、膜電位等方面的研究，而對(duì)于線粒體穩(wěn)態(tài)的信號(hào)通路的研究相對(duì)較少。建議以后可適當(dāng)基于上述層面或方向進(jìn)行研究，以便篩選出針對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的療效卓著的中藥組分或單體，助推治療血管性癡呆的新藥創(chuàng)制。