一株高效解鉀菌的篩選鑒定及其對煙草吸收鉀磷的影響

吳俊林 張正楊 李翔 栗衛(wèi)華 畢樂樂 馮國勝 王紅保 周權(quán) 郝浩浩 劉建豐 賈峰

摘要： 以河南省駐馬店市泌陽縣植煙區(qū)土壤為原料，從中篩選與鑒定了一株高效解鉀菌并對其進(jìn)行實驗室和煙田解鉀和溶磷試驗。結(jié)果表明，該解鉀菌為不動桿菌，實驗室驗證該菌株的解鉀和溶磷能力比較強(qiáng);煙草大田試驗表明，該解鉀菌能夠使土壤中的不溶性鉀溶解，供煙草吸收和生長需要，對煙葉中鉀含量的吸收與利用有協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，對煙草植株的生長有明顯的促進(jìn)作用，從而提高煙田煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于增加植煙的經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞： 解鉀菌;篩選;煙草;鉀吸收;磷吸收

中圖分類號： S572.06;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0276-04

前期研究表明，河南省駐馬店市泌陽縣植煙土壤里存在大量的緩效鉀和緩效磷，但在煙葉生長過程中不能被煙草吸收和利用[1]，這是造成煙葉中鉀含量較低的原因之一。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量化肥的施用，特別是多施氮磷、不施或少施鉀肥，使得北方土壤的缺鉀現(xiàn)象越來越嚴(yán)重[2];而土壤中95%的鉀為礦物鉀形態(tài)，可供植物吸收利用的速效鉀不超過2%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物解鉀菌能夠?qū)崿F(xiàn)礦物鉀的生物有效化利用，在延邊、云南、福建以及河南煙區(qū)都能夠分離出解鉀菌，能夠增加煙草的生長與品質(zhì)，提高煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入[4-7]。

解鉀菌別稱硅酸鹽細(xì)菌，是一類可以將土壤中難溶性的鉀（長石或云母等硅酸鹽）變?yōu)榭扇苄誀顟B(tài)供植物吸收利用的一類微生物。解鉀菌分泌有機(jī)酸是溶解硅酸鹽礦物并釋鉀的主要原因[8]。解鉀菌產(chǎn)生的特殊酶能破壞礦物晶格結(jié)構(gòu)，或因其表面的物化作用而使鉀釋放出來[9-10]。有些解鉀菌菌株能分泌大量相對分子量小的有機(jī)酸和胞外多糖，胞外多糖可將解鉀菌與礦物包埋在一起使礦物表面的有機(jī)酸濃度大大增加，從而使礦物中的鉀被釋放出來[11]。也有學(xué)者提出了細(xì)菌礦物復(fù)合體綜合作用假說，即細(xì)菌通過表面多糖與礦物質(zhì)形成細(xì)菌礦物復(fù)合體，細(xì)菌對礦物表面疏松部位產(chǎn)生溶蝕作用，溶蝕后的小顆粒包裹在有機(jī)質(zhì)中使接觸面增大，加劇溶蝕作用，該復(fù)合體的微環(huán)境發(fā)生改變，如有機(jī)酸富集、氧化還原電位變化等，使溶蝕進(jìn)一步擴(kuò)大，礦物顆粒晶格發(fā)生形變或崩解，在氫離子的幫助下，鉀離子釋放，而細(xì)菌吸收鉀離子，促進(jìn)鉀離子的進(jìn)一步釋放[12]。

磷是DNA、RNA、ATP和磷酸類脂等生命大分子的重要組成部分，也是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)[13-16]，土壤中的磷濃度成為土壤肥力最重要的限制性因素之一[17-18]。解鉀菌一般也有溶出土壤中不溶性礦物磷，提高土壤磷肥力的能力[19-20]。溶磷微生物肥料的施用，能夠緩解長期施用化學(xué)肥料引起的土壤板結(jié)等問題，而高效、穩(wěn)定的溶磷菌株的獲取，成為構(gòu)建微生物磷肥的關(guān)鍵[21-25]。

本研究通過從植煙土壤中分離出的解鉀菌，觀察其形態(tài)特征，在植煙土壤注施該菌種，檢測其解鉀和溶磷效果并探討其對大田煙草的生長和煙葉中鉀和磷含量的影響，分析該菌種與煙草根系的互作關(guān)系，為進(jìn)一步理解煙草根際微生物群落的互作機(jī)制、微生物菌肥的開發(fā)和利用、強(qiáng)化煙葉特色提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，以期利用微生物菌肥解決河南省煙區(qū)煙葉鉀含量偏低的問題。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

不動桿菌（Acinetobacter sp.）菌種分離自河南省駐馬店市泌陽縣煙區(qū)植煙根際土壤，由河南工業(yè)大學(xué)河南省工業(yè)微生物菌種保藏與選育工程實驗室選育、保藏和提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體和菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

將菌株劃線分離，形成單菌落。接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h，于對數(shù)生長期進(jìn)行革蘭氏染色觀察。接種于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用火焰原子吸收分光光度法測定鉀溶液的濃度和吸光度，繪制鉀溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取恒質(zhì)量為0.191 0 g的氯化鉀，溶解到100 mL的容量瓶中，鉀濃度為 1 000 μg/mL，分別準(zhǔn)確稀釋到1、2、3、4 μg/mL進(jìn)行檢測。

1.2.3 解鉀菌的溶磷能力檢測

菌液的培養(yǎng)條件參考屈建航等的方法[26]，溶液中磷含量的檢測采用鉬藍(lán)比色法[16]，培養(yǎng)液pH值檢測采用PHS-3C酸度計，采用無菌培養(yǎng)液代替菌液作為試驗對照。

1.2.4 解鉀菌制備

將不動桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，直接采用培養(yǎng)基備用。試驗在河南省駐馬店市煙草公司泌陽縣分公司試驗田進(jìn)行，每個小區(qū)面積為333.5 m2。鉀肥施用量是常規(guī)施肥的80%，每個處理重復(fù)3次，按隨機(jī)區(qū)組排列，常規(guī)施肥，清水處理作為對照。配制解鉀菌處理為高、中、低3個，用量分別為37.5、75.0、112.5 L/hm2。移栽前土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果見文獻(xiàn)[27]?？緹熎贩N為云煙87，分別于旺長期和打頂后進(jìn)行烤煙農(nóng)藝性狀情況調(diào)查，取烤煙根際土壤測定微生物數(shù)量，對圓頂期土壤進(jìn)行全面理化性質(zhì)分析。取樣均采用五點取樣法。

1.2.5 土壤微生物數(shù)量測定

細(xì)菌計數(shù)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌計數(shù)采用改良高氏一號培養(yǎng)基，真菌計數(shù)采用馬丁氏培養(yǎng)基，解鉀菌計數(shù)采用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基。

1.2.6 土壤化學(xué)成分的檢測

土壤中全氮含量的測定參照NY/T 1121.24—2012《土壤檢測 第24部分：土壤全氮的測定 自動定氮儀法》進(jìn)行;全磷含量的測定參照NY/T 88—1988《土壤全磷測定法》進(jìn)行;全鉀含量的測定參照NY/T 87—1988《土壤全鉀測定法》進(jìn)行;水解性氮含量的測定參照LY/T 1228—2015《森林土壤氮的測定》進(jìn)行;有效磷含量的測定參照NY/T 1121.7—2014《土壤檢測 第7部分：土壤有效磷的測定》進(jìn)行;速效鉀和緩效鉀含量的測定參照NY/T 889—2004《土壤速效鉀和緩效鉀含量的測定》進(jìn)行。

1.2.7 煙葉中化學(xué)成分的檢測

煙葉中全氮含量的測定參照NY/T 2419—2013《植株全氮含量測定 自動定氮儀法》進(jìn)行;全鉀含量的測定參照NY/T 2420—2013《植株全鉀含量測定 火焰光度計法》進(jìn)行;全磷含量的測定參照NY/T 2421—2013《植株全磷含量測定 鉬銻抗比色法》進(jìn)行;總煙堿含量的測定參照YC/T 246—2008《煙草及煙草制品 煙堿的測定 氣相色譜法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌的形態(tài)鑒定

由圖1-A可知，該菌落經(jīng)過2 d培養(yǎng)，分離得到的菌株呈乳白色、不透明，邊緣整齊，表面光滑，無彈性不能成絲，較耐高溫，有臭味，實驗室記為BYT-1。由圖1-B可知，菌體革蘭氏染色呈陰性，鏈珠狀，為不動桿菌。

2.2 解鉀菌溶液中鉀離子濃度的檢測

在亞歷山德羅夫液體培養(yǎng)基中經(jīng)過4 d培養(yǎng)測定溶液中鉀含量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出吸光度（y）和濃度（x）之間的關(guān)系：y=0.164 1x，r2=0.997 3，以此為基準(zhǔn)方程，根據(jù)待測樣品的吸光度測量出 BYT-1的濃度，CK處理的鉀離子濃度為 0.127 μg/mL，BYT-1處理的鉀離子濃度為 4.951 μg/mL，明顯高于對照，解鉀菌培養(yǎng)時間越長，溶液中鉀離子濃度越大。

2.3 解鉀菌的溶磷曲線

由圖2可知，菌種的溶磷曲線表現(xiàn)為30 h之前較為緩慢;30～100 h時溶磷效果較快，在培養(yǎng)70 h時無機(jī)磷培養(yǎng)基中的磷含量為10.0 μmol/mL，達(dá)到最高值;隨后有所下降。培養(yǎng)液中的pH值變化表現(xiàn)為在30 h之前pH值下降較緩慢，30～70 h之間pH值下降與溶液中磷濃度呈負(fù)相關(guān)，隨著磷含量的上升，pH值不斷下降，在70 h時達(dá)到3.8，隨后不斷上升至5.5左右。

2.4 解鉀菌對植煙土壤中解鉀菌及微生物總量的影響

由圖3可知，隨著土壤注施解鉀菌處理濃度的增加，土壤中解鉀菌的數(shù)量也不斷地增加，對照為1.70×103個/g，高濃度處理為4.05×103個/g，高濃度處理是對照的2.38倍;土壤中微生物總量也有增加，對照為1.345×106個/g，高濃度處理為 2.145×106個/g，高濃度處理是對照的1.59倍，表明土壤中增施解鉀菌液能有效增加土壤中微生物總量，其原因可能與該菌能夠與土壤中微生物友好共生有關(guān)。

2.5 解鉀菌對植煙土壤主要礦質(zhì)元素含量的影響

由表1可以看出，土壤注施解鉀菌處理對土壤中的全磷含量影響不顯著;中濃度處理土壤中的全氮含量顯著高于對照;解鉀菌處理后土壤中的全鉀含量隨著解鉀菌濃度的增加而顯著低于對照，表明解鉀菌能夠有效地降解煙株根系周圍土壤中的全鉀;土壤注施解鉀菌能夠降低植煙土壤中的有效磷含量，但與菌液的濃度不成正比，可能與解鉀菌在解磷時的機(jī)制比較復(fù)雜有關(guān);土壤注施解鉀菌對植煙土壤中水解性氮含量的影響不顯著，可能與解鉀菌對氮元素的分解有局限性有關(guān);隨著土壤注施解鉀菌菌液濃度的增加，植煙土壤中速效鉀含量比對照顯著升高，表明解鉀菌的含量與溶解全鉀的能力呈正相關(guān)。

2.6 解鉀菌對煙草生長的影響

由表2可以看出，在煙株的旺長期，土壤注施中、高濃度解鉀菌菌液處理的煙草株高顯著高于對照和低濃度處理， 表明解鉀菌能有效促進(jìn)煙草植株的高度生長;土壤注施低、中濃度解鉀菌處理的煙草葉數(shù)顯著多于對照，而高濃度解鉀菌處理與對照相比差異不顯著; 土壤注施高濃度解鉀菌處理的煙草最大葉長顯著高于對照，而低、中濃度解鉀菌處理與對照的差異均不顯著;土壤注施低、高濃度解鉀菌處理的煙草最大葉寬顯著高于中濃度處理和對照。

煙草打頂之后進(jìn)入煙株生長的中后期，土壤注施中、高濃度解鉀菌處理的株高顯著高于對照和低濃度處理;隨著成熟煙葉的采摘，煙株葉片數(shù)量明顯減少，高濃度處理煙株的葉片數(shù)量顯著多于低、中濃度處理和對照，表明高濃度解鉀菌處理可推遲煙葉的衰老;煙株生長的中后期，低、中、高濃度解鉀菌處理的最大葉長和最大葉寬與對照相比差異均不顯著。

2.7 解鉀菌對烤后煙葉中主要理化指標(biāo)及其產(chǎn)量的影響

由表3可以看出，隨著土壤注施解鉀菌菌液濃度的增加，烤煙煙葉中全磷和全鉀含量顯著增加，對全氮含量的影響不顯著，氯和總煙堿的含量有所下降，但差異不顯著。土壤注施解鉀菌處理能夠提高烤煙產(chǎn)量，隨著注施解鉀菌菌液濃度的增加，產(chǎn)量由2 856.0 kg/hm2提高到3 177.0 kg/hm2，煙葉的產(chǎn)量提高321.0 kg/hm2，增加了11.24%。煙葉增加的產(chǎn)量在于葉片的數(shù)量和葉片的大小增加2個方面，同時，土壤注施高濃度的解鉀菌菌液也延長了煙葉的生長期，增加了煙葉產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本試驗分離出的解鉀菌為不動桿菌，實驗室驗證該菌株的解鉀和溶磷能力比較強(qiáng)。利用該解鉀菌在河南省駐馬店市泌陽縣煙草大田進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，該菌能夠有效增加土壤中的可溶性鉀含量，供煙草吸收和生長需要，對煙葉中鉀含量的吸收和利用有協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，對煙草植株的生長有明顯的促進(jìn)作用，從而提高煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，有 利于提高植煙的經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳俊林，王璀璨，畢樂樂，等. 增施葉面鉀肥對烤煙煙葉鉀積累和利用的研究[J]. 農(nóng)技服務(wù)，2017，34（5）：16-18.

[2]黨 雯，郜春花，張 強(qiáng)，等. 解鉀菌的研究進(jìn)展及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（8）：921-924.

[3]連 賓. 硅酸鹽細(xì)菌的解鉀作用研究[M]. 貴陽：貴州科技出版社，1998.

[4]張書泰，楊秋明，陳 欽，等. 福建南平不同植煙土壤微生物數(shù)量與養(yǎng)分狀況分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（31）：76-81.

[5]趙 輝，趙銘欽，程玉淵，等. 河南南陽煙區(qū)不同類型土壤的根際和非根際微生物及酶活性變化[J]. 土壤通報，2010（5）：1057-1063.

[6]韓富根，宋鵬飛，董祥洲，等. 延邊煙區(qū)不同土壤的根際土壤微生物生態(tài)效應(yīng)研究[J]. 土壤，2010，42（1）：33-38.

[7]羅華元，常壽榮，王紹坤，等. 云煙高端品牌植煙區(qū)根際土壤高效解鉀菌的篩選[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（5）：1813-1817.

[8]蔣先軍，黃昭賢，彭盛德，等. 硅酸鹽細(xì)菌的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 世界農(nóng)業(yè)，1998（5）：28-31.

[9]Vessey J K. Cultivar differences in assimilate partitioning and capacity to maintain N2 fixation rate in pea during pod-filling[J]. Plant and Soil，1992，139（2）：185-194.

[10]Vessey J K，Layzell D B. Regulation of assimilate partitioning in soybean. Initial effects following change in nitrate supply[J]. Plant Physiology，1987，83（2）：341-348.

[11]Podgorskiǐ V S. Effect of the pH of the medium on the growth and chemical composition of the methanol-assimilating yeast Candida boidinii[J]. Mikrobiologiia，1981，50（6）：1084-1087.

[12]連 賓，傅平秋，莫德明，等. 硅酸鹽細(xì)菌解鉀作用機(jī)理的綜合效應(yīng)[J]. 礦物學(xué)報，2002，22（2）：179-183.

[13]呂淑芳，彭 媛，江 靜. ACS2參與擬南芥幼苗根生長響應(yīng)低磷反應(yīng)的機(jī)制[J]. 植物生理學(xué)報，2017，53（8）：1435-1443.

[14]魏凌云，劉生鵬，王建華，等. 生命從磷開始[J]. 生命的化學(xué)，2016，36（3）：298-302.

[15]林立金，廖明安，梅洛銀，等. 不同生態(tài)型小飛蓬對鎘脅迫砧木櫻桃植株磷鉀吸收的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，21（12）：1565-1568.

[16]趙玉芬. 磷與生命化學(xué)[J]. 科學(xué)（中文版），2000（2）：61-62.

[17]楊紹瓊，黨廷輝，戚瑞生，等. 低分子量有機(jī)酸對不同肥力土壤磷素的活化作用[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2012，30（4）：60-64.

[18]李慶逵. 從土壤肥力、磷礦性質(zhì)及農(nóng)業(yè)條件來看中國的磷肥問題[J]. 科學(xué)通報，1959（24）：18-21.

[19]戴沈艷，賀云舉，申衛(wèi)收，等. 一株高效解磷細(xì)菌的紫外誘變選育及其在紅壤稻田施用效果[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2010，19（7）：1646-1652.

[20]徐旗升. 如何提高土壤中磷肥的利用率[J]. 安徽農(nóng)業(yè)，2002（11）：26-26.

[21]屈建航，周 佳，李海峰，等. 一株高效聚磷細(xì)菌的分離及其聚磷特性研究[J]. 生物技術(shù)，2014，24（3）：57-60.

[22]陳 哲，趙永鋒，張建嶺. 長期施用復(fù)合微生物肥對農(nóng)田土壤速效養(yǎng)分的影響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（19）：241-241，245.

[23]屈建航，王福芳，晏加照，等. 西流湖界面沉積物中溶磷細(xì)菌篩選及其溶磷能力研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，46（5）：584-588.

[24]李海峰，李志建，屈建航. 解磷微生物及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：108-110.

[25]張成林，劉麗麗. 施用不同肥料對土壤狀況的影響[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，28（2）：5-7，10.

[26]屈建航，張璐潔，符運會，等. 1株高效溶磷細(xì)菌的分離、鑒定和溶磷能力研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，47（3）：55-58，91.

[27]吳風(fēng)光，王豹祥，汪 健，等. 抗生菌肥對植煙土壤和烤煙生產(chǎn)的影響[J]. 土壤，2010，42（1）：53-58.

收 稿日期：2019-02-21

基金項目：河南省駐馬店市煙草公司科技計劃;河南工業(yè)大學(xué)?；A(chǔ)研究重點培育基金（編號：2013JCYJ05）。

作者簡介：吳俊林（1986—），男，河南確山人，助理農(nóng)藝師，主要從事煙葉生產(chǎn)與管理研究。E-mail：gryx1226@126.com。

通信作者：郝浩浩，碩士，助理農(nóng)藝師，主要從事煙葉生理生化研究。E-mail：haohh108@126.com。