人發(fā)角蛋白生物材料的醫(yī)學(xué)應(yīng)用

胡偉 唐紅楓

摘 要 近幾十年來，天然衍生生物材料以其良好的生物功能、結(jié)構(gòu)支撐、良好的生物相容性和良好的生物降解性，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)上，角蛋白是從羊毛、羽毛、角和其他動(dòng)物源中提取的用于工業(yè)用途的，它也被用作生物材料來開發(fā)用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的支架、水凝膠和其他形式。近年來，從人發(fā)中提取的角蛋白作為一種來源于人體的蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、移植后無免疫反應(yīng)、良好的細(xì)胞相互作用活性和生物降解性。近年來，人類毛發(fā)角蛋白提取技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了各種類型的角蛋白生物材料的制備，這些材料已成功的用于組織再生醫(yī)用材料的制備。利用人發(fā)角蛋白為基礎(chǔ)的生物材料來進(jìn)行轉(zhuǎn)化生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，需要更好地了解角蛋白的分子特性和生物學(xué)功能。本文就人發(fā)角蛋白的分子特性、細(xì)胞間的相互作用、各種提取方法以及近年來在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞 人發(fā)角蛋白 生物材料 組織工程

1概述

近十年來，各種生物材料，包括合成聚合物、金屬、生物陶瓷和天然衍生生物材料，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。膠原等天然生物材料因其良好的生物相容性、生物功能性和生物降解性，在臨床應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注。例如，膠原蛋白在臨床上被廣泛用作真皮填充物、牙屏障膜、敷料膜、神經(jīng)導(dǎo)管等，盡管它們與宿主細(xì)胞外基質(zhì)相似，但在還存在很多問題值得研究，天然生物材料在臨床應(yīng)用上的一個(gè)重要問題是體內(nèi)植入后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，包括由于其提取源而引起的過敏反應(yīng)。因此，通過化學(xué)改性來改善生物相容性是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。由于人發(fā)角蛋白是人源性的，具有優(yōu)異的生物相容性，具有細(xì)胞相互作用的位點(diǎn)，并且表現(xiàn)出良好的生物相容性，被認(rèn)為是一種有效的天然來源的降解性生物材料。此外，據(jù)報(bào)道，全球每年約有300000噸毛發(fā)被丟棄，從理發(fā)店、醫(yī)院等廢棄物中提供富含角蛋白的資源。傳統(tǒng)上從動(dòng)物硬組織如羊毛、羽毛和角中提取的9種角蛋白已廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)。但從這些動(dòng)物源中提取角蛋白的強(qiáng)酸強(qiáng)堿等劇烈條件會(huì)在一定程度上破壞角蛋白的三維結(jié)構(gòu)，而在相對(duì)溫和的條件下從人發(fā)中提取角蛋白的最新進(jìn)展，已導(dǎo)致大量角蛋白生物材料的成功應(yīng)用。本報(bào)告綜述了人發(fā)角蛋白的分子特性、各種提取方法以及近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2角蛋白的分子特性

角蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，屬于中空纖維，是橋粒細(xì)胞連接的細(xì)胞骨架成分。角蛋白分為兩類，即Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（堿性）角蛋白。在頭發(fā)、角、羽毛和指甲中發(fā)現(xiàn)的硬角蛋白（5%硫）被分為Ia型（酸性硬蛋白）和IIa型（堿性硬蛋白），而表皮角蛋白如皮膚角質(zhì)層（1%硫）被分為Ib型（酸性軟蛋白）和IIb型（堿性軟蛋白）;分類取決于氨基酸的組成、分布和功能。硬角蛋白和軟角蛋白在螺旋構(gòu)象中具有相似的肽結(jié)構(gòu)，但它們的氨基酸組成不同，一般來說，硬角蛋白以其高半胱氨酸含量、低甘氨酸含量和具有結(jié)構(gòu)耐久性和強(qiáng)度而區(qū)別，而軟角蛋白則相反。關(guān)于二級(jí)結(jié)構(gòu)，角蛋白可進(jìn)一步分為兩類：具有 螺旋結(jié)構(gòu)的 角蛋白和具有 折疊片層結(jié)構(gòu)的 角蛋白。人發(fā)角蛋白分為硬角蛋白，由65-96%的蛋白質(zhì)、1-9%的脂質(zhì)、3%的黑色素和少量化合物組成，主要取決于水分含量。人的頭發(fā)纖維包含三個(gè)不同的部分：角質(zhì)層、皮層和髓質(zhì)。角質(zhì)層是頭發(fā)纖維的外層，主要由5-12層 角蛋白組成，起保護(hù)內(nèi)層和保持水分的作用;皮層是一束蛋白質(zhì)鏈，主要由 角蛋白（50-60%）、 角蛋白（20-30%）和黑色素顆粒組成，人發(fā)角蛋白存在于皮質(zhì)內(nèi)，占整個(gè)頭發(fā)總質(zhì)量的70-95%;髓質(zhì)是位于毛發(fā)纖維中心的柔軟疏松的軸向細(xì)胞。存在于皮質(zhì)層的 角蛋白，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，在生物醫(yī)學(xué)工程中得到了廣泛的應(yīng)用。在人發(fā)中， 角蛋白的兩個(gè)亞型，Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（堿性）角蛋白相互作用，形成左手異二聚體螺旋。然后兩個(gè)二聚體反平行結(jié)合形成右手四聚體，這個(gè)過程持續(xù)進(jìn)行，直到隨后聚合成10納米長(zhǎng)的螺旋狀中間絲。在卷繞線圈中間長(zhǎng)絲形成過程中，在形成二聚體、四聚體、八聚體等的各個(gè)階段都會(huì)改變螺旋方向。最后， 角蛋白的超薄結(jié)構(gòu)纖維的形成由數(shù)千束微纖維完成（圖1）。 角蛋白單體的分子量為40-50 kDa（I型）和50-60 kDa（II型）。在頭發(fā)中發(fā)現(xiàn)的 角蛋白，也稱為基質(zhì)蛋白或角蛋白相關(guān)蛋白（KAPs），是一種分子量為10-25kda的高硫 角蛋白，作為粘合材料將細(xì)絲結(jié)合在一起并維持頭發(fā)纖維的結(jié)構(gòu)。

3角蛋白的生物學(xué)特性

毛發(fā)角蛋白是在毛發(fā)發(fā)育周期中形成于上皮卵泡細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白，包括生長(zhǎng)期（生長(zhǎng)期）、增殖期（生長(zhǎng)期）和休止期（休止期）。表皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他信號(hào)分子等化學(xué)信號(hào)參與了各個(gè)階段的調(diào)節(jié)。生長(zhǎng)是毛囊周期的第一階段，BMP信號(hào)已經(jīng)被證明是在此階段參與毛囊分化。毛囊細(xì)胞在生長(zhǎng)期角質(zhì)化，角質(zhì)單體聚合成中間絲，完全角化的細(xì)胞最終通過凋亡而死亡，包括中間絲在內(nèi)的內(nèi)部細(xì)胞器被排出體外。由內(nèi)根鞘（IRS）和外根鞘（ORS）覆蓋的發(fā)干（HS）變得密集地充滿角蛋白絲。發(fā)干中的角蛋白從頭皮中出來并暴露于空氣中，導(dǎo)致角蛋白的氧化，最終形成細(xì)長(zhǎng)的纖維結(jié)構(gòu)。生長(zhǎng)期過后，來到了動(dòng)態(tài)過渡期，在此期間，頭發(fā)生長(zhǎng)結(jié)束，毛囊進(jìn)入休息期，導(dǎo)致脫發(fā)，然后開始一個(gè)新的周期。角蛋白的主要功能之一是保護(hù)上皮細(xì)胞免受物理?yè)p傷和非物理應(yīng)激，但最近有報(bào)道稱，角蛋白也具有其他細(xì)胞蛋白功能的調(diào)節(jié)，包括參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及應(yīng)激相關(guān)機(jī)制。頭發(fā)中的角蛋白形成了細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架中間絲，對(duì)于細(xì)胞起到支撐作用，然而人發(fā)中角蛋白的除結(jié)構(gòu)支撐以外其他的生物學(xué)功能尚未得到很好的闡明。最近報(bào)道，角蛋白分子由約400～600個(gè)氨基酸組成，含有多種細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，如LDV（LU-ASP-VALL）和RGD（ARG-GLY ASP）。例如，毛發(fā)角蛋白被用作細(xì)胞培養(yǎng)的涂層材料時(shí)，支持細(xì)胞粘附和提高細(xì)胞增殖。據(jù)報(bào)道， 4 1整合素家族在細(xì)胞中識(shí)別出含有類似細(xì)胞粘附基序的角蛋白基質(zhì)，在人發(fā)角蛋白膜上培養(yǎng)的細(xì)胞中觀察到發(fā)育良好的 1整合素表達(dá)（圖2）。角蛋白作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，具有支持細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞間基質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能，已成為許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的潛在生物材料。然而，細(xì)胞與角蛋白基生物材料相互作用的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4人發(fā)角蛋白提取方法

傳統(tǒng)方法是從動(dòng)物源（如羊毛、角和頭發(fā)）中提取角蛋白，對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行稍加改進(jìn)的方法可以用來從人類頭發(fā)中提取角蛋白。頭發(fā)中的硬角蛋白由于其角蛋白分子和疏水氨基酸中胱氨酸殘基中的二硫鍵含量高而高度不溶，因此頭發(fā)中硬角蛋白的提取需要苛刻的條件和進(jìn)一步的修飾以穩(wěn)定角蛋白分子，其中首要問題就是能夠在不破壞肽鍵的情況下使二硫鍵斷裂，從而從頭發(fā)中提取角蛋白。如圖3所示，頭發(fā)角蛋白的提取過程包括四個(gè)步驟，包括去甲?；⒃鋈?、透析和冷凍干燥。在提取過程中， 角蛋白主要從皮質(zhì)層中提取，并通過離心去除嵌入表皮層中的不溶性 角蛋白。為了有效地從人發(fā)中提取角蛋白，許多研究人員開發(fā)了多種技術(shù)，使用各種試劑的混合物以及熱、機(jī)械力和水解緩沖液的組合。這些過程是基于氧化還原化學(xué)反應(yīng)來打破硬角蛋白中的二硫鍵和增加角蛋白溶解度的試劑。對(duì)于這些提取條件的總結(jié)（見表1）。在基于還原法的角蛋白提取中，角蛋白分子中的二硫橋很容易被打破，并通過堿性水解還原為巰基，生成角蛋白的還原形式角朊酸。角質(zhì)層是保護(hù)頭發(fā)內(nèi)蛋白質(zhì)的多層膜，在堿性狀態(tài)下容易抬升，在pH值為10到13的高堿性條件下，NH3+和COO-基團(tuán)之間的離子相互作用首先減弱，導(dǎo)致二硫鍵斷裂，角蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，還原劑更容易接觸到角蛋白。 近年來最廣泛使用的試劑之一是由Nakamura等人建立的Shindai溶液，它由25 M M Tris HCl、2.6 M硫脲、5 M尿素和5%（v/v）2-巰基乙醇組成。尿素和硫脲主要作用是使頭發(fā)纖維中氫鍵斷裂，并最終促進(jìn)還原劑容易地與角蛋白分子的二硫鍵結(jié)合。加入2-巰基乙醇，通過其硫代陰離子的反應(yīng)來破壞二硫鍵，加入三鹽酸，以調(diào)節(jié)到最佳的pH環(huán)境。一般來說，在氫氧根離子存在下，二硫鍵很容易在高pH下水解，但在pH 10以上的堿性條件會(huì)引起肽鏈的破壞。

5人發(fā)角蛋白生物材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

利用天然衍生的生物材料，如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、明膠、海藻酸鈉和殼聚糖，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)材料的開發(fā)中進(jìn)行廣泛的研究。近年來，人發(fā)角蛋白因其良好的生物相容性、生物降解性以及細(xì)胞整合素與角蛋白分子內(nèi)特定氨基酸序列之間良好的細(xì)胞相互作用而受到生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。角蛋白在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中最顯著的優(yōu)點(diǎn)之一是它可以從人的頭發(fā)等來源中提取，植入后可能引起非常低的免疫反應(yīng)。角蛋白已經(jīng)被制備成各種生物材料支架，如薄膜和水凝膠;其他支架可以通過角蛋白和聚合物的混合來制備?；诮堑鞍椎纳锊牧弦驯挥糜诙喾N生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括用于周圍神經(jīng)再生的神經(jīng)導(dǎo)管填料、用于傷口愈合的水凝膠或薄膜、止血?jiǎng)┖陀糜诮M織再生的其他形式。人發(fā)角蛋白由于其高半胱氨酸殘基含量，具有自發(fā)的自組裝和聚合特性，可以制備各種生物材料，如薄膜、水凝膠和大孔支架，其良好的細(xì)胞相互作用和生物相容性，特別是人發(fā)角蛋白由于基于人源蛋白質(zhì)，所以具有低免疫原性，使其在再生醫(yī)學(xué)上將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。人發(fā)角蛋白的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的深度和廣度，一方面是要設(shè)計(jì)促進(jìn)組織再生的功能性生物材料，需要進(jìn)一步研究其與細(xì)胞間的相互作用;另一方面是要研究控制和增強(qiáng)人發(fā)角蛋白為基礎(chǔ)的生物材料的機(jī)械強(qiáng)度，使其能在硬組織再生中得到應(yīng)用。隨著有效提取角蛋白方法效率的進(jìn)一步提高，能夠開發(fā)出適合于更多特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用場(chǎng)景，具有適當(dāng)生物相容性和機(jī)械特性的角蛋白基生物材料，使角蛋白生物材料的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景更加廣闊。

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