基于適配體的生物膜干涉檢測重組人促紅細(xì)胞生成素α新方法

賀小琴 羅黎 郭磊 謝劍煒

摘?要?采用生物膜干涉（BLI）表面敏感光譜技術(shù)，建立了一種基于鏈DNA適配體39 nt的傳感分析方法，實現(xiàn)了重組人促紅細(xì)胞生成素α（EPO-α）的靈敏檢測。將生物素化的39 nt固定于鏈霉親和素傳感芯片上，經(jīng)2200 r/min高速振蕩實現(xiàn)微升體積分析物的快速擴(kuò)散。對適配體39 nt的取向、在BLI傳感芯片上的固定濃度和非特異性吸附等影響因素進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)50 nmol/L 3末端生物素化39 nt具有最佳響應(yīng)信號;加入Tween 20和牛血清白蛋白（BSA）可有效克服非特異吸附?；邴溑吣貥?gòu)建了夾心法信號放大體系，在Tris-TB生理緩沖溶液中，檢測EPO-α的線性范圍為10～200 nmol/L，檢出限為5 nmol/L。應(yīng)用于人血漿等復(fù)雜基質(zhì)中的EPO-α檢測，回收率為86.7%～104.2%，RSD<11%，結(jié)果令人滿意。此BLI傳感體系為免標(biāo)記蛋白相互作用和復(fù)雜生物樣品檢測等實際應(yīng)用提供了有益參考。

關(guān)鍵詞?適配體;重組人促紅細(xì)胞生成素;生物膜干涉;麥胚凝集素;信號放大

1?引 言

核酸適配體能夠形成特定的空間結(jié)構(gòu)，與靶分子通過空間互補(bǔ)發(fā)生特異性結(jié)合。其結(jié)合特性與抗體性質(zhì)類似，因此，適配體又被稱為“化學(xué)抗體”。適配體也是一類優(yōu)良的分析傳感元件，除直接利用其與靶蛋白間的高親和力、高特異性結(jié)合特性外，還可利用適配體的修飾、標(biāo)記、與互補(bǔ)序列形成競爭、與納米器件的良好相容性等性能，發(fā)展各種分析檢測和傳感方法[1]。

生物膜干涉技術(shù)（Biolayer interferometry，BLI）是新興的生物傳感手段之一[2]，其檢測原理是光通過傳感芯片的生物膜層后發(fā)生透射與反射，反射光的頻率與生物膜層厚度有關(guān)。一些頻率的反射光與入射光發(fā)生相長干涉，而另一些發(fā)生相消干涉，從而形成干涉光譜。BLI技術(shù)通過檢測干涉光譜的相對位移變化，反映傳感芯片表面生物膜的厚度。當(dāng)固定于生物膜表面上的配體與溶液中的分析物結(jié)合后，生物膜層厚度增加，產(chǎn)生相對位移，隨著分析物結(jié)合量的增加而增大，最后可達(dá)到平衡，據(jù)此進(jìn)行定量分析。因此，BLI是一種表面敏感的光譜技術(shù)，具有免標(biāo)記、實時、可提供分子相互作用特征信息以及簡單易用等優(yōu)點。目前，已有使用BLI技術(shù)的基于適配體的傳感方法的報道，包括適配體結(jié)合/競爭法檢測生物毒素：膝溝藻毒素[3]、石芳蛤毒素[4]、海葵毒素[5]，DNA四面體結(jié)合適配體檢測三磷酸腺苷[6]，適配體-抗體夾心檢測癌胚抗原125[7]，以及酶聯(lián)適配體吸附分析血小板衍生生長因子-BB[8]等。檢測靈敏度多處于nmol/L或亞nmol/L水平，但多數(shù)尚未應(yīng)用于實際樣品測定中。BLI是通過干涉光譜的位移變化，反映傳感膜表面的厚度及密度變化，通常響應(yīng)信號較低，常需進(jìn)行信號放大。

2019年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予了在細(xì)胞低氧感知與適應(yīng)機(jī)制方面做出突出貢獻(xiàn)的科學(xué)家，促紅細(xì)胞生成素（EPO）即是該機(jī)制中的關(guān)鍵分子之一，作為重要的造血因子，其主要生理功能是促進(jìn)紅細(xì)胞增殖和分化，改善機(jī)體的攜氧能力和增強(qiáng)耐力。在本研究組的前期工作中，針對重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO-α），發(fā)展了凝集素導(dǎo)向的親和層析SELEX技術(shù)，成功篩選到了新型單鏈DNA（ssDNA）適配體序列807-39 nt（以下簡稱39 nt）[9]，并結(jié)合適配體后篩選技術(shù)[10]，明確了39 nt及其最短親和性序列的高級結(jié)構(gòu)特征[11]，為分析、傳感、診斷等應(yīng)用領(lǐng)域提供了一類作用特點清晰的適配體元件。本研究建立了以適配體39 nt為分析傳感元件的BLI新方法，將生物素化的適配體固定于鏈霉親和素（SA）傳感芯片上，考察了適配體的親和性發(fā)揮，特別是研究了適配體元件的取向、固定濃度等關(guān)鍵因素的影響，成功構(gòu)建了基于麥胚凝集素（WGA）夾心法的信號放大策略，實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)人血漿的中EPO-α的靈敏、準(zhǔn)確檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

BLITZ單樣本分子相互作用分析儀（美國ForteBio公司），SA傳感芯片（ForteBio公司）。SA傳感芯片為即插即用式，裝載固定于分析儀機(jī)身上方正中;分析儀機(jī)身下部是不同尺寸的樣品池，使用時按需手動平移對準(zhǔn)至芯片正下方。所有核酸適配體序列的變性、復(fù)性步驟于PCR儀（德國Eppendorf公司）上完成，均為95℃變性5 min，然后以1℃/min緩慢降至室溫。

所有寡核苷酸序列均為上海生工生物技術(shù)公司合成，39 nt的序列為GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA;EPO-α（3.25 mg/mL，純度>98.5%，深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司）;WGA、吐溫20（Tween 20）、人IgG、刀豆凝集素（美國Sigma-Aldrich公司）。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、HCl、NaCl、KCl、MgCl2、牛血清白蛋白（BSA）、鐵蛋白（國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司）。人空白血漿由解放軍第五醫(yī)學(xué)中心提供。所用試劑至少為分析純。實驗前，所有的緩沖液經(jīng)0.22 μm微孔水相濾膜（天津津騰公司）過濾并超聲脫氣。實驗用水為Milli-Q A10超純水儀（美國Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。所有溶液使用之前，均經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理。

2.2?實驗方法

SA傳感芯片在Tris-TB緩沖液（即20 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L MgCl2、0.05%（V/V）Tween-20、 5 μmol/L BSA，以HCl調(diào)節(jié)至pH 7.4～7.6）中浸泡10 min后（“水化”），依次裝入到不同尺寸的樣品池中（200 μL黑色離心管用于采集基線或樣品的解離曲線、4 μL石英樣品池用于采集樣品的結(jié)合曲線），以實現(xiàn)上樣、結(jié)合、解離和再生，溫度25℃，振蕩速率2200 r/min。SA芯片每日使用后吹干保存，次日經(jīng)過水化處理后，即可繼續(xù)使用。

檢測EPO-α蛋白時，在固定了3-Bio-39 nt的SA傳感芯片上，分別以含0、1、2、5、10、20、50、100、200、500和1000 nmol/L EPO-α的Tris-TB溶液作為分析物，結(jié)合時間均為300 s，解離300 s。或上述分析物的結(jié)合時間均為300 s，解離30 s，之后分別進(jìn)樣1 μmol/L WGA（溶于Tris-TB緩沖液），結(jié)合時間為180 s，解離240 s。50%人血漿樣品由EPO-α的Tris-TB溶液與人血漿以1∶1（V/V）混合配制得到。響應(yīng)曲線通過單個傳感芯片自身扣減溶液空白得到，以去除或降低非特異性結(jié)合以及緩沖液自身產(chǎn)生的干涉光譜偏移。數(shù)據(jù)采集及擬合使用BLItz Pro1.2軟件（美國ForteBio公司），擬合采用線性（定量曲線）或非線性擬合模型（1∶1結(jié)合，濃度滴定曲線）。

3?結(jié)果與討論

3.1?BLI工作體系的構(gòu)建

BLI技術(shù)是一種新型的即插即讀式傳感技術(shù)，可以實現(xiàn)單通道或多通道的同時分析。本研究采用了小型、單通道的BLITZ，其核心部件是振蕩式平板（振蕩頻率通常在1000～2200 r/min之間）及光纖式傳感芯片，樣品處于敞開式樣品池中，最低樣品體積僅需要4 μL。與表面等離子體共振（SPR）技術(shù)相比，BLI無需與微流控系統(tǒng)相連，不受分子的物質(zhì)遷移效應(yīng)等影響，而是通過高速振蕩微小體積樣品，達(dá)到分析物在傳感膜表面快速擴(kuò)散的目的。因此，對于樣品前處理要求較低，可直接針對細(xì)胞粗提液和血漿等進(jìn)行分析。其不足之處在于相互作用分子固定在芯片上時，其結(jié)合性易受標(biāo)記及固定策略的影響。

本研究中，適配體39 nt經(jīng)單分子生物素化修飾[10]后，固定于SA傳感芯片表面，引入WGA信號放大策略，構(gòu)建了一種穩(wěn)定、簡便、靈敏的BLI分子互作體系，實現(xiàn)了EPO-α蛋白的靈敏檢測，并用于人血漿實際樣品的檢測（圖1）。

3.2?生物素化適配體的固定

3.2.1?生物素化適配體的空間取向?適配體分子的親和性與其堿基排布和形成的空間結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。前期工作表明，基于ssDNA適配體 39 nt結(jié)構(gòu)所發(fā)展的向左縮進(jìn)（即去除3-末端堿基）分子群和向右縮進(jìn)（即去除5-末端堿基）分子群，對EPO-α表現(xiàn)出不同的親和特性。多種分析方法的結(jié)果表明，39 nt與EPO-α結(jié)合時，其解離常數(shù)（KD）在30～90 nmol/L范圍（凝膠遷移率變動分析，KD=（39±27） nmol/L[9];親和毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法，KD=（86±13） nmol/L[12];SPR，KD=（54±2） nmol/L[10]）。

但是，序列39 nt向左縮進(jìn)，去除3-末端2、4、6個堿基時，對親和力影響不明顯（KD值上升至320～390 nmol/L），說明此段堿基主要起支撐作用;而向右縮進(jìn)，去除5-末端2、4個堿基后，對親和力影響顯著（KD值上升至560～1300 nmol/L）;但去除5-末端6、8個堿基后，親和力又隨之基本恢復(fù)（KD值下降至130～140 nmol/L）[10]，說明此段堿基除具有支撐作用外，還具有掩蔽鄰近關(guān)鍵堿基的作用。因此，首先考察了39 nt的5-末端或3-末端偶聯(lián)上生物素后，對EPO-α蛋白檢測的影響。

實驗結(jié)果表明，50 nmol/L 3-末端生物素化39 nt（3-Bio-39 nt）和5-末端生物素化39 nt（5-Bio-39 nt）在SA芯片上固定300 s后，生物膜上結(jié)合響應(yīng)值分別增加了1.30和1.50 nm，說明兩種生物素化的適配體在SA上固定的數(shù)量較為接近。但是，當(dāng)以500 nmol/L EPO-α蛋白為分析物，3-Bio-39 nt為固定分子時，EPO-α的結(jié)合使結(jié)合響應(yīng)值繼續(xù)升高0.33 nm，顯著高于5-Bio-39 nt為固定分子的0.14 nm（圖2）。說明39 nt的3-末端生物素化時，很好地利用到了該末端堿基僅起支撐作用的特點，將參與識別的關(guān)鍵堿基位點等盡量暴露于EPO-α蛋白，從而獲得較高靈敏度。

3.2.2?用于固定的適配體濃度?在表面?zhèn)鞲屑夹g(shù)中，傳感芯片表面配體分子的密度非常重要。固定配體密度過低，配體不能完全發(fā)揮親和性;密度過高，則可能導(dǎo)致舞蹈效應(yīng)（同一分析物連續(xù)作用于不同配體分子）、空間位阻效應(yīng)，反而使配體-分析物間的結(jié)合降低[13]。因此，用于固定的適配體39 nt的濃度是關(guān)鍵實驗參數(shù)之一。

如圖3A所示，隨著適配體濃度（25～500 nmol/L）增加，SA芯片上固定的3-Bio-39 nt數(shù)量增加，密度增大，響應(yīng)信號逐漸增加。但是，對于分析物EPO-α蛋白（500 nmol/L），較低濃度適配體（50 和25 nmol/L）反而有高的結(jié)合響應(yīng)值（圖3B）。說明此時適配體之間存在合適的固定間距，有利于其對靶分子親和識別。因此，選用具有最高結(jié)合響應(yīng)值的50 nmol/L 3-Bio-39 nt，用于SA芯片固定。

3.3?EPO-α檢測條件的優(yōu)化

在緩沖溶液中加入了非離子型表面活性劑Tween 20，較好地減弱了分析物EPO-α蛋白和SA蛋白間的非特異吸附作用。實驗結(jié)果表明，加入0.01%～0.05%（V/V）Tween 20后，響應(yīng)信號增加了15%;再加入常用封閉劑BSA（0.1～50 μmol/L），特別是BSA濃度大于5 μmol/L時，響應(yīng)信號可提升50%。

傳感芯片的再生性能對于單通道多次連續(xù)測定非常重要。NaOH溶液是針對適配體-靶蛋白相互作用進(jìn)行再生時的較優(yōu)選擇。

考察了不同濃度NaOH的再生效果（圖4）。由進(jìn)樣前后基線響應(yīng)變化可知，當(dāng)NaOH濃度分別為0.1、0.05和0.02 mmol/L時，每次再生后，基線稍下降約0.02 nm。但在有限再生次數(shù)（≤10次）時，500 nmol/L EPO-α的結(jié)合響應(yīng)值仍基本一致。因此，在體系再生時，根據(jù)所結(jié)合的分析物在洗脫后是否回歸基線的原則選擇再生次數(shù)。對于濃度小于200 nmol/L的低濃度分析物，再生條件選用0.02 mmol/L NaOH處理2～3次，每次5 s;對于濃度大于200 nmol/L的較高濃度分析物，再生條件選用 0.1 mmol/L NaOH處理2～3次，每次5 s。這也體現(xiàn)了單通道BLI技術(shù)工作環(huán)境敞開、方便、易控的優(yōu)點。

3.4?基于適配體39 nt的信號放大型檢測EPO-α

基于上述的優(yōu)化條件，僅以固定的3-Bio-39 nt為親和分子時，最低可檢測到12.5 nmol/L EPO-α，但在12.5～50.0 nmol/L范圍時并不呈線性響應(yīng)，原因可能在于EPO-α蛋白屬于較低分子量的蛋白（分子量34 kDa），其結(jié)合導(dǎo)致的生物膜厚度增加并不明顯[2，14]?？紤]到BLI檢測信號與生物膜表面結(jié)合的分子數(shù)量和質(zhì)量直接相關(guān)，本研究引入WGA為信號放大分子，以進(jìn)一步提高EPO-α蛋白的響應(yīng)。

WGA為同型二聚體糖蛋白，分子量36 kDa，每個亞單位存在兩個N-乙酰氨基葡萄糖（GlaNAc）結(jié)合位點[15]。本研究組前期的工作[10]表明，WGA與適配體在EPO-α上具有不同的結(jié)合位點，WGA與適配體可與酸性糖蛋白EPO-α形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。由圖5可見，隨著WGA濃度增加，對于相同濃度的EPO-α（500 nmol/L），第二級響應(yīng)信號的放大作用較為明顯;WGA的濃度高于200 nmol/L時，EPO-α 檢測信號顯著增強(qiáng)。選用1 μmol/L WGA進(jìn)行信號放大，實現(xiàn)了EPO-α的靈敏檢測，線性方程為y=0.002x-0.025（R2=0.980），線性范圍為10～200 nmol/L，檢出限（S/N=3）為5 nmol/L。

本方法中，低（20 nmol/L）、中（100 nmol/L）、高（200 nmol/L）濃度的EPO-α的日間精密度（n=5）分別為8.2%、12.7%和9.4%。100 nmol/L EPO-α和10倍濃度的常見蛋白（如人IgG、刀豆凝集素、鐵蛋白）共存時，回收率分別為86.5%±8.5%、96.1%±3.5%和95.7%±1.3%，說明常見蛋白對本方法沒有明顯干擾。針對50%人血漿實際樣品，用本方法進(jìn)行了測定，加標(biāo)回收率均在86.7%～104.2%之間（表1），RSD<11%，說明本方法可用于血漿等復(fù)雜基質(zhì)中EPO-α的準(zhǔn)確測定。血漿稀釋1倍后即可直接檢測，方法簡便，抗干擾能力強(qiáng)。

4?結(jié) 論

建立了基于適配體的BLI方法，實現(xiàn)了EPO-α的靈敏檢測。優(yōu)化了SA傳感芯片表面固定的生物素化適配體元件的取向和濃度，利用WGA和適配體39 nt作用于EPO-α的不同位點的特性，成功構(gòu)建了BLI信號放大傳感體系，用于EPO-α的檢測，檢出限為5 nmol/L。此BLI傳感體系的開發(fā)，為適配體與靶分子間相互作用研究提供了參考。借助于其它更高質(zhì)量的信號放大分子（如EPO抗體）、納米器件（如WGA或EPO抗體標(biāo)記的金納米粒子等）或酶催化方法體系，可望實現(xiàn)更為靈敏的檢測，拓展本體系的實用價值。

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