Cep164基因?qū)P110在中心粒上表達(dá)的影響

王春花

摘要：Cep164基因是參與纖毛形成的重要基因之一，為研究Cep164基因與CP110的關(guān)系，探討CP110在Cep164調(diào)節(jié)纖毛形成中的作用，通過(guò)免疫熒光染色與Western印跡法確定Cep164基因缺失時(shí)CP110基因的表達(dá)情況，利用免疫共沉淀法確認(rèn)Cep164與CP110蛋白相互作用的關(guān)系。結(jié)果表明，Cep164基因的缺失導(dǎo)致CP110表達(dá)增高，Cep164與CP110蛋白無(wú)直接相互作用關(guān)系，Cep164是通過(guò)間接方式調(diào)控CP110在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，CP110降解失敗可能為Cep164基因缺失導(dǎo)致纖毛生成障礙的原因之一。

關(guān)鍵詞：Cep164基因;CP110基因;中心粒

中圖分類(lèi)號(hào)：Q132.7? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）02-0166-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.037? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Cep164 gene indirectly regulate CP110 expression in the centriole

WANG Chun-hua

（School of Life Science and Technology，Mudajiang Normal University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）

Abstract： Cep164 is one of the important genes involved in ciliogenesis. In order to study the relationship of the Cep164 and CP110， explored the role of CP110 in the regulation of ciliogenesis by Cep164. Immunofluorescence staining and Western Blotting were used to determine the expression of CP110 gene in the Cep164 gene knockout cell and embryo of mice. The interaction between the Cep164 and CP110 protein was confirmed by COIP. The results showed the Cep164 gene mutation increased CP110 gene expression. Cep164 regulated the expression of CP110 in cells indirectly. CP110 degradation failure could be the one of reason for the Cep164 gene mutation cause cilia dysfunction.

Key words： Cep164 gene; CP110 gene; centriole

Cep164是中心體激活元件Cep家族一員，位于母中心粒基體末端，參與纖毛的形成過(guò)程[1]。Moumita等[2]發(fā)現(xiàn)Cep164基因在纖毛相關(guān)腎消耗病患者中發(fā)生純合子點(diǎn)突變。研究人員通過(guò)siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞中Cep164基因證明了Cep164基因與纖毛形成過(guò)程中囊泡在母中心?；w的定位有關(guān)，當(dāng)Cep164基因突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中纖毛缺失，但其參與纖毛形成的機(jī)制仍然不明確[3]。本研究在基因打靶法構(gòu)建Cep164基因敲除鼠過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Cep164基因完全缺失時(shí)小鼠將于E14.5 d前死亡[4]。E14.5 d前存活的Cep164-/-小鼠胚胎纖毛缺失，為確定Cep164基因缺失導(dǎo)致纖毛缺失的機(jī)制，對(duì)與纖毛形成附件蛋白進(jìn)行間接免疫熒光染色評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)Cep164-/-小鼠胚胎細(xì)胞中纖毛形成appendage Ftm、Odf2、Cep290、Cep120、Ofd1和Ninein位置及表達(dá)量無(wú)明顯變化，但CP110在母中心粒和子中心粒均表達(dá)的比例增多。有關(guān)報(bào)道顯示CP110蛋白對(duì)中心粒的復(fù)制及纖毛的形成具有拮抗作用，CP110和Cep97可相互協(xié)調(diào)抑制纖毛軸絲的組裝[5]。CP110能導(dǎo)致過(guò)長(zhǎng)的中心粒現(xiàn)象，并且發(fā)現(xiàn)基因敲除后通過(guò)細(xì)胞饑餓法無(wú)法促進(jìn)纖毛形成[5-8]。本研究通過(guò)間接免疫熒光染色與Western印跡法確定Cep164基因缺失時(shí)CP110的表達(dá)情況，利用免疫共沉淀法確認(rèn)Cep164與CP110是否存在直接調(diào)節(jié)作用，探討Cep164基因缺失導(dǎo)致小鼠胚胎纖毛缺失的機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)動(dòng)物

Cep164基因敲除雜合子小鼠（Cep164+/-）饋贈(zèng)于美國(guó)康奈爾大學(xué)。

1.2? 試驗(yàn)試劑

鼠抗兔Cep164，CP110（sigma，USA），γ-tubulin，a-tubulin（sigma，USA），間接熒光染色二抗CyTm3-conjugated Affinipure Goat Anti-mouse Ig G（H+L），Alexa Fluor 488-conjugated Affinipure Goat Anti-rabbit Ig G（H+L）（Jackon immuno research Co. USA），6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar，USA），100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Costar，USA）等。PLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質(zhì)粒（饋贈(zèng)于美國(guó)康奈爾大學(xué)）。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? Cep164基因缺失胚胎的制備? Cep164基因敲除雜合子雌鼠（Cep164+/-）與Cep164+/-雄鼠進(jìn)行雜交，交配后雌鼠陰道栓出現(xiàn)記作交配成功，計(jì)算孕期，雌鼠懷孕8.5 d，斷頸處死后，剝離胎鼠，通過(guò)基因型鑒定獲得WT與Cep164-/-胚胎。

1.3.2? 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）的分離培養(yǎng)與間接免疫熒光染色? 根據(jù)原代細(xì)胞培養(yǎng)方法制備野生型（WT）與Cep164-/-胚胎MEFs，加入包備蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)48 h，甲醇溶液固定5 min，PBS溶液洗滌后，加入一抗混合液（γ-tubulin，CP110）100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST溶液洗滌3次后，加入二抗100 μL（cyTm3抗鼠抗體1∶250，Alexa Fluor 488抗兔抗體1∶250）避光室溫孵育1 h，DAPI染色液封片，觀察拍照。

1.3.3? 冰凍組織切片的制備與間接免疫熒光染色? WT與Cep164-/-胚胎于4%多聚甲醛中4 ℃固定1 h，30%蔗糖脫水，OCT包埋后制備切片（10 μm）。切片組織封閉液封閉后，加入一抗混合液4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗孵育1 h， DAPI染色液封片，觀察拍照。

1.3.4? 小鼠胚胎Cep164、CP110蛋白表達(dá)的測(cè)定? 取Cep164-/-和WT胚胎加入300 μL RAPI裂解液制成勻漿，4 ℃下16 000 r/min離心30 min。取60 μg加入5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟丙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗Cep164、CP110、a-tub，4 ℃孵育過(guò)夜。膜經(jīng)PBST溶液漂洗后放于1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。暗盒沖洗膠片，掃描并用Quantity One軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5? 免疫共沉淀法檢測(cè)Cep164與CP110蛋白的關(guān)系? 分別取PLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質(zhì)粒1 μg加入2.5 mol/L的CaCl2溶液，2×HBS溶液各100 μL混勻。將混合液室溫靜置30 min后，逐滴均勻加入293細(xì)胞（每孔細(xì)胞密度達(dá)25%～30%）中。在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h換培養(yǎng)液，72 h后每孔細(xì)胞加300 μL NP40裂解液4 ℃下16 000 r/min離心20 min，取上層液250 μL于40 μL Flag抗體-polyA-beads孵育2 h，洗滌后加入30 μL的1×loading Buffer溶液，37 ℃加熱5 min，離心后取上層液上樣，進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)，方法同上。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Cep164基因敲除抑制CP110在細(xì)胞循環(huán)中的降解

如圖1A所示，在WT與Cep164-/-細(xì)胞中心粒上均觀察到CP110表達(dá)。計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞CP110表達(dá)比例，發(fā)現(xiàn)Cep164-/-細(xì)胞100%表達(dá)在兩個(gè)中心粒，而WT細(xì)胞僅為66%，有34%的細(xì)胞CP110僅表達(dá)在一個(gè)中心粒上（圖1B）。如圖1C所示，Cep164-/-胚胎中的CP110蛋白的表達(dá)量高于WT，與圖1A結(jié)果一致。由圖1D發(fā)現(xiàn)，Cep164-/-胚胎神經(jīng)管周?chē)行牧Ｈ看嬖贑P110表達(dá)，WT胚胎一些中心粒中無(wú)CP110表達(dá)（如箭頭所示），Cep164-/-胚胎神經(jīng)管中CP110表達(dá)密度高于WT胚胎，結(jié)果與圖1B結(jié)果一致。Cep164基因影響了CP110在中心粒上的表達(dá)，這可能與Cep164基因的缺失阻礙了CP110在細(xì)胞循環(huán)上的降解有關(guān)，從而導(dǎo)致了CP110在Cep164-/-細(xì)胞中的高表達(dá)。

2.2? Cep164通過(guò)間接作用調(diào)控CP110在細(xì)胞循環(huán)中的降解

如圖2A所示，CP110的兩個(gè)表達(dá)點(diǎn)位于細(xì)胞核的中心粒上，每個(gè)表達(dá)點(diǎn)有兩個(gè)點(diǎn)組成，Cep164位于細(xì)胞核上側(cè)CP110表達(dá)點(diǎn)中的一個(gè)點(diǎn)上，說(shuō)明Cep164在細(xì)胞中表達(dá)位置臨近或位于CP110上。為證明Cep164是否與CP110直接作用，通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染FLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質(zhì)粒細(xì)胞均表達(dá)Cep164與CP110蛋白，但通過(guò)Flag-bead拉下的蛋白中并未檢測(cè)到CP110（圖2B），說(shuō)明Cep164與CP110蛋白無(wú)直接相互作用。

3? 討論

在前期基因打靶法構(gòu)建Cep164基因敲除鼠過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cep164基因完全缺失時(shí)纖毛缺失，與其他研究人員通過(guò)siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞中Cep164基因的纖毛缺失表型一致[1]。研究通過(guò)細(xì)胞、組織間接免疫熒光染色與蛋白檢測(cè)均證實(shí)Cep164基因缺失導(dǎo)致CP110在中心粒上的表達(dá)上調(diào)。CP110蛋白表達(dá)在中心體的兩個(gè)中心粒上，是控制中心粒長(zhǎng)度與纖毛形成的重要基體附件蛋白之一[9-11]，對(duì)纖毛的形成起到抑制作用，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G0期間，母中心粒上CP110蛋白通過(guò)TTBK2介導(dǎo)降解，解除對(duì)纖毛形成的抑制[12]。本研究結(jié)果表明，CP110在Cep164基因缺失組中表達(dá)上調(diào)，而纖毛表達(dá)缺失，可能是Cep164基因敲除阻礙了CP110蛋白的降解過(guò)程，表現(xiàn)為Cep164-/-細(xì)胞中母細(xì)胞表達(dá)CP110比例增加。本研究對(duì)胚胎中CP110蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，Cep164/-胚胎中CP110蛋白表達(dá)高于WT胚胎，進(jìn)一步說(shuō)明Cep164基因突變抑制了CP110蛋白降解。在間接熒光染色圖片上觀察到CP110與Cep164在表達(dá)位置上有重疊，但由于間接熒光染色的局限性，不能確定Cep164直接或間接參與CP110蛋白的降解。本研究通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)Cep164與CP110蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cep164與CP110蛋白無(wú)直接相互作用，說(shuō)明Cep164基因通過(guò)間接方式參與CP110降解。Oda等[13]報(bào)道與TTBK2需與Cep164結(jié)合定位中心粒，參與纖毛形成過(guò)程。Cep164基因敲除導(dǎo)致CP110蛋白的降解失敗，可能是由于G0期間，Cep164基因參與TTBK2蛋白募集到母中心粒上，Cep164基因敲除導(dǎo)致TTBK2蛋白募集失敗，導(dǎo)致CP110在母中心粒上無(wú)法降解。