稻米直鏈淀粉含量的96微孔高通量快速測(cè)定方法

陳瑩 楊瑰麗 郭濤 吳銳 李日文 黃翠紅 周丹華 王慧

摘要： 直鏈淀粉含量的快速高通量測(cè)定方法對(duì)國際標(biāo)準(zhǔn)法（簡稱“國際法”，BS EN ISO6647-2：2015《稻米 直鏈淀粉含量的測(cè)定 第2部分 常規(guī)方法》）進(jìn)行了改良，可以極大地提高水稻育種材料的篩選效率、適應(yīng)當(dāng)前水稻稻米品質(zhì)育種的新需求。結(jié)果表明，高通量法測(cè)得的吸光度與直鏈淀粉含量有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.991 1，該方法直鏈淀粉含量的測(cè)定值與國際法的測(cè)定值無顯著差異;同時(shí)，高通量法還具有簡單、易操作、樣品量少、批量（96個(gè)樣本）測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，能用于水稻誘變?nèi)后w后代或品種選育過程中的海量株系大規(guī)模初篩，可極大地提高稻米品質(zhì)研究的效率。

關(guān)鍵詞： 大米;直鏈淀粉含量;96微孔高通量快速測(cè)定方法;吸光度;相關(guān)性

中圖分類號(hào)： TS210.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0185-04

大米是世界上最重要的糧食作物之一，我國作為大米最重要的生產(chǎn)國和消費(fèi)國，對(duì)大米的品質(zhì)也提出了越來越高的要求[1]。直鏈淀粉作為大米的重要組成，一直被認(rèn)為是影響大米蒸煮食味品質(zhì)的關(guān)鍵因素[2-4]。直鏈淀粉是D-葡萄糖基通過 α-（1，4） 糖苷鍵連接而成，空間構(gòu)想卷曲成螺旋形，是帶有少量α-（1，6）分支（小于0.1%）的線性小分子[5-6]。一般來說，大米中直鏈淀粉含量高，米飯偏硬，飯粒干燥而蓬松，色澤較暗;相反，米飯較柔軟而有彈性，飯粒光澤度好[7]。

目前，國內(nèi)外測(cè)定直鏈淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有以下3種：國際標(biāo)準(zhǔn)BS EN ISO6647-2：2015《稻米 直鏈淀粉含量測(cè)定 第2部分 常規(guī)方法》（簡稱“國際法”）、國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測(cè)定》、原農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NYT 2639—2014《稻米直鏈淀粉的測(cè)定 分光光度法》。這3種標(biāo)準(zhǔn)方法的原理都是利用碘比色法，主要區(qū)別在于脫脂及顯色步驟等方面。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定須要對(duì)材料進(jìn)行甲醇溶液回流抽提脫脂，此步驟操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間、技術(shù)性強(qiáng)，且上述3種方法均需要較多的樣品以及試劑，這都不利于對(duì)大批量樣品實(shí)施高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

基于直鏈淀粉廣泛的應(yīng)用前景，以及其含量在評(píng)價(jià)糧食品質(zhì)和農(nóng)業(yè)選種、育種時(shí)的實(shí)際意義，本研究報(bào)道一種結(jié)合微孔板分光光度計(jì)高通量、快速測(cè)定稻米直鏈淀粉含量的方法。與以上3種方法相比，樣品前期處理不須脫脂，簡單易行;所需樣品量少，最少僅需10 mg;樣品的糊化和顯色步驟均在 2 mL 離心管中進(jìn)行，易于操作，測(cè)定周期大大縮短;可以一次完成96個(gè)樣品的測(cè)量，單位時(shí)間內(nèi)（1 d）可測(cè)定多個(gè)批次樣品，尤其適用于大規(guī)模的突變體及育種材料的直鏈淀粉含量的初篩。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蒸餾水;95%乙醇溶液;氫氧化鈉溶液：1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液、0.09 mol/L氫氧化鈉溶液;1 mol/L乙酸溶液;碘試劑：稱?。?.000±0.005） g碘化鉀，加適量的水以形成飽和溶液，加入（0.200±0.001） g碘，碘全部溶解后溶液定量移至100 mL容量瓶中，搖勻;已知直鏈淀粉含量的大米粉標(biāo)準(zhǔn)品：中國水稻研究所;試驗(yàn)用的12個(gè)品種分別為華航絲苗、勝巴絲苗、華航33號(hào)、象牙香占、興寧黑糯、華航31號(hào)、黃廣華占1號(hào)、合莉油占、金農(nóng)絲苗、桂育9號(hào)、桂禾豐、美香占2號(hào)，分別對(duì)應(yīng)樣1 至樣12。

1.2 試驗(yàn)原理

將大米粉碎至細(xì)粉以破壞淀粉的胚乳結(jié)構(gòu)，使其易于分散及糊化，將試樣分散在氫氧化鈉溶液中，向一定量的試樣分散液中加入碘試劑，大米淀粉與碘形成顯色復(fù)合物，在波長620 nm處測(cè)定顯色復(fù)合物的吸光度，其吸光度與直鏈淀粉含量成正比。

1.3 試樣的制備

原始稻谷樣品收獲后在實(shí)驗(yàn)室常溫放置3個(gè)月。經(jīng)礱谷、碾米過程制成精米，取至少10 g精米，用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末，過100目篩，置于密封袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 按國際法處理樣品

稱?。?00±0.5） mg試樣于100 mL錐形瓶中，小心加入1.0 mL乙醇溶液到試樣中，將粘在瓶壁上的試樣沖下。移取 9.0 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液到錐形瓶中，并輕輕搖勻，隨后將混合物在沸水浴中加熱10 min或在封口瓶中靜置過夜以分散淀粉，取出冷卻至室溫（如果是采取加熱方式分散淀粉）。轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中。加蒸餾水定容后，劇烈振蕩混勻。

準(zhǔn)確移取0.5 mL樣品溶液到預(yù)先加入5 mL水的20 mL帶蓋的比色管中，加0.1 mL乙酸溶液，搖勻，再加入0.2 mL碘試劑，最后加入4.2 mL水至比色管中，使液體容積達(dá)到10 mL，搖勻，用空白溶液調(diào)零，利用7239G型可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）在620 nm處測(cè)定其吸光度（表1）。

1.4.2 按高通量法處理樣品

稱取（10±0.2） mg試樣于2 mL離心管中，小心加入0.1 mL乙醇溶液到試樣中，再移取0.9 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液到離心管中，渦旋，混勻，隨后順時(shí)針離心約5 s，并置于其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)的GL-1800型干式恒溫器中85 ℃加熱20 min以分散淀粉，取出冷卻至室溫。

準(zhǔn)確移取0.01 mL樣品溶液到預(yù)先加入約 2 mL 水的2 mL離心管中，加0.02 mL乙酸溶液，搖勻，再加入0.04 mL碘試劑，搖勻，靜置 10 min，用空白溶液調(diào)零，使用移液槍準(zhǔn)確移取4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣以及91個(gè)待測(cè)的樣品各300 μL至96孔塑料微孔板中，借助微孔板分光光度計(jì)（美國伯騰儀器有限公司）在620 nm處測(cè)定吸光度（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法操作過程的差異分析

國際法和高通量法測(cè)定大米直鏈淀粉含量的差異主要表現(xiàn)在使用的材料與試劑用量、測(cè)定時(shí)間等方面。前者對(duì)試劑以及去離子水消耗大，測(cè)量耗時(shí)長;而后者測(cè)量耗時(shí)短，涉及的試劑用量少且更易操作。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取直鏈淀粉含量分別為0.4%、10.6%、16.2%、26.5%的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)利用本試驗(yàn)的高通量法與國際法測(cè)定其吸光度，國際法參照國際標(biāo)準(zhǔn)BS EN ISO6647—2：2015《稻米 直鏈淀粉含量測(cè)定 第2部分 常規(guī)方法》，所測(cè)結(jié)果繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。國際法的線性相關(guān)系數(shù)r2為0.999 7，高通量法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r2為0.991 1，說明2種方法測(cè)得的吸光度均與直鏈淀粉含量有良好的線性關(guān)系。

2.3 2種方法的顯著性分析

分別按國際法和高通量法測(cè)定12份大米樣品的直鏈淀粉含量，每份材料設(shè)置6個(gè)平行樣，取6次測(cè)定值的平均數(shù)為最終結(jié)果（表2）。用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析結(jié)果，得到P值=0.445 9>0.05，說明直鏈淀粉含量測(cè)定的國際法與高通量法之間并無顯著性差異。

2.4 2種方法測(cè)定結(jié)果的描述性分析

分別按國際法和高通量法對(duì)12份大米樣品進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，高通量法的變異系數(shù)范圍為3.77%～10.15%，國際法測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)范圍為 1.48%～12.91%，高通量法中的變異系數(shù)普遍高于國際法，但其直鏈淀粉含量的測(cè)定結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢(shì)基本相同。F檢驗(yàn)結(jié)果表明，這2種方法所得的各個(gè)樣品間差異均不顯著，證明高通量法測(cè)定結(jié)果可靠，完全可以滿足對(duì)大批量樣品的初步測(cè)定和篩選。

3 討論與結(jié)論

稻米的淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉2個(gè)部分，兩者之和約占稻米成分的90%，其中直鏈淀粉含量變化為0～40%，是決定稻米食味品質(zhì)的重要性狀之一[8]。自首次提出通過碘比色法測(cè)量稻米直鏈淀粉含量以來，稻米直鏈淀粉含量的測(cè)定技術(shù)一直在不斷發(fā)展變化。從單波長比色法，經(jīng)過改進(jìn)提出了雙波長比色法和多波長比色法，進(jìn)一步發(fā)展出基于碘比色法的一系列新測(cè)定技術(shù)，如碘親和力測(cè)定法、伴刀豆球蛋白法、自動(dòng)分析檢測(cè)儀。甚至利用稻米理化特性，引進(jìn)新的檢測(cè)儀器，開發(fā)出近紅外光譜分析法、高光譜法、RVA快速黏度分析法等檢測(cè)手段;以及基于分子基團(tuán)特性開發(fā)出色譜分析法、差示掃描量熱法、非對(duì)稱流場流分離技術(shù)等[8-15]。

基于碘比色法的大米直鏈淀粉含量測(cè)定方法因成本較低且結(jié)果可靠，成為目前各實(shí)驗(yàn)室最常使用的方法。本研究摒棄了標(biāo)準(zhǔn)法中使用100 mL容量瓶定容的操作，采用2 mL離心管，不僅大大節(jié)省了試劑和水資源，而且便于通過干式恒溫器進(jìn)行加熱，能在保證充分糊化的同時(shí)也利于操作，并開創(chuàng)性地使用了微孔板分光光度計(jì)，配套器材是96孔塑料微孔板，利用96孔微孔板分光光度計(jì)，對(duì)稻米直鏈淀粉含量進(jìn)行快速高通量的測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，大米直鏈淀粉含量高通量測(cè)定法與國際法無顯著性差異，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2=0.991 1，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，操作簡單，是一種快速高效的測(cè)定直鏈淀粉含量的方法，可用于水稻誘變?nèi)后w后代或品種選育過程中的海量株系大規(guī)模初篩，極大地提高了稻米品質(zhì)研究的效率。

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收 稿日期：2019-02-22

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFD0100104）。

作者簡介：陳 瑩（1994—），女，安徽淮南人，碩士，主要從事水稻食味品質(zhì)改良研究。E-mail：qazwsxedc1577@163.com。

通信作者：王 慧，博士，教授，主要從事高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻育種、雜交稻恢復(fù)系選育和分子改良以及空間誘變機(jī)理研究。E-mail：wanghui@scau.edu.cn。