乳腺癌生物標(biāo)志物鈣網(wǎng)蛋白的核酸適配體篩選及血清檢測和乳腺癌細(xì)胞識別

孫淼 楊歌 趙毅 屈鋒

摘?要?鈣網(wǎng)蛋白（CRT）與許多癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有效新型生物標(biāo)志物以及乳腺癌分期和預(yù)后的評價指標(biāo)。本研究利用毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體進化技術(shù)（CE-SELEX）篩選并鑒定了CRT的核酸適配體。毛細(xì)管電泳法、等溫滴定量熱法及納米金比色法表征結(jié)果表明，適配體Apt 23對CRT具有較高的親和力和特異性。FAM標(biāo)記的Apt 23（FAM-Apt 23）可用作毛細(xì)管電泳的親和探針，采用激光誘導(dǎo)熒光檢測器，檢測血清中CRT的濃度范圍為1～1000 nmol/L，檢出限為0.5 nmol/L。FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫熒光成像探針，可結(jié)合在CRT過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞4T1的表面。初步研究結(jié)果表明，利用毛細(xì)管電泳篩選的核酸適配體Apt 23可用于CRT識別和檢測的探針。

關(guān)鍵詞?鈣網(wǎng)蛋白;核酸適配體;毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化

1?引 言

鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種高度保守的伴侶蛋白。當(dāng)受到內(nèi)源性刺激時，其與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從胞漿面外翻到細(xì)胞膜外側(cè)面，易位至細(xì)胞膜的表面[1，2]。細(xì)胞表面的CRT可對吞噬細(xì)胞發(fā)出“Eat-me（吃我）”的信號，通過刺激機體免疫效應(yīng)誘導(dǎo)癌細(xì)胞被吞噬[3]。研究者對癌細(xì)胞中CRT的表達(dá)量與癌癥的關(guān)系已進行了大量研究，在口腔癌[4]、乳腺癌[5～8]、胃癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、膀胱癌[11]、胰腺癌[12]、前列腺癌[13]和陰道癌[14]中，CRT的表達(dá)量顯著上調(diào)，其中，對乳腺癌中CRT作用的研究最多。CRT參與乳腺癌信號傳導(dǎo)的p53和MAPK途徑，是有效的新型乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物;CRT在乳腺癌N0～N2期的上調(diào)表達(dá)可作為診斷乳腺癌分期和預(yù)后的指標(biāo)。此外，CRT還與不同癌癥的發(fā)展有密切聯(lián)系，CRT的表達(dá)水平深刻影響癌細(xì)胞的增殖及其發(fā)生和分化，不同腫瘤中CRT的不同表現(xiàn)可能取決于腫瘤細(xì)胞的類型，并決定相應(yīng)的臨床階段[15]。

CRT的常規(guī)檢測方法是利用其抗體進行免疫分析[16～18]，但抗體的制備獲得過程較為繁瑣，批次間穩(wěn)定性較差，入胞也困難，而且價格昂貴。核酸適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集配體進化技術(shù)（SELEX）體外迭代過程篩選獲得的單鏈RNA或者DNA分子[19，20]。作為新型識別分子，理想的核酸適配體能與靶標(biāo)以高親和力和高特異性結(jié)合，可通過化學(xué)合成，性質(zhì)穩(wěn)定，合成成本低，分子量比抗體小得多，易穿透細(xì)胞膜且毒性低[21]。近年來，隨著核酸適配體研究的深入，其在蛋白質(zhì)有關(guān)的檢測、細(xì)胞成像、疾病診斷與靶向治療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[22]。目前，蛋白質(zhì)的核酸適配體報道較多，為核酸適配體的生物醫(yī)學(xué)和藥物應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。文獻報道的蛋白質(zhì)篩選方法主要以磁珠/微球-SELEX、微柱-SELEX以及硝化纖維素膜結(jié)合-SELEX等固定蛋白質(zhì)的篩選方法為主，通常需要8～15輪篩選才能獲得所需的核酸適配體[23]。多輪的篩選引起罕見序列的丟失以及PCR偏性的發(fā)生，且蛋白質(zhì)的固定會減少核酸分子的結(jié)合位點，以及導(dǎo)致非特異性和低親和力核酸序列的保留。毛細(xì)管電泳-SELEX（CE-SELEX）無需固定蛋白質(zhì)，可在模擬人體生理環(huán)境的溶液條件下，分離出與蛋白質(zhì)相互作用的核酸分子，經(jīng)1～4輪篩選即可得到目標(biāo)物的適配體[24，25]。

本研究利用CE-SELEX技術(shù)，篩選了可與CRT高親和性和特異性結(jié)合的核酸適配體，目前，此蛋白的適配體還未見報道。在4輪篩選過程中，表征了每輪富集庫對CRT的結(jié)合比和親和力，以此監(jiān)控篩選的富集進程。最終選擇第3輪篩選的PCR產(chǎn)物進行高通量測序。根據(jù)序列出現(xiàn)的頻率及其二級結(jié)構(gòu)，選擇了6條核酸適配體測定親和力，以平衡解離常數(shù)（KD）最小的Apt 23為CRT的適配體，進一步考察其特異性。將經(jīng)過熒光FITC標(biāo)記的適配體FITC-Apt 23用于血清稀釋液檢測，可檢出加標(biāo)的CRT。將其用于乳腺癌細(xì)胞成像，證明了CRT在腫瘤細(xì)胞表面的過量表達(dá)，表明所篩選的適配體Apt 23具有CRT識別和檢測的應(yīng)用價值

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀（美國Beckman-coulter公司）;S1000TM PCR儀（新加坡Bio-RAD公司）;TGreen OSE-470超薄型藍(lán)光切膠儀（北京天根生化公司）;冷凍高速離心機（美國賽默飛世爾公司）;MicroCal ITC 200等溫滴定量熱儀（英國馬爾文儀器公司）;G：BOX F3高級凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）;Nikon N-SIM 超分辨率顯微鏡（日本尼康公司）。

重組人鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT，美國Cloud-Clone 公司）;鼠免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG，武漢華美生物工程有限公司）;人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA，美國Sigma-Aldrich公司）;人細(xì)胞程序性死亡-配體（Programmed cell death-ligand，PDL1，美國Cloud-Clone公司）;人血紅蛋白（Hemoglobin，Hb，北京索萊寶科技有限公司）;IgG-FITC與HSA-FITC （北京博爾西科技有限公司）;小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）與小鼠乳腺正常上皮細(xì)胞（EpH4-Ev）（美國模式菌種收集中心ATCC）;N15、N30核酸庫：5-FAM-ACCGACCGTGCTGGACTCT-15N（30N）-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，引物P1： 5-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3，熒光FAM標(biāo)記的引物5-FAM-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3，引物P2： 5-CGCAACGCTCGCTCATACT-3（上海生工生物工程公司）;混合人血清與細(xì)胞完全培養(yǎng)基DMEM（北京中科邁晨科技有限公司）;細(xì)胞培養(yǎng)用PBS溶液（美國Hyclone公司）;細(xì)胞染色液（Hoechst 33258和Hoechst 33342，武漢亞科因科技有限公司）;5×TBE電泳緩沖液、雙蒸水（ddH2O）、瓊脂糖、2×Taq PCR 混合酶、10000×GeneGreen 核酸染料、50bp DNA ladder、6×DNA loading buffer（北京天根生化科技有限公司）;Na2B4O7·10H2O、H3BO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaOH、NaCl、三氯甲烷、乙醇（北京化工廠）;異戊醇（天津津科精細(xì)化工研究所）;活化劑（澳大利亞Anteo Technologies公司）;膠體金顆粒（AuNPs，上海華藍(lán)化學(xué)公司）;75 μm/200 μm內(nèi)徑熔融石英毛細(xì)管（河北奧泰克生物科技有限公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?溶液配制?1 mL 0.05 mol/L 硼砂溶液與9 mL 0.2 mol/L 硼酸混合，加水稀釋至50 mL，配制成50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH 7.4）。稱取0.85 g NaCl、 0.22g Na2HPO4和0.2 g NaH2PO4，加水溶解并定容至100 mL，配制10 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.4）。使用前，緩沖溶液通過0.22 μm濾膜過濾。

蛋白溶液配制：將CRT粉末用pH 7.4的PBS（0.01 mol/L）溶解，制備50 μmol/L的樣品溶液。HSA、Ig G、PDL1、Hb蛋白用蒸餾水稀釋。

干粉狀核酸庫用50 mmol/L硼酸鹽溶液（pH 8.2） 溶解，配制成100 μmol/L核酸庫溶液。使用前將核酸庫在94℃變性10 min，然后以0.5℃/s 緩慢冷卻至25℃。

2.2.2?毛細(xì)管電泳篩選的條件及方法?選用75 μm熔融石英毛細(xì)管（有效長度/總長40.0 cm/50.2 cm），激光誘導(dǎo)熒光檢測器（激發(fā)波長/發(fā)射波長= 488 nm/520 nm）;電泳緩沖液：50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH 7.4）;孵育緩沖液：PBS緩沖液（含有0.1 mmol/L Ca2+、1 mmol/L Mg 2+及2 mmol/L K+，pH 7.4）;?37℃孵育15 min。孵育樣品進樣： 0.5 kPa，5 s;20 kV，25℃分離。收集電泳中的CRT-N30復(fù)合物餾分。

2.2.3?PCR擴增及產(chǎn)物的分離純化?將收集復(fù)合物餾分依次進行對稱PCR、不對稱PCR、乙醇沉淀濃縮和切膠回收，逐級獲得ssDNA篩選次級庫。將含上下游引物和TaqPCR酶的溶液與收集的CRT-N30復(fù)合物混合，進行對稱PCR擴增。條件： 94℃，1 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，30 s，35輪循環(huán)。改變上下游引物比例，進行不對稱PCR擴增，4輪循環(huán)。將無水乙醇與PCR產(chǎn)物混合均勻，4℃離心15 min（15000 r/min）后，將乙醇沉淀物進行凝膠電泳，電壓90 V。取出凝膠電泳的目標(biāo)條帶，加入 ddH2O和Tris 飽和酚，4℃離心 15 min（12000 r/min）。在上清液中加入三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V），4℃離心 5 min（12000 r/min）。加入20℃的無水乙醇和3 mol/L 醋酸鈉，混合后，4℃離心 15 min（12000 r/min）。棄去上層溶液，將離心管置于通風(fēng)櫥干燥至白色沉淀析出，得到1輪篩選后的次級核酸庫。對4輪篩選獲得的次級庫親和力進行評估，最終選擇第3輪篩選的PCR產(chǎn)物測序。

2.2.4?核酸序列分析與親和力分析?將第3輪篩選產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果用Mfold程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。對核酸庫或篩選的核酸序列進行FAM標(biāo)記，使用CE-LIF檢測核酸庫或核酸序列與CRT的復(fù)合物形成，按公式（1）計算核酸庫或Apt X與CRT復(fù)合物的平衡解離常數(shù)KD[26]。測定的解離常數(shù)越小，親和力越強。

其中，P0和DNA0為CRT和ssDNA的初始濃度。ADNA是游離ssDNA的峰面積，Adiss是電泳過程中CRT-ssDNA的解離區(qū)面積，ADNA·P是復(fù)合物峰面積。各峰面積由電泳圖直接確定，ADNA和Adiss的峰面積以游離ssDNA的遷移時間進行校正，ADNA·P峰面積以復(fù)合物峰的遷移時間進行校正。

按照公式（2）計算ssDNA核酸庫與CRT的結(jié)合比（BF）：

其中，I0為未加入CRT的游離ssDNA 峰面積，I1為加入CRT 后的游離ssDNA 峰面積。

2.2.5?等溫滴定量熱法驗證Apt 23的親和力

樣品池中加入240 μL CRT（1 μmol/L）溶液，滴定注射器中加入40 μL Apt 23（10 μmol/L）。滴定體積為2 μL，共20滴，滴定間隔為150 s，轉(zhuǎn)子攪拌轉(zhuǎn)速為750 r/min，使用Origin 7.0進行滴定后的數(shù)據(jù)處理。

2.2.6?納米金比色法驗證Apt 23的特異性?在96孔板的各孔中，依次加入50 μL膠體金、25 μL Apt 23、25 μL CRT及其它對照蛋白（400 nmol/L）。室溫孵育15 min后，在孔中分別加入10 μL 1 mol/L NaCl溶液。記錄96孔板中每孔的顏色變化，測定其紫外-可見吸光度。

2.2.7?激光共聚焦顯微鏡下基于Apt 23的細(xì)胞成像

取處于對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞，用0.25%胰酶消化。取其細(xì)胞懸液，均勻平鋪于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，細(xì)胞約占底部面積的90%～95%，PBS洗滌細(xì)胞2～3次。將250 nmol/L（500 μL）FAM-Apt 23與1×105個單層細(xì)胞置于冰上，避光孵育30 min后，用PBS洗滌3次。加入10 μg/mL Hoechst溶液染色細(xì)胞核5 min，將細(xì)胞再次洗滌后，均勻平鋪于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，加入500 μL PBS，進行激光共聚焦成像分析。細(xì)胞用Hoechst染色時，使用波長352 nm紫外光激發(fā)，發(fā)射波長為410～460 nm;用FITC染色時，使用波長488 nm的氬離子激光激發(fā)，發(fā)射波長為510～550 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?CRT核酸適配體篩選方法

采用CE-SELEX方法（圖1A）從隨機ssDNA文庫中篩選CRT的核酸適配體。篩選過程中，使用CE測定每輪次級庫與CRT 的結(jié)合比和解離常數(shù)（KD）。在1～3輪篩選時，結(jié)合比隨篩選輪數(shù)增加而增大，KD則減小（圖1B），說明篩選過程中，與CRT結(jié)合的核酸序列得到富集。3輪篩選后獲得解離常數(shù)為nmol/L級的CRT 次級庫，結(jié)合比達(dá)到最大。第4輪篩選未能進一步提高親和力，結(jié)合比反而降低，KD增大。在以往的CE-SELEX研究中，這種篩選波動情況也常有報道[27～29]。最終，將第3輪篩選獲得富集的ssDNA庫進行擴增及高通量測序。

3.2?候選核酸適配體的序列結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)高通量測序結(jié)果，對81938個序列中18個頻率較高的核酸序列進行多重序列比對和二級結(jié)構(gòu)分析。這18條序列中，有一些具有相似的二級結(jié)構(gòu)（電子版文后支持信息 圖 S1）。如Apt 2、Apt 12 和Apt 20 等含有3個小臂的大圓形結(jié)構(gòu)，Apt 23、Apt 38 和Apt 45 等含2～3個長臂的長條結(jié)構(gòu)。最終，本研究選擇了6 條具有不同特征結(jié)構(gòu)的序列（Apt 12、Apt 23、Apt 24、Apt 25、Apt 38和Apt 45）作為候選核酸適配體序列，其序列組成見表1。

3.3?候選核酸適配體的親和力和特異性分析

利用CE-LIF檢測FAM標(biāo)記的核酸適配體與CRT孵育的混合物，并通過公式（1）計算得到KD（表1）。上述6條核酸序列的KD在0.6～2.4 μmol/L范圍內(nèi)。其中，Apt 23的KD為（670 ± 56）nmol/L，親和力最強。利用等溫滴定量熱法（ITC）測定Apt 23的KD值，驗證其親和力。在25℃，用10 μmol/L Apt 23 滴定1 μmol/L CRT，基于非線性擬合方法求得KD為1.32 μmol/L，比CE法測定結(jié)果約大一倍，但仍達(dá)到μmol/L級（圖2）。CE法和ITC法的KD測定結(jié)果均表明，經(jīng)過3輪CE-SELEX篩選獲得的Apt 23對CRT具有良好的親和力。

進一步評估了Apt 23對CRT結(jié)合的特異性，檢測Apt 23是否可以識別CRT以及其它4種血清中重要的功能蛋白質(zhì)： Hb、HSA、IgG以及PDL1。CE-LIF檢測結(jié)果（圖3A）表明，加入CRT后，2.1 min形成Apt 23-CRT的復(fù)合物峰，并在Apt 23峰（4.4 min）前有復(fù)合物解離區(qū)峰（4.1 min）。加入相同濃度的其它4種蛋白，電泳圖都沒有明顯變化，說明Apt 23特異性識別CRT，形成了復(fù)合物。通過AuNPs比色法也可方便地驗證Apt 23的選擇性。由圖3B可見，當(dāng)分散的AuNPs體系（紅色）中加入400 nmol/L CRT，其與AuNPs 表面的Apt 23結(jié)合，導(dǎo)致分散的AuNPs 聚集變藍(lán)，而其它4種蛋白的加入均未使Apt-AuNPs混合體系變色。并且，Apt 23-AuNPs與CRT混合體系的吸光度比值（A520 nn/A620 nm）最小，低于其它陰性對照蛋白（圖3C）。上述結(jié)果表明，Apt 23可特異性識別CRT。此外，截短Apt 23得到Q2～Q5，其親和力與原序列Apt 23相似（電子版文后支持信息表S1）。其中，Q2和Q3也可特異性識別CRT（ 電子版文后支持信息 圖S2）。

3.4?CE-LIF法檢測血清中的CRT

分別用含有0.1 mmol/L Ca2+、20 mmol/L Mg2+及2 mmol/L K+的孵育緩沖液稀釋血清樣品，且保持孵育溫度為4℃（圖S3）。將Apt 23作為親和探針，加入稀釋50倍的人血清樣品，再將其與不同濃度的CRT孵育。隨著CRT濃度增加，復(fù)合物峰面積逐漸增大（圖4A）。CRT 濃度在1 nmol/L～1 μmol/L范圍內(nèi)與復(fù)合物峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為 y=9925.8334x+ 4173022.4929，R2=0.9880，檢出限可達(dá)到0.5 nmol/L（S/N=3）（圖4B）。上述結(jié)果表明，Apt 23結(jié)合CE可檢測復(fù)雜的血清基質(zhì)中微量的CRT。

3.5?激光共聚焦顯微鏡表征Apt 23 對細(xì)胞的識別

人源和鼠源的乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上含有CRT[30～34]。將Apt 23分別與正常鼠源乳腺細(xì)胞EpH4-Ev和鼠源乳腺癌模式細(xì)胞4T1孵育，評估Apt 23對靶細(xì)胞的特異性識別能力。以未經(jīng)篩選的初始核酸庫N30為對照組，比較篩選的適配體Apt 23與初始核酸庫對細(xì)胞的結(jié)合差異。利用Hoechst染細(xì)胞核確定細(xì)胞位置，以FAM標(biāo)記的Apt 23確定CRT所在位置。如圖5所示，與Apt 23 孵育后的細(xì)胞4T1邊緣有明亮、均勻的熒光信號，而EpH4-Ev 細(xì)胞則未檢測到熒光信號。初始核酸庫N30與兩種細(xì)胞孵育后，都未見產(chǎn)生明顯的熒光信號。結(jié)果表明，所篩選的Apt 23 可特異性地識別4T1細(xì)胞，與其表面的CRT有較強的結(jié)合，說明篩選的Apt 23可作為細(xì)胞水平的成像探針。

4?結(jié) 論

利用CE-SELEX法有效地篩選出靶向CRT的核酸適配體Apt 23，其對CRT具有良好的親和力和特異性，可以識別血清基質(zhì)中和乳腺癌細(xì)胞表面的CRT，因此可作為血清基質(zhì)中CRT的檢測探針和乳腺癌細(xì)胞的成像探針。

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