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    毛細(xì)管電泳法研究核酸庫容量對蛋白質(zhì)適配體篩選的影響

    2020-05-11 05:56李林森朱超趙毅楊歌屈鋒
    分析化學(xué) 2020年5期

    李林森 朱超 趙毅 楊歌 屈鋒

    摘?要?毛細(xì)管電泳(CE)具有高分辨、快速分離、樣品用量小和無需固相介質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),是高效篩選核酸適配體的方法之一。然而,由于CE的進(jìn)樣量少,有限的核酸庫容量是否影響毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(CE-SELEX)適配體的篩選效率,尚不明確。本研究以神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)為模式蛋白,考察了CE篩選中核酸庫容量對篩選效率的影響,以明確CE-SELEX方法的有效性。分別使用4個濃度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸庫進(jìn)行適配體篩選,比較了初始庫與經(jīng)3輪篩選后的次級核酸庫的親和力。結(jié)果表明,4個核酸庫篩選輪次間庫親和力相近,且經(jīng)2輪篩選后均得到了微摩爾級別的核酸適配體。此外,用高濃度核酸庫篩選獲得的序列更具多樣性,但未能提升候選序列親和力。經(jīng)2輪篩選得到NSE的核酸適配體Seq qN-01,其與NSE復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)為(4.72±0.15) μmol/L,并表現(xiàn)出很好的特異性。綜上,核酸庫容量會提高后續(xù)富集庫的序列多樣性,但對適配體篩選效率沒有顯著影響。

    關(guān)鍵詞?神經(jīng)元特異性烯醇化酶;核酸庫容量;核酸適配體篩選;毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化

    1?引 言

    核酸適配體(Aptamer),又被稱為“化學(xué)抗體”,是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)體外篩選獲得的寡核苷酸序列(單鏈DNA/ssDNA或RNA)。核酸適配體作為新型識別分子,不僅具有性質(zhì)穩(wěn)定、易合成和化學(xué)修飾、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),而且其識別的靶標(biāo)廣泛,包括金屬離子、有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物、病毒等[1,2]。自1990年SELEX和Aptamer概念被提出以來[3,4],核酸適配體已成為生物傳感、環(huán)境分析、疾病診斷、藥物遞送及醫(yī)學(xué)影像等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5~9]。近三十年來,已有超過2700種核酸適配體被報道,但很多核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用時的分子識別效果不佳,因而,核酸適配體的高效及有效篩選仍是影響其實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一[10~12]。目前,用于核酸適配體篩選的SELEX技術(shù)多達(dá)三十余種,多數(shù)SELEX技術(shù)需要8~15輪篩選,通常需要4~6周甚至數(shù)月之久,大大降低了核酸適配體的篩選效率;同時,多數(shù)SELEX技術(shù)在分離過程中引入介質(zhì)(磁珠、芯片等),也會造成核酸適配體的特異性缺失[11,13,14]。毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)作為一種高分辨快速分離技術(shù),可在溶液中分離和檢測核酸庫和靶標(biāo)-核酸復(fù)合物,篩選過程中無需固定靶標(biāo)或核酸庫,可大大縮短篩選周期,通常僅需1~4輪即可獲得適配體。此外,CE還可用于篩選過程中蛋白與核酸相互作用表征,次級核酸庫的親和力評價等[15~19]。常規(guī)的SELEX篩選使用的核酸庫容量約為1016個ssDNA序列,CE篩選時樣品用量少,所用的核酸庫容量約為1012個ssDNA序列[20,21]。有限的核酸庫容量是否會影響適配體的篩選效率是CE-SELEX的一個存疑點(diǎn)。

    神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是糖酵解烯醇化酶的細(xì)胞特異性同工酶,廣泛分布于神經(jīng)元和外周神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,是目前小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后和后續(xù)治療中最可靠的腫瘤標(biāo)志物之一[22~24]。本研究以NSE為靶蛋白,建立了基于CE的NSE核酸適配體篩選方法,采用4個不同數(shù)量級濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L ssDNA庫)改變庫容量,以此研究核酸庫容量對適配體篩選效率的影響。經(jīng)過2輪CE篩選,優(yōu)選了NSE的核酸適配體Seq qN-01,其復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)為(4.72±0.15) μmol/L,并利用CE-LIF法驗證了其特異性,該適配體有望用于NSE的相關(guān)分析檢測。研究結(jié)果表明,從4個不同數(shù)量級濃度的初始核酸庫篩選的適配體序列與NSE的親和力相當(dāng),說明CE-SELEX在0.1~100 μmol/L濃度范圍內(nèi)初始核酸庫的濃度和容量差異對適配體篩選效率沒有顯著影響。

    2?實(shí)驗部分

    2.1?儀器與試劑

    Beckman P/ACETM MDQ(美國Beckman公司),配備激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器(488 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光);S1000TM Thermal Cycler PCR儀、電泳儀和電泳槽(美國Bio-Road公司);T-green切膠儀(北京天根生化科技有限公司);Illumina-Hiseq平臺測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

    熔融石英毛細(xì)管(75 μm內(nèi)徑,有效長度/總長:40.2 cm/50.2 cm,河北邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司);NSE(武漢云克隆科技股份有限公司);80 nt熒光標(biāo)記核酸庫(5-FAM-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-40N-CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA-3(兩端為20 nt引物區(qū)固定序列,中間為40 nt隨機(jī)序列))、上游引物P1(5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3)、熒光標(biāo)記的上游引物5-FAM-P1( FAM-5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3)、下游引物P2(5-TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG-3(生工生物工程(上海)股份有限公司);溶菌酶適配體(80 nt長度的AChE-L和60 nt長度的AChE-M);2×Taq Plus PCR Master Mix(天根生化科技有限公司);Na2B4O7·10H2O、H3BO3、NaOH、H3PO4、Tris-HCl(分析純,北京化工廠);實(shí)驗用水為二次蒸餾水(ddH2O)。

    適配體篩選用溶液:A:25 mmol/L Tris base,192 mmol/L Glycine,5 mmol/L K2HPO4,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(TGK,pH 8.3);B:25 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(Tris-HCl,pH 7.4);C:8.1 mmol/L Na2HPO4,1.1 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L MgCl2,2.7 mmol/L KCl,40 mmol/L NaCl(PBS,pH 7.4);D:20 mmol/L HEPES,150 mmol/L NaCl(HEPES,pH 7.5)。上述溶液均用ddH2O配制,并經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后使用。

    2.2?實(shí)驗方法

    2.2.1?蛋白和核酸庫溶液配制?NSE使用ddH2O配制成10 μmol/L儲備液,80℃保存。核酸庫配制成100 μmol/L溶液,使用前在94℃變性5 min,緩慢冷卻至室溫,再稀釋至所需濃度。

    2.2.2?毛細(xì)管電泳分離分析?將NSE和核酸庫在PCR管中混勻,37℃水浴孵育30 min。CE分析條件:50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH 8.7),分離電壓20 kV,溫度25℃,LIF檢測,0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)進(jìn)樣10 s。將所需復(fù)合物收集到含50 μL緩沖液的PCR管中,用于后續(xù)PCR。每次CE運(yùn)行間分別用0.1 mol/L NaOH、ddH2O、H3BO3/Na2B4O7溶液沖洗毛細(xì)管3 min。新毛細(xì)管使用前,用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH和ddH2O各沖洗30 min。

    2.2.3?核酸序列分析與親和力表征?PCR擴(kuò)增包含對稱PCR和不對稱PCR兩個步驟,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化,具體步驟參考文獻(xiàn)[25]。M-fold軟件用于預(yù)測候選核酸適配體序列的二級結(jié)構(gòu)。親和力KD計算參考NECEEM方法,計算公式如下[16,26]:

    其中,[P]0和[DNA]0分別是平衡體系中蛋白質(zhì)和核酸的總濃度;A1是游離核酸的峰面積,A2是蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的峰面積,A3是復(fù)合物解離區(qū)的峰面積。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?NSE-ssDNA復(fù)合物形成和驗證

    將1 μmol/L核酸庫與等體積水混合,進(jìn)行CE分析,7.5 min處出現(xiàn)明顯的核酸庫峰。加入NSE蛋白,核酸庫峰降低,并在3.5 min處出現(xiàn)新峰,此峰隨NSE濃度增加(2.5、5和10 μmol/L)而增大(圖1A),是NSE-ssDNA復(fù)合物。這也說明NSE與核酸庫中的一些核酸序列之間發(fā)生相互作用,并能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

    進(jìn)一步考察了溶液對復(fù)合物形成的影響。分別用ddH2O、TGK、Tris-HCl、PBS、HEPES溶液配制核酸庫,使核酸庫與NSE在上述溶液中孵育后進(jìn)行CE分析。由圖1B可見,5種溶液中均可形成NSE-ssDNA復(fù)合物,2.5 min處有明顯的復(fù)合物峰。其中,ddH2O和TGK溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰較小;而Tris-HCl、PBS和HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰高比ddH2O中提高約4倍,表明Tris-HCl、PBS和HEPES溶液更有利于NSE-ssDNA復(fù)合物的形成和穩(wěn)定。HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰最大,后續(xù)實(shí)驗中選擇HEPES為孵育緩沖液。

    3.2?不同濃度核酸庫的篩選效率比較

    將4個濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L)分別與5 μmol/L NSE混合孵育,進(jìn)行CE分離。收集NSE-ssDNA復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再純化后,制成次級核酸庫,完成1輪篩選,此過程可重復(fù)進(jìn)行,實(shí)現(xiàn)多輪篩選。通過CE-LIF測定每輪核酸庫與NSE復(fù)合物的親和力,監(jiān)測每輪次級核酸庫的親和力,評估核酸庫的富集程度,直至次級核酸庫的親和力不再提升時,停止篩選。

    由圖2A可見,較低濃度的初始核酸庫ssDNA0(0.1和1 μmol/L)中加入NSE,只有很小的復(fù)合物峰出現(xiàn),而10和100 μmol/L核酸庫中加入NSE,復(fù)合物峰明顯增大。100 μmol/L核酸庫產(chǎn)生的復(fù)合物峰面積約為前者的10倍,說明相同濃度的NSE在高濃度的核酸庫中結(jié)合了更多的核酸。將此復(fù)合物收集、擴(kuò)增、純化,得到第1輪篩選后的次級核酸庫ssDNA1。繼續(xù)第2輪篩選,得到ssDNA2。對4個濃度的初始核酸庫分別進(jìn)行2輪篩選,在2輪篩選得到的次級核酸庫ssDNA2中分別加入NSE。由圖2B可見,4個次級庫與NSE形成的復(fù)合物峰都很小,特別是100和0.1 μmol/L形成的復(fù)合物峰沒有明顯差異。4個濃度的初始核酸庫(濃度相差104倍)經(jīng)過2輪篩選后,次級核酸庫ssDNA2與NSE的結(jié)合已無明顯差異。說明初始核酸庫的濃度并不決定次級核酸庫中與NSE結(jié)合的核酸序列的數(shù)量。這也進(jìn)一步說明,高濃度的初始核酸庫中可能有大部分核酸序列與NSE的結(jié)合較弱,形成的復(fù)合物也不穩(wěn)定。經(jīng)過兩輪篩選,與NSE結(jié)合弱的核酸序列幾乎都被去除。由于核酸庫是各種核酸序列的混合,核酸庫合成時,中間隨機(jī)區(qū)的序列具有不確定性。因此,高濃度的核酸庫中并不能確定含有更多可與NSE強(qiáng)結(jié)合的核酸序列,高濃度和低濃度核酸庫中含有的強(qiáng)結(jié)合核酸序列可能是恒定的,因此,核酸庫的容量并不決定適配體的篩選效率。

    為定量評價核酸庫與NSE的結(jié)合強(qiáng)弱,分別測定4個初始核酸庫ssDNA0與NSE的解離常數(shù)KD。由圖3A可見,初始核酸庫ssDNA0的KD≈40 μmol/L,經(jīng)過3輪篩選后,再測定3個次級庫ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3的KD。經(jīng)過1輪篩選后,次級核酸庫ssDNA1的KD明顯降低,說明其親和力明顯提升,初始核酸庫中結(jié)合力強(qiáng)的序列得到富集。經(jīng)第2輪和第3輪篩選后的KD值變化不大,平均KD≈10 μmol/L。4個濃度的初始核酸庫經(jīng)過篩選后得到的次級庫KD值在同一數(shù)量級(圖3A),說明不同濃度的核酸庫經(jīng)過兩輪CE篩選后,其與NSE結(jié)合的親和力相當(dāng)。

    值得注意的是,高濃度(100 μmol/L)的初始核酸庫經(jīng)第1輪篩選后,次級核酸庫的親和力反而低于其它濃度的核酸庫(KD≈20 μmol/L)??赡艿脑蚴牵邼舛群怂釒煨纬傻膹?fù)合物量大,復(fù)合物中含有的不均一核酸序列也多,而PCR存在的偏性擴(kuò)增可能導(dǎo)致強(qiáng)結(jié)合的序列未能成比例地有效擴(kuò)增,故高濃度次級庫的親和力并未達(dá)預(yù)期。但經(jīng)過第2輪、第3輪篩選后,大部分核酸序列去除,這種擴(kuò)增所致的差異已不明顯。此外,與第2輪篩選相比,第3輪篩選并不能使KD進(jìn)一步提升,甚至降低,這說明過多的篩選輪數(shù)不僅造成時間和費(fèi)用的浪費(fèi),而且多次PCR過程可能引入較大的堿基錯配、偏性擴(kuò)增等誤差。因此,較多的篩選輪次并不能明顯提高核酸庫的平均親和力。

    第2輪篩選后,收集的復(fù)合物的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3B所示,4個濃度的核酸庫產(chǎn)生的復(fù)合物的擴(kuò)增產(chǎn)物在50~100 bp區(qū)間內(nèi)均有清晰的、亮度相近的DNA條帶,且沒有多余雜帶。這也說明4個核酸庫經(jīng)過2輪篩選后,其復(fù)合物的PCR產(chǎn)物量相當(dāng)。因此,在本研究選擇的濃度范圍內(nèi),初始核酸庫的濃度不會影響后續(xù)產(chǎn)生的適配體的數(shù)量。

    3.3?高通量測序與數(shù)據(jù)分析

    收集2輪篩選的ssDNA2-NSE復(fù)合物,PCR擴(kuò)增后,經(jīng)Illumina-Miseq高通量測序,使用Fastaptamer軟件對ssDNA2序列進(jìn)行統(tǒng)計分析。4個核酸庫中篩選出的核酸序列測序后的總序列數(shù)分別為179355、185306、166185和171142,總量相差不大,但不同序列的數(shù)量(序列多樣性)有差異。100 μmol/L核酸庫,篩選后的序列多樣性為總序列數(shù)的93.95%,而0.1 μmol/L核酸庫,序列多樣性占78.33%。這也說明從高濃度初始核酸庫篩選得到的次級庫,其核酸序列的多樣性可能更好,但核酸庫中的序列多樣性與篩選序列的親和力沒有必然相關(guān)性。圖2和圖3的定性和定量分析結(jié)果也表明核酸庫濃度對所篩選序列的親和力沒有顯著影響。

    3.4?候選序列的選擇及親和力分析

    對每個核酸庫中2輪篩選后的ssDNA2進(jìn)行高通量測序,從大量核酸序列中選擇10條核酸序列作為候選序列。這10條候選序列分別是每個次級庫中出現(xiàn)頻率最高的兩條序列(Seq qN-01~08)、一條隨機(jī)序列(Seq qN-09)、4個庫中的共有序列(Seq qN-10)。圖4為M-fold軟件給出序列的二級結(jié)構(gòu)。10條候選序列中Seq qN-01表現(xiàn)出最佳的親和力,KD=(4.72±0.15) μmol/L;其余候選序列的KD≈6.5 μmol/L;這些序列表現(xiàn)出相近的親和力(μmol級)(表2),與圖3A核酸庫的總親和力結(jié)果吻合。其中,Seq qN-10為4個核酸庫中的共同序列,出現(xiàn)的頻率和比率均最高,測定其KD=(7.84±1.31) μmol/L;而隨機(jī)序列Seq qN-09的KD=(8.51±1.67) μmol/L,與Seq qN-10親和力相近。此結(jié)果也與文獻(xiàn)[27]一致,即CE篩選中序列出現(xiàn)的頻次與其親和力強(qiáng)弱之間沒有統(tǒng)計差異。

    3.5?適配體特異性分析

    以親和力最優(yōu)的Seq qN-01為候選適配體,驗證其對NSE蛋白結(jié)合的特異性。將Seq qN-01分別與NSE及血清相關(guān)蛋白(細(xì)胞色素C、血紅蛋白、人凝血酶、免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA))混合孵育后,進(jìn)行CE分析。由圖5A可見,Seq qN-01與NSE的混合物在2.6 min有明顯的復(fù)合物峰,而與其它5種蛋白的混合物沒有復(fù)合物峰,說明篩選的Seq qN-01對NSE具有選擇性識別能力。以兩條溶菌酶的適配體序列(AChE-L和AChE-M)為對照,它們是與NSE不相關(guān)的核酸序列,故與NSE沒有相互作用,圖5B中沒有復(fù)合物峰。而Seq qN-01與NSE可形成明顯的復(fù)合物峰。當(dāng)Seq qN-01與溶菌酶的兩條適配體序列混合,其中加入NSE,仍然可見復(fù)合物峰,表明只有Seq qN-01對NSE具有特異性識別。

    4?結(jié) 論

    基于CE-SELEX建立了篩選NSE適配體的方法,使用4種不同濃度的初始核酸庫(0.1、1、10和100 μmol/L),通過比較3輪篩選的庫間親和力、序列多樣性以及篩選后得到的序列親和力,研究核酸庫容量對適配體篩選效率的影響。實(shí)驗結(jié)果表明,盡管濃度較高的大容量核酸庫中含有更多的ssDNA序列,但從中篩選的核酸適配體序列親和力與容量小的核酸庫中篩選的序列親和力相當(dāng)。說明在CE-SELEX中核酸庫容量對適配體篩選效率并沒有顯著影響,進(jìn)一步說明ssDNA庫中序列的多樣性不是獲得高親和力適配體的關(guān)鍵,而能夠獲得有識別功能的核酸序列是成功篩選的關(guān)鍵。盡管CE-SELEX中所用的核酸庫容量小于其它SELEX方法,但僅需2輪篩選即可獲到NSE的高親和力、高特異性的適配體Seq qN-01(KD=(4.72±0.15) μmol/L),其親和力和特異性令人滿意。

    Reference

    1?Munzar J D,Ng A,Juncker D. Chem. Soc. Rev.,?2019,48(5): 1390-1419

    2?Rthlisberger P,Hollenstein M. Adv. Drug Delivery Rev.,???2018,134: 3-21

    3?Ellington A D,Szostak J W. Nature,???1990,346(6287): 818-822

    4?Tuerk C,Gold L. Science,?1990,249(4968): 505-510

    5?Ou D,Sun D P,Lin X G,Liang Z X,Zhong Y S,Chen Z G. J. Mater. Chem. B,?2019,7(23): 3661-3669

    6?Fraser L A,Kinghorn A B,Dirkzwager R M,Liang S L,Cheung Y W,Lim B,Shiu S C C,Tang M S L,Andrew D,Manitta J,Richards J S,Tanner J A. Biosens. Bioelectron.,???2018,100: 591-596

    7?Yang L,Sun H,Liu Y,Hou W,Yang Y,Cai R,Cui C,Zhang P,Pan X,Li X. Angew. Chem. Int. Edit.,???2018,57(52): 17048-17052

    8?Meng H M,Liu H,Kuai H,Peng R,Mo L,Zhang X B. Chem. Soc. Rev.,???2016,45(9): 2583-2602

    9?Nguyen V T,Kwon Y S,Gu M B. Curr. Opin. Biotech.,??2017,45: 15-23

    10?Lee J F,Hesselberth J R,Meyers L A,Ellington A D. Nucleic Acids Res.,???2004,32(1): D95

    11?Zhuo Z L,Yu Y Y,Wang M L,Li J,Zhang Z K,Liu J,Wu X H,Lu A P,Zhang G,Zhang B T. Int. J. Mol. Sci.,???2017,18(10): 2142

    12?Zhu C,Yang G,Ghulam M,Li L,Qu F. Biotechnol. Adv.,???2019,37(8): 107432

    13?Gotrik M R,F(xiàn)eagin T A,Csordas A T,Nakamoto M A,Soh H T. Acc. Chem. Res.,???2016,49: 1903-1910

    14?Bayat P,Nosrati R,Alibolandi M,Rafatpanah H,Abnous K,Khedri M,Ramezani M. Biochimie,?2018,154: 132-155

    15?Mendonsa S D,Bowser M T. J. Am. Chem. Soc.,???2004,126(1): 20-21

    16?Berezovski M,Drabovich A,Krylova S M,Musheev M,Okhonin V,Petrov A,Krylov S N. J. Am. Chem. Soc.,???2005,127(9): 3165-3171

    17?Mallikaratchy P,Stahelin R V,Cao Z,Cho W,Tan W. Chem. Commun.,???2006,(30): 3229-3231

    18?Luo Z,Zhou H,Jiang H,Ou H,Li X,Zhang L. Analyst,?2015,140(8): 2664-2670

    19?Li X,He Y,Ma Y,Bie Z,Liu B,Liu Z. Anal. Chem.,???2016,88(19): 9805-9812

    20?Ruff P,Pai R B,Storici F. ISRN Mol. Biol.,???2012: ?939083

    21?Wang T,Chen C,Larcher L M,Barrero R A,Veedu R N. Biotechnol. Adv.,???2019,37(1): 28-50

    22?Fizazi K,Cojean I,Pignon J P,Rixe O,Gatineau M,Hadef S,Arriagada R,Baldeyrou P,Comoy E,Chevalier T L. Cancer,?1998,82(6): 1049-1055

    23?Erbaycu A E,Gunduz A,Batum O,Ucar Z Z,Tuksavul F,Guclu S Z. Arch. Bronconeumol.,???2010,46(7): 364-369

    24?Duffy M J,OByrne K. Adv. Clin. Chem.,???2018,86: 1-21

    25?YANG Ge,ZHU Chao,LIU Xiao-Hui,WANG Yong,QU Feng. Chinese J. Anal. Chem.,???2018,46(10): 1595-1603

    楊 歌,朱 超,劉曉慧,王 勇,屈 鋒. 分析化學(xué),2018,46(10): 1595-1603

    26?Berezovski M V,Musheev M U,Drabovich A P,Jitkova J V,Krylov S N. Nat. Protoc.,???2006,1(3): 1359-1369

    27?Jing M,Bowser M T. Anal. Chem.,???2013,85(22): 10761-10770

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