• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    毛細(xì)管電泳法研究核酸庫容量對蛋白質(zhì)適配體篩選的影響

    2020-05-11 05:56李林森朱超趙毅楊歌屈鋒
    分析化學(xué) 2020年5期

    李林森 朱超 趙毅 楊歌 屈鋒

    摘?要?毛細(xì)管電泳(CE)具有高分辨、快速分離、樣品用量小和無需固相介質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),是高效篩選核酸適配體的方法之一。然而,由于CE的進(jìn)樣量少,有限的核酸庫容量是否影響毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(CE-SELEX)適配體的篩選效率,尚不明確。本研究以神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)為模式蛋白,考察了CE篩選中核酸庫容量對篩選效率的影響,以明確CE-SELEX方法的有效性。分別使用4個濃度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸庫進(jìn)行適配體篩選,比較了初始庫與經(jīng)3輪篩選后的次級核酸庫的親和力。結(jié)果表明,4個核酸庫篩選輪次間庫親和力相近,且經(jīng)2輪篩選后均得到了微摩爾級別的核酸適配體。此外,用高濃度核酸庫篩選獲得的序列更具多樣性,但未能提升候選序列親和力。經(jīng)2輪篩選得到NSE的核酸適配體Seq qN-01,其與NSE復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)為(4.72±0.15) μmol/L,并表現(xiàn)出很好的特異性。綜上,核酸庫容量會提高后續(xù)富集庫的序列多樣性,但對適配體篩選效率沒有顯著影響。

    關(guān)鍵詞?神經(jīng)元特異性烯醇化酶;核酸庫容量;核酸適配體篩選;毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化

    1?引 言

    核酸適配體(Aptamer),又被稱為“化學(xué)抗體”,是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)體外篩選獲得的寡核苷酸序列(單鏈DNA/ssDNA或RNA)。核酸適配體作為新型識別分子,不僅具有性質(zhì)穩(wěn)定、易合成和化學(xué)修飾、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),而且其識別的靶標(biāo)廣泛,包括金屬離子、有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物、病毒等[1,2]。自1990年SELEX和Aptamer概念被提出以來[3,4],核酸適配體已成為生物傳感、環(huán)境分析、疾病診斷、藥物遞送及醫(yī)學(xué)影像等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5~9]。近三十年來,已有超過2700種核酸適配體被報道,但很多核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用時的分子識別效果不佳,因而,核酸適配體的高效及有效篩選仍是影響其實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一[10~12]。目前,用于核酸適配體篩選的SELEX技術(shù)多達(dá)三十余種,多數(shù)SELEX技術(shù)需要8~15輪篩選,通常需要4~6周甚至數(shù)月之久,大大降低了核酸適配體的篩選效率;同時,多數(shù)SELEX技術(shù)在分離過程中引入介質(zhì)(磁珠、芯片等),也會造成核酸適配體的特異性缺失[11,13,14]。毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)作為一種高分辨快速分離技術(shù),可在溶液中分離和檢測核酸庫和靶標(biāo)-核酸復(fù)合物,篩選過程中無需固定靶標(biāo)或核酸庫,可大大縮短篩選周期,通常僅需1~4輪即可獲得適配體。此外,CE還可用于篩選過程中蛋白與核酸相互作用表征,次級核酸庫的親和力評價等[15~19]。常規(guī)的SELEX篩選使用的核酸庫容量約為1016個ssDNA序列,CE篩選時樣品用量少,所用的核酸庫容量約為1012個ssDNA序列[20,21]。有限的核酸庫容量是否會影響適配體的篩選效率是CE-SELEX的一個存疑點(diǎn)。

    神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是糖酵解烯醇化酶的細(xì)胞特異性同工酶,廣泛分布于神經(jīng)元和外周神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,是目前小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后和后續(xù)治療中最可靠的腫瘤標(biāo)志物之一[22~24]。本研究以NSE為靶蛋白,建立了基于CE的NSE核酸適配體篩選方法,采用4個不同數(shù)量級濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L ssDNA庫)改變庫容量,以此研究核酸庫容量對適配體篩選效率的影響。經(jīng)過2輪CE篩選,優(yōu)選了NSE的核酸適配體Seq qN-01,其復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)為(4.72±0.15) μmol/L,并利用CE-LIF法驗證了其特異性,該適配體有望用于NSE的相關(guān)分析檢測。研究結(jié)果表明,從4個不同數(shù)量級濃度的初始核酸庫篩選的適配體序列與NSE的親和力相當(dāng),說明CE-SELEX在0.1~100 μmol/L濃度范圍內(nèi)初始核酸庫的濃度和容量差異對適配體篩選效率沒有顯著影響。

    2?實(shí)驗部分

    2.1?儀器與試劑

    Beckman P/ACETM MDQ(美國Beckman公司),配備激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器(488 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光);S1000TM Thermal Cycler PCR儀、電泳儀和電泳槽(美國Bio-Road公司);T-green切膠儀(北京天根生化科技有限公司);Illumina-Hiseq平臺測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

    熔融石英毛細(xì)管(75 μm內(nèi)徑,有效長度/總長:40.2 cm/50.2 cm,河北邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司);NSE(武漢云克隆科技股份有限公司);80 nt熒光標(biāo)記核酸庫(5-FAM-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-40N-CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA-3(兩端為20 nt引物區(qū)固定序列,中間為40 nt隨機(jī)序列))、上游引物P1(5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3)、熒光標(biāo)記的上游引物5-FAM-P1( FAM-5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3)、下游引物P2(5-TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG-3(生工生物工程(上海)股份有限公司);溶菌酶適配體(80 nt長度的AChE-L和60 nt長度的AChE-M);2×Taq Plus PCR Master Mix(天根生化科技有限公司);Na2B4O7·10H2O、H3BO3、NaOH、H3PO4、Tris-HCl(分析純,北京化工廠);實(shí)驗用水為二次蒸餾水(ddH2O)。

    適配體篩選用溶液:A:25 mmol/L Tris base,192 mmol/L Glycine,5 mmol/L K2HPO4,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(TGK,pH 8.3);B:25 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(Tris-HCl,pH 7.4);C:8.1 mmol/L Na2HPO4,1.1 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(PBS,pH 7.4);D:20 mmol/L HEPES,150 mmol/L NaCl(HEPES,pH 7.5)。上述溶液均用ddH2O配制,并經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后使用。

    2.2?實(shí)驗方法

    2.2.1?蛋白和核酸庫溶液配制?NSE使用ddH2O配制成10 μmol/L儲備液,80℃保存。核酸庫配制成100 μmol/L溶液,使用前在94℃變性5 min,緩慢冷卻至室溫,再稀釋至所需濃度。

    2.2.2?毛細(xì)管電泳分離分析?將NSE和核酸庫在PCR管中混勻,37℃水浴孵育30 min。CE分析條件:50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH 8.7),分離電壓20 kV,溫度25℃,LIF檢測,0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)進(jìn)樣10 s。將所需復(fù)合物收集到含50 μL緩沖液的PCR管中,用于后續(xù)PCR。每次CE運(yùn)行間分別用0.1 mol/L NaOH、ddH2O、H3BO3/Na2B4O7溶液沖洗毛細(xì)管3 min。新毛細(xì)管使用前,用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH和ddH2O各沖洗30 min。

    2.2.3?核酸序列分析與親和力表征?PCR擴(kuò)增包含對稱PCR和不對稱PCR兩個步驟,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化,具體步驟參考文獻(xiàn)[25]。M-fold軟件用于預(yù)測候選核酸適配體序列的二級結(jié)構(gòu)。親和力KD計算參考NECEEM方法,計算公式如下[16,26]:

    其中,[P]0和[DNA]0分別是平衡體系中蛋白質(zhì)和核酸的總濃度;A1是游離核酸的峰面積,A2是蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的峰面積,A3是復(fù)合物解離區(qū)的峰面積。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?NSE-ssDNA復(fù)合物形成和驗證

    將1 μmol/L核酸庫與等體積水混合,進(jìn)行CE分析,7.5 min處出現(xiàn)明顯的核酸庫峰。加入NSE蛋白,核酸庫峰降低,并在3.5 min處出現(xiàn)新峰,此峰隨NSE濃度增加(2.5、5和10 μmol/L)而增大(圖1A),是NSE-ssDNA復(fù)合物。這也說明NSE與核酸庫中的一些核酸序列之間發(fā)生相互作用,并能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

    進(jìn)一步考察了溶液對復(fù)合物形成的影響。分別用ddH2O、TGK、Tris-HCl、PBS、HEPES溶液配制核酸庫,使核酸庫與NSE在上述溶液中孵育后進(jìn)行CE分析。由圖1B可見,5種溶液中均可形成NSE-ssDNA復(fù)合物,2.5 min處有明顯的復(fù)合物峰。其中,ddH2O和TGK溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰較小;而Tris-HCl、PBS和HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰高比ddH2O中提高約4倍,表明Tris-HCl、PBS和HEPES溶液更有利于NSE-ssDNA復(fù)合物的形成和穩(wěn)定。HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰最大,后續(xù)實(shí)驗中選擇HEPES為孵育緩沖液。

    3.2?不同濃度核酸庫的篩選效率比較

    將4個濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L)分別與5 μmol/L NSE混合孵育,進(jìn)行CE分離。收集NSE-ssDNA復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再純化后,制成次級核酸庫,完成1輪篩選,此過程可重復(fù)進(jìn)行,實(shí)現(xiàn)多輪篩選。通過CE-LIF測定每輪核酸庫與NSE復(fù)合物的親和力,監(jiān)測每輪次級核酸庫的親和力,評估核酸庫的富集程度,直至次級核酸庫的親和力不再提升時,停止篩選。

    由圖2A可見,較低濃度的初始核酸庫ssDNA0(0.1和1 μmol/L)中加入NSE,只有很小的復(fù)合物峰出現(xiàn),而10和100 μmol/L核酸庫中加入NSE,復(fù)合物峰明顯增大。100 μmol/L核酸庫產(chǎn)生的復(fù)合物峰面積約為前者的10倍,說明相同濃度的NSE在高濃度的核酸庫中結(jié)合了更多的核酸。將此復(fù)合物收集、擴(kuò)增、純化,得到第1輪篩選后的次級核酸庫ssDNA1。繼續(xù)第2輪篩選,得到ssDNA2。對4個濃度的初始核酸庫分別進(jìn)行2輪篩選,在2輪篩選得到的次級核酸庫ssDNA2中分別加入NSE。由圖2B可見,4個次級庫與NSE形成的復(fù)合物峰都很小,特別是100和0.1 μmol/L形成的復(fù)合物峰沒有明顯差異。4個濃度的初始核酸庫(濃度相差104倍)經(jīng)過2輪篩選后,次級核酸庫ssDNA2與NSE的結(jié)合已無明顯差異。說明初始核酸庫的濃度并不決定次級核酸庫中與NSE結(jié)合的核酸序列的數(shù)量。這也進(jìn)一步說明,高濃度的初始核酸庫中可能有大部分核酸序列與NSE的結(jié)合較弱,形成的復(fù)合物也不穩(wěn)定。經(jīng)過兩輪篩選,與NSE結(jié)合弱的核酸序列幾乎都被去除。由于核酸庫是各種核酸序列的混合,核酸庫合成時,中間隨機(jī)區(qū)的序列具有不確定性。因此,高濃度的核酸庫中并不能確定含有更多可與NSE強(qiáng)結(jié)合的核酸序列,高濃度和低濃度核酸庫中含有的強(qiáng)結(jié)合核酸序列可能是恒定的,因此,核酸庫的容量并不決定適配體的篩選效率。

    為定量評價核酸庫與NSE的結(jié)合強(qiáng)弱,分別測定4個初始核酸庫ssDNA0與NSE的解離常數(shù)KD。由圖3A可見,初始核酸庫ssDNA0的KD≈40 μmol/L,經(jīng)過3輪篩選后,再測定3個次級庫ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3的KD。經(jīng)過1輪篩選后,次級核酸庫ssDNA1的KD明顯降低,說明其親和力明顯提升,初始核酸庫中結(jié)合力強(qiáng)的序列得到富集。經(jīng)第2輪和第3輪篩選后的KD值變化不大,平均KD≈10 μmol/L。4個濃度的初始核酸庫經(jīng)過篩選后得到的次級庫KD值在同一數(shù)量級(圖3A),說明不同濃度的核酸庫經(jīng)過兩輪CE篩選后,其與NSE結(jié)合的親和力相當(dāng)。

    值得注意的是,高濃度(100 μmol/L)的初始核酸庫經(jīng)第1輪篩選后,次級核酸庫的親和力反而低于其它濃度的核酸庫(KD≈20 μmol/L)??赡艿脑蚴牵邼舛群怂釒煨纬傻膹?fù)合物量大,復(fù)合物中含有的不均一核酸序列也多,而PCR存在的偏性擴(kuò)增可能導(dǎo)致強(qiáng)結(jié)合的序列未能成比例地有效擴(kuò)增,故高濃度次級庫的親和力并未達(dá)預(yù)期。但經(jīng)過第2輪、第3輪篩選后,大部分核酸序列去除,這種擴(kuò)增所致的差異已不明顯。此外,與第2輪篩選相比,第3輪篩選并不能使KD進(jìn)一步提升,甚至降低,這說明過多的篩選輪數(shù)不僅造成時間和費(fèi)用的浪費(fèi),而且多次PCR過程可能引入較大的堿基錯配、偏性擴(kuò)增等誤差。因此,較多的篩選輪次并不能明顯提高核酸庫的平均親和力。

    第2輪篩選后,收集的復(fù)合物的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3B所示,4個濃度的核酸庫產(chǎn)生的復(fù)合物的擴(kuò)增產(chǎn)物在50~100 bp區(qū)間內(nèi)均有清晰的、亮度相近的DNA條帶,且沒有多余雜帶。這也說明4個核酸庫經(jīng)過2輪篩選后,其復(fù)合物的PCR產(chǎn)物量相當(dāng)。因此,在本研究選擇的濃度范圍內(nèi),初始核酸庫的濃度不會影響后續(xù)產(chǎn)生的適配體的數(shù)量。

    3.3?高通量測序與數(shù)據(jù)分析

    收集2輪篩選的ssDNA2-NSE復(fù)合物,PCR擴(kuò)增后,經(jīng)Illumina-Miseq高通量測序,使用Fastaptamer軟件對ssDNA2序列進(jìn)行統(tǒng)計分析。4個核酸庫中篩選出的核酸序列測序后的總序列數(shù)分別為179355、185306、166185和171142,總量相差不大,但不同序列的數(shù)量(序列多樣性)有差異。100 μmol/L核酸庫,篩選后的序列多樣性為總序列數(shù)的93.95%,而0.1 μmol/L核酸庫,序列多樣性占78.33%。這也說明從高濃度初始核酸庫篩選得到的次級庫,其核酸序列的多樣性可能更好,但核酸庫中的序列多樣性與篩選序列的親和力沒有必然相關(guān)性。圖2和圖3的定性和定量分析結(jié)果也表明核酸庫濃度對所篩選序列的親和力沒有顯著影響。

    3.4?候選序列的選擇及親和力分析

    對每個核酸庫中2輪篩選后的ssDNA2進(jìn)行高通量測序,從大量核酸序列中選擇10條核酸序列作為候選序列。這10條候選序列分別是每個次級庫中出現(xiàn)頻率最高的兩條序列(Seq qN-01~08)、一條隨機(jī)序列(Seq qN-09)、4個庫中的共有序列(Seq qN-10)。圖4為M-fold軟件給出序列的二級結(jié)構(gòu)。10條候選序列中Seq qN-01表現(xiàn)出最佳的親和力,KD=(4.72±0.15) μmol/L;其余候選序列的KD≈6.5 μmol/L;這些序列表現(xiàn)出相近的親和力(μmol級)(表2),與圖3A核酸庫的總親和力結(jié)果吻合。其中,Seq qN-10為4個核酸庫中的共同序列,出現(xiàn)的頻率和比率均最高,測定其KD=(7.84±1.31) μmol/L;而隨機(jī)序列Seq qN-09的KD=(8.51±1.67) μmol/L,與Seq qN-10親和力相近。此結(jié)果也與文獻(xiàn)[27]一致,即CE篩選中序列出現(xiàn)的頻次與其親和力強(qiáng)弱之間沒有統(tǒng)計差異。

    3.5?適配體特異性分析

    以親和力最優(yōu)的Seq qN-01為候選適配體,驗證其對NSE蛋白結(jié)合的特異性。將Seq qN-01分別與NSE及血清相關(guān)蛋白(細(xì)胞色素C、血紅蛋白、人凝血酶、免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA))混合孵育后,進(jìn)行CE分析。由圖5A可見,Seq qN-01與NSE的混合物在2.6 min有明顯的復(fù)合物峰,而與其它5種蛋白的混合物沒有復(fù)合物峰,說明篩選的Seq qN-01對NSE具有選擇性識別能力。以兩條溶菌酶的適配體序列(AChE-L和AChE-M)為對照,它們是與NSE不相關(guān)的核酸序列,故與NSE沒有相互作用,圖5B中沒有復(fù)合物峰。而Seq qN-01與NSE可形成明顯的復(fù)合物峰。當(dāng)Seq qN-01與溶菌酶的兩條適配體序列混合,其中加入NSE,仍然可見復(fù)合物峰,表明只有Seq qN-01對NSE具有特異性識別。

    4?結(jié) 論

    基于CE-SELEX建立了篩選NSE適配體的方法,使用4種不同濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L),通過比較3輪篩選的庫間親和力、序列多樣性以及篩選后得到的序列親和力,研究核酸庫容量對適配體篩選效率的影響。實(shí)驗結(jié)果表明,盡管濃度較高的大容量核酸庫中含有更多的ssDNA序列,但從中篩選的核酸適配體序列親和力與容量小的核酸庫中篩選的序列親和力相當(dāng)。說明在CE-SELEX中核酸庫容量對適配體篩選效率并沒有顯著影響,進(jìn)一步說明ssDNA庫中序列的多樣性不是獲得高親和力適配體的關(guān)鍵,而能夠獲得有識別功能的核酸序列是成功篩選的關(guān)鍵。盡管CE-SELEX中所用的核酸庫容量小于其它SELEX方法,但僅需2輪篩選即可獲到NSE的高親和力、高特異性的適配體Seq qN-01(KD=(4.72±0.15) μmol/L),其親和力和特異性令人滿意。

    Reference

    1?Munzar J D,Ng A,Juncker D. Chem. Soc. Rev.,?2019,48(5): 1390-1419

    2?Rthlisberger P,Hollenstein M. Adv. Drug Delivery Rev.,???2018,134: 3-21

    3?Ellington A D,Szostak J W. Nature,???1990,346(6287): 818-822

    4?Tuerk C,Gold L. Science,?1990,249(4968): 505-510

    5?Ou D,Sun D P,Lin X G,Liang Z X,Zhong Y S,Chen Z G. J. Mater. Chem. B,?2019,7(23): 3661-3669

    6?Fraser L A,Kinghorn A B,Dirkzwager R M,Liang S L,Cheung Y W,Lim B,Shiu S C C,Tang M S L,Andrew D,Manitta J,Richards J S,Tanner J A. Biosens. Bioelectron.,???2018,100: 591-596

    7?Yang L,Sun H,Liu Y,Hou W,Yang Y,Cai R,Cui C,Zhang P,Pan X,Li X. Angew. Chem. Int. Edit.,???2018,57(52): 17048-17052

    8?Meng H M,Liu H,Kuai H,Peng R,Mo L,Zhang X B. Chem. Soc. Rev.,???2016,45(9): 2583-2602

    9?Nguyen V T,Kwon Y S,Gu M B. Curr. Opin. Biotech.,??2017,45: 15-23

    10?Lee J F,Hesselberth J R,Meyers L A,Ellington A D. Nucleic Acids Res.,???2004,32(1): D95

    11?Zhuo Z L,Yu Y Y,Wang M L,Li J,Zhang Z K,Liu J,Wu X H,Lu A P,Zhang G,Zhang B T. Int. J. Mol. Sci.,???2017,18(10): 2142

    12?Zhu C,Yang G,Ghulam M,Li L,Qu F. Biotechnol. Adv.,???2019,37(8): 107432

    13?Gotrik M R,F(xiàn)eagin T A,Csordas A T,Nakamoto M A,Soh H T. Acc. Chem. Res.,???2016,49: 1903-1910

    14?Bayat P,Nosrati R,Alibolandi M,Rafatpanah H,Abnous K,Khedri M,Ramezani M. Biochimie,?2018,154: 132-155

    15?Mendonsa S D,Bowser M T. J. Am. Chem. Soc.,???2004,126(1): 20-21

    16?Berezovski M,Drabovich A,Krylova S M,Musheev M,Okhonin V,Petrov A,Krylov S N. J. Am. Chem. Soc.,???2005,127(9): 3165-3171

    17?Mallikaratchy P,Stahelin R V,Cao Z,Cho W,Tan W. Chem. Commun.,???2006,(30): 3229-3231

    18?Luo Z,Zhou H,Jiang H,Ou H,Li X,Zhang L. Analyst,?2015,140(8): 2664-2670

    19?Li X,He Y,Ma Y,Bie Z,Liu B,Liu Z. Anal. Chem.,???2016,88(19): 9805-9812

    20?Ruff P,Pai R B,Storici F. ISRN Mol. Biol.,???2012: ?939083

    21?Wang T,Chen C,Larcher L M,Barrero R A,Veedu R N. Biotechnol. Adv.,???2019,37(1): 28-50

    22?Fizazi K,Cojean I,Pignon J P,Rixe O,Gatineau M,Hadef S,Arriagada R,Baldeyrou P,Comoy E,Chevalier T L. Cancer,?1998,82(6): 1049-1055

    23?Erbaycu A E,Gunduz A,Batum O,Ucar Z Z,Tuksavul F,Guclu S Z. Arch. Bronconeumol.,???2010,46(7): 364-369

    24?Duffy M J,OByrne K. Adv. Clin. Chem.,???2018,86: 1-21

    25?YANG Ge,ZHU Chao,LIU Xiao-Hui,WANG Yong,QU Feng. Chinese J. Anal. Chem.,???2018,46(10): 1595-1603

    楊 歌,朱 超,劉曉慧,王 勇,屈 鋒. 分析化學(xué),2018,46(10): 1595-1603

    26?Berezovski M V,Musheev M U,Drabovich A P,Jitkova J V,Krylov S N. Nat. Protoc.,???2006,1(3): 1359-1369

    27?Jing M,Bowser M T. Anal. Chem.,???2013,85(22): 10761-10770

    日韩制服骚丝袜av| 久久人人爽人人片av| 婷婷色综合大香蕉| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产片内射在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女视频免费永久观看网站| 热re99久久国产66热| 久久青草综合色| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品国产三级专区第一集| 色94色欧美一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 免费人成在线观看视频色| 午夜福利视频在线观看免费| 久久99热6这里只有精品| 成人影院久久| 国产精品久久久久成人av| 特大巨黑吊av在线直播| 少妇 在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 一级二级三级毛片免费看| 精品少妇久久久久久888优播| 国国产精品蜜臀av免费| 久久青草综合色| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲成人一二三区av| 欧美性感艳星| www.色视频.com| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人精品在线电影| 中文字幕免费在线视频6| 日本欧美国产在线视频| 国产精品三级大全| 国产精品人妻久久久影院| 看非洲黑人一级黄片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国内精品宾馆在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久99精品国语久久久| .国产精品久久| av黄色大香蕉| 少妇 在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲性久久影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一级毛片电影观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产精品成人久久小说| 婷婷成人精品国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产淫语在线视频| 久久精品夜色国产| 三上悠亚av全集在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 22中文网久久字幕| 国产熟女午夜一区二区三区 | 99热这里只有是精品在线观看| 成人二区视频| 曰老女人黄片| 99久久人妻综合| 欧美+日韩+精品| 永久免费av网站大全| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩精品有码人妻一区| 久久影院123| 国模一区二区三区四区视频| 国产乱来视频区| 91成人精品电影| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本wwww免费看| 黑人猛操日本美女一级片| 热re99久久国产66热| 亚洲五月色婷婷综合| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产黄色免费在线视频| av.在线天堂| 国产男女超爽视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本91视频免费播放| 丝袜喷水一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产一级毛片在线| 亚洲五月色婷婷综合| 99久国产av精品国产电影| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 黑丝袜美女国产一区| 人妻一区二区av| 国产又色又爽无遮挡免| 免费黄频网站在线观看国产| 老熟女久久久| 欧美丝袜亚洲另类| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品三级大全| 国产成人精品婷婷| 精品久久久久久电影网| 看非洲黑人一级黄片| 免费观看a级毛片全部| 一级,二级,三级黄色视频| 满18在线观看网站| 国产精品久久久久久久电影| 免费av不卡在线播放| 国产在线视频一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 少妇的逼水好多| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 美女内射精品一级片tv| 精品久久久久久电影网| 天堂中文最新版在线下载| av在线老鸭窝| av不卡在线播放| 人人澡人人妻人| 国产综合精华液| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| freevideosex欧美| 伦理电影大哥的女人| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 丝袜脚勾引网站| av在线播放精品| 多毛熟女@视频| 亚洲怡红院男人天堂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费大片黄手机在线观看| 久久狼人影院| 在线观看www视频免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美xxⅹ黑人| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | av一本久久久久| 国产精品 国内视频| 久久久欧美国产精品| 国产日韩欧美视频二区| 精品久久久久久久久亚洲| 国产一区二区三区综合在线观看 | 人成视频在线观看免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产高清三级在线| 如何舔出高潮| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲综合精品二区| 中文字幕最新亚洲高清| 伦精品一区二区三区| 精品久久久噜噜| 亚洲图色成人| 丰满饥渴人妻一区二区三| 我要看黄色一级片免费的| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 草草在线视频免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 丝瓜视频免费看黄片| 一区二区三区免费毛片| 欧美精品国产亚洲| 日韩精品有码人妻一区| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲性久久影院| 国产色婷婷99| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 午夜免费鲁丝| 97在线视频观看| 人人妻人人澡人人看| 边亲边吃奶的免费视频| 色网站视频免费| 考比视频在线观看| 国产高清三级在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 青青草视频在线视频观看| 多毛熟女@视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产成人一区二区在线| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产视频首页在线观看| 极品人妻少妇av视频| 免费观看无遮挡的男女| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本免费在线观看一区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 伦理电影大哥的女人| 22中文网久久字幕| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲在久久综合| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久av网站| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 黄色一级大片看看| 两个人免费观看高清视频| 热99久久久久精品小说推荐| 国产欧美亚洲国产| 日本免费在线观看一区| 22中文网久久字幕| 欧美xxⅹ黑人| 美女大奶头黄色视频| 最黄视频免费看| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美国产精品一级二级三级| 插阴视频在线观看视频| 国产 精品1| 欧美xxxx性猛交bbbb| 自线自在国产av| 伊人久久国产一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 国产在线视频一区二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 在线看a的网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 久久久精品区二区三区| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人一区二区在线| 国产成人精品在线电影| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 成人手机av| 日韩三级伦理在线观看| 久久 成人 亚洲| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲国产最新在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩视频在线欧美| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产在线免费精品| 在线天堂最新版资源| 国产一区二区三区av在线| 18在线观看网站| 最黄视频免费看| 丰满乱子伦码专区| 国产成人av激情在线播放 | 久久ye,这里只有精品| 久久精品久久精品一区二区三区| a级毛片黄视频| 最近的中文字幕免费完整| 婷婷色av中文字幕| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品久久久噜噜| 欧美人与善性xxx| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品无大码| 日本wwww免费看| 一区二区三区四区激情视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产乱来视频区| 夜夜爽夜夜爽视频| kizo精华| .国产精品久久| 国产熟女午夜一区二区三区 | 精品国产国语对白av| a级毛片黄视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 青春草国产在线视频| 九九爱精品视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲国产精品999| 永久网站在线| 街头女战士在线观看网站| 国产精品三级大全| 亚洲精品av麻豆狂野| 最近手机中文字幕大全| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩视频在线欧美| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 永久免费av网站大全| 欧美日韩视频精品一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品欧美亚洲77777| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年人午夜在线观看视频| 一级毛片我不卡| 久久人人爽人人片av| 亚洲成人一二三区av| 精品亚洲成国产av| 久久久久久久久久久免费av| 午夜日本视频在线| 精品久久国产蜜桃| 久久 成人 亚洲| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 日日撸夜夜添| 免费大片18禁| 青春草国产在线视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲av男天堂| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产精品一区三区| 美女cb高潮喷水在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日本中文国产一区发布| 满18在线观看网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色视频在线一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产最新在线播放| 国产视频内射| 久久久国产欧美日韩av| 熟女av电影| 22中文网久久字幕| 亚洲av.av天堂| 黄片播放在线免费| 国产精品蜜桃在线观看| 尾随美女入室| 22中文网久久字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丰满乱子伦码专区| 最近手机中文字幕大全| 亚洲少妇的诱惑av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 午夜av观看不卡| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜激情av网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 波野结衣二区三区在线| 日韩精品有码人妻一区| 精品一区在线观看国产| 老司机影院成人| 99久久人妻综合| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 夫妻午夜视频| 精品人妻熟女av久视频| 免费少妇av软件| 欧美日韩综合久久久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲色图综合在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品酒店卫生间| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产不卡av网站在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 我的女老师完整版在线观看| videossex国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕久久专区| 亚洲人成77777在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| av又黄又爽大尺度在线免费看| 好男人视频免费观看在线| 丝袜在线中文字幕| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费观看的影片在线观看| a级毛色黄片| 久久久久久久久久成人| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品久久久久成人av| 日本欧美视频一区| 99视频精品全部免费 在线| 久久精品国产自在天天线| 国产成人av激情在线播放 | 一级片'在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线| 午夜福利视频在线观看免费| 国产高清不卡午夜福利| 一区在线观看完整版| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲五月色婷婷综合| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 成年女人在线观看亚洲视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人精品婷婷| 日韩欧美精品免费久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 十八禁高潮呻吟视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 18禁观看日本| 在线观看一区二区三区激情| 免费看不卡的av| 母亲3免费完整高清在线观看 | videosex国产| 国产有黄有色有爽视频| 一级毛片 在线播放| 国产片内射在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 人妻一区二区av| 男女边摸边吃奶| 亚洲色图综合在线观看| 飞空精品影院首页| 麻豆成人av视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 在线观看美女被高潮喷水网站| 性色av一级| 黄色一级大片看看| 国产国语露脸激情在线看| 一区二区三区免费毛片| 国产一级毛片在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品人人爽人人爽视色| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 婷婷色av中文字幕| 国产一级毛片在线| www.av在线官网国产| 大码成人一级视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品自拍成人| 99九九线精品视频在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 岛国毛片在线播放| 国产精品一国产av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 伊人久久国产一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 熟女av电影| 日本av免费视频播放| 亚洲,一卡二卡三卡| av线在线观看网站| 一级,二级,三级黄色视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久久国产电影| 99re6热这里在线精品视频| 美女主播在线视频| 一本久久精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 嫩草影院入口| 午夜福利视频在线观看免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲内射少妇av| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲经典国产精华液单| 桃花免费在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 少妇的逼水好多| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一边亲一边摸免费视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产综合精华液| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 视频中文字幕在线观看| av在线app专区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品国产三级专区第一集| 插阴视频在线观看视频| 国产av一区二区精品久久| 日本色播在线视频| 视频中文字幕在线观看| av在线app专区| 久久久亚洲精品成人影院| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 日本与韩国留学比较| 久久久久人妻精品一区果冻| 少妇精品久久久久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线观看一区二区三区激情| 看非洲黑人一级黄片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一级片'在线观看视频| 婷婷色av中文字幕| 插逼视频在线观看| 高清av免费在线| 精品一区二区三区视频在线| 尾随美女入室| 久久久久久久久大av| 欧美成人午夜免费资源| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久影院123| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜av观看不卡| 一本大道久久a久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 人妻 亚洲 视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久成人av| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av福利一区| 亚洲精品456在线播放app| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜视频国产福利| av.在线天堂| 夫妻午夜视频| 丁香六月天网| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| 久久人人爽人人片av| 久久av网站| 亚洲美女视频黄频| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美人与善性xxx| 一级a做视频免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一级毛片我不卡| 久久久欧美国产精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 一级黄片播放器| 两个人免费观看高清视频| 99热国产这里只有精品6| 人妻系列 视频| 人体艺术视频欧美日本| 91久久精品国产一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 一区二区三区精品91| 欧美日韩国产mv在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲伊人久久精品综合| 少妇 在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日日爽夜夜爽网站| 精品人妻在线不人妻| 精品一区二区免费观看| 欧美成人午夜免费资源| 视频在线观看一区二区三区| 成人无遮挡网站| 亚洲av二区三区四区| 欧美性感艳星| 国产伦理片在线播放av一区| xxx大片免费视频| 乱人伦中国视频| 视频区图区小说| 久久精品久久久久久久性| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品在线电影| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产成人精品在线电影| 人人澡人人妻人| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av福利一区| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产日韩欧美视频二区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲无线观看免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕久久专区| 一区二区av电影网| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人手机av| 免费黄色在线免费观看| 国产精品国产三级专区第一集| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av日韩在线播放| 大片免费播放器 马上看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久 成人 亚洲|