梁山慈竹SSR-PCR體系的優(yōu)化

王麗麗 孫昌法 胡尚連

摘要： 以梁山慈竹為材料，提取葉片DNA并將其作為模板，采用正交設(shè)計試驗優(yōu)化影響梁山慈竹簡單重復序列-聚合酶鏈式反應(yīng)（SSR-PCR）體系的3個主要因素，并對21個梁山慈竹不同品系進行穩(wěn)定性驗證，結(jié)果表明，優(yōu)化的20 μL SSR-PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCRMix 8 μL、模板DNA（20 ng/μL） 2.5μL 、SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL;使用SSR引物BMK.38757對21個梁山慈竹不同品系進行擴增，擴增產(chǎn)物大小在 140 bp 左右，共有4個多態(tài)性位點;使用SSR引物L6、R83對梁山慈竹進行擴增，均獲得3個多態(tài)性位點，且條帶清晰。

關(guān)鍵詞： 梁山慈竹;簡單重復序列（SSR）;聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）;正交試驗;優(yōu)化

中圖分類號：S795.501? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0061-04

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）別稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）[1]，由1～6個堿基重復串聯(lián)組成，其不同等位基因間的重復數(shù)具有豐富的差異，而其兩側(cè)的序列高度保守，可以在重復串聯(lián)序列的兩端設(shè)計引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增片段的長度檢測等位基因的多態(tài)性。SSR是Skinner等于1974年在研究寄居蟹時首次發(fā)現(xiàn)的[2]，此后人們相繼發(fā)現(xiàn)，SSR廣泛存在于真核生物中，由于其具有多態(tài)性高、容易檢測、共顯性等特點，SSR標記技術(shù)很快在動植物遺傳檢測分析中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

SSR標記根據(jù)開發(fā)方法可分為基因組SSR（gSSR）、表達序列標簽SSR（EST-SSR）標記，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序相對價格越來越低，一些無參照基因組物種的EST-SSR開發(fā)也越來越容易。西南科技大學生命科學與工程學院實驗室在梁山慈竹分子層面研究上取得一定進展[5]，并獲得多個品系梁山慈竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6-7]，這為梁山慈竹EST-SSR分子標記的開發(fā)提供了堅實的基礎(chǔ)。在EST-SSR標記開發(fā)過程中，PCR過程對后續(xù)電泳條帶的讀取具有直接的影響[8]，為保證PCR結(jié)果的可靠性，本研究對影響梁山慈竹 SSR-PCR 結(jié)果的主要因子進行優(yōu)化，以獲得較好的反應(yīng)體系，為后續(xù)梁山慈竹的遺傳多樣性、性狀關(guān)聯(lián)分析及分子輔助育種等研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

移液槍、PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、垂直板電泳儀、凝膠成像儀、通風櫥、離心機、數(shù)碼相機等。

1.2 試驗材料

野生型梁山慈竹及梁山慈竹20個栽培品系葉片，由西南科技大學生命科學與工程學院實驗室提供。

1.3 DNA提取及檢測

21個梁山慈竹品系的葉片基因DNA采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法進行提取[9]，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法分別檢測提取的DNA質(zhì)量、濃度;分別取各品系DNA溶液10 μL，用蒸餾水稀釋至20 ng/μL后，在-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 SSR-PCR體系優(yōu)化

以野生型梁山慈竹葉片DNA為模板，使用SSR引物BMK.38757（表1），對影響SSR-PCR效果的Taq PCRMix用量、引物濃度、DNA模板用量采用3因素4水平正交試驗進行優(yōu)化，具體設(shè)計見表2，反應(yīng)總體積為20 μL，不足的加雙蒸水補齊。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，56 ℃下退火 30 s，72 ℃延伸25 s，32個循環(huán);72 ℃延伸 5 min;4 ℃ 保存。采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5～3.0 h，電泳恒定電壓為600 V;使用ACS染液（2%硝酸銀，10%乙醇，0.5%冰醋酸）染色15～20 min，蒸餾水沖洗后，浸沒于由3%氫氧化鈉（NaOH）、0.1%甲醛配制成的顯影液中顯影約 15 min，至條帶清洗;采用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.5 SSR-PCR反應(yīng)體系驗證

以野生型梁山慈竹葉片DNA為對照（CK），以20個梁山慈竹品系葉片DNA為試驗材料，以 BMK.38757、L6、R83為引物，分別在退化溫度為56、55、57 ℃，其他反應(yīng)程序同“1.4”節(jié)條件下對優(yōu)化的 SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性及引物擴增的多態(tài)性進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁山慈竹葉片DNA的提取與檢測

由圖1可見，21個梁山慈竹品系的葉片DNA電泳后均具有明亮的條帶，且條帶沒有明顯的拖尾。紫外分光光度計檢測結(jié)果顯示，各品系DNA在波長分別為260、280 nm處的吸光度比值均在 1.7～1.9之間，DNA濃度均在200 ng/μL以上，說明DNA降解較少，蛋白雜質(zhì)污染相對較輕，提取質(zhì)量較高，可滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 梁山慈竹SSR-PCR體系的優(yōu)化

由圖2可知，采用引物BMK.38757共擴增出4條條帶;Taq PCRMix用量為10～12 μL（泳道9～泳道16）時，條帶染色過深，且容易出現(xiàn)引物二聚體;在Taq PCRMix用量相同條件（泳道1～泳道4）下，引物濃度或模板DNA用量的增加可以提升PCR的擴增效果;泳道5～泳道8的條帶則進一步表明，模板DNA用量的增加會使擴增條帶逐漸清晰，而引物濃度對擴增結(jié)果影響相對較小。因此，優(yōu)化的梁山慈竹SSR-PCR體系為2×Taq PCRMix 8 μL，模板DNA用量（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L）1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL。

2.3 梁山慈竹SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系的驗證

使用SSR引物BMK.38757，對野生型梁山慈竹及20個梁山慈竹栽培品系采用優(yōu)化反應(yīng)體系進行PCR擴增，結(jié)果（圖3）顯示，共獲得4個多態(tài)性位點，產(chǎn)物大小均在140 bp左右，條帶清晰，容易分辨，且均未見引物二聚體的產(chǎn)生。

圖4-（1）、圖4-（2）分別為采用引物L6、引物R83在優(yōu)化體系下對部分梁山慈竹品系的PCR擴增結(jié)果，結(jié)果表明，2個引物均可獲得3個等位多態(tài)性位點，說明優(yōu)化體系能夠適用于多對引物，能夠得到清晰、無拖尾、易于讀取的條帶。

3 結(jié)論與討論

簡單重復序列標記由于具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、開發(fā)容易且開發(fā)時間短等特點[10]，自該技術(shù)誕生以來，得到廣大科研工作者的青睞，目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標基因定位、品種鑒定及輔助育種等研究[11-16]中。由于竹類植物以無性繁殖為主，其遺傳多樣性分析、分類等分子水平上的研究難度較大[17]，因此，將SSR分子標記手段應(yīng)用在竹類植物研究上具有重要的意義。

SSR分子標記的技術(shù)基礎(chǔ)是PCR擴增，影響PCR擴增的因素將直接影響SSR分子標記的結(jié)果。本研究對梁山慈竹SSR-PCR的引物濃度、模板DNA濃度、Taq PCRMix等設(shè)計3因素4水平正交試驗，獲得的最佳反應(yīng)體系為Taq PCRMix 8 μL，模板DNA（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL。

采用優(yōu)化的反應(yīng)體系對野生型梁山慈竹及20個梁山慈竹栽培品系進行PCR擴增，部分引物獲得較好的多態(tài)性位點，其中，引物BMK.38757獲得4個多態(tài)性位點，引物L6、R83均可獲得3個多態(tài)性位點。表達序列標簽SSR（EST-SSR）標記可用于梁山慈竹不同栽培品種間的遺傳分析，結(jié)合性狀關(guān)聯(lián)分析[18-19]能夠應(yīng)用于優(yōu)良竹種選育與鑒別，有利于加快育種速度。

參考文獻：

[1]郭小平，趙元明，劉毓俠. SSR技術(shù)及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學報，1998，13（3）：73-76.

[2]Skinner D M，Beattie W G，Blattner F R，et al. The repeat sequence of a hermit crab satellite deoxyribonucleic acid is（-T-A-G-G-）n-（-A-T-C-C-）n[J]. Biochemistry，1974，13（19）：3930-3937.

[3]Ali S，Müller C R，Epplen J T. DNA finger printing by oligonucleotide probes specific for simple repeats[J]. Human Genetics，1986，74（3）：239-243.

[4]吳妙丹. 毛竹EST-SSR標記的開發(fā)和利用[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學，2010.

[5]李曉瑞，胡尚連，曹 穎，等. 農(nóng)桿菌介導慈竹[STBX]4CL[STBZ]基因遺傳轉(zhuǎn)化梁山慈竹[J]. 林業(yè)科學，2012，48（3）：38-44.

[6]周振華. 梁山慈竹體細胞突變體No.29特性及其轉(zhuǎn)錄組分析[D]. 綿陽：西南科技大學，2015.

[7]王身昌. 梁山慈竹體細胞突變體No.30的研究[D]. 綿陽：西南科技大學，2016.

[8]楊傳平，王艷敏，魏志剛. 利用正交設(shè)計優(yōu)化白樺的SSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 東北林業(yè)大學學報，2006，34（6）：1-3.

[9]閆慶祥，黃東益，李開綿，等. 利用改良CTAB法提取木薯基因組DNA[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26（4）：30-32.

[10]董文娟. 毛竹多拷貝SSR及其遺傳多樣性研究[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學，2011.

[11]Lokko Y，Dixon A，Offei S，et al. Assessment of genetic diversity among African cassava Manihot esculenta Grantz accessions resistant to the cassava mosaic virus disease using SSR markers[J]. Genetic Resources & Crop Evolution，2006，53（7）：1441-1453.

[12]榮 浩，黃 彬，周 琦，等. 61個觀賞海棠品種的SSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2018，42（3）：045-050.

[13]Tsukazaki H，Yamashita K I，Yaguchi S，et al. Construction of SSR-based chromosome map in bunching onion（Allium fistulosum）[J]. Theoretical & Applied Genetics，2008，117（8）：1213-1223.

[14]Riday H，Brummer E C，Campbell T A，et al. Comparisons of genetic and morphological distance with heterosis between Medicago sativa subsp.sativa and subsp.falcata[J]. Euphytica，2003，131（1）：37-45.

[15]Hir Y P. 基于SSR和AFLP標記的東方百合群體遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2016.

[16]Grandon N G，Alarcon Y，Moreno M V，et al. Genetic diversity among alfalfa genotypes （Medicago sativa L.） of non-dormant cultivars using SSR markers and agronomic traits[J]. Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias，2013，45（2）：181-195.

[17]吳妙丹. 毛竹EST-SSR標記的開發(fā)和利用[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學，2010.

[18]李昌榮. 大花序桉生長和材性遺傳變異及SSR關(guān)聯(lián)分析[D]. 北京：中國林業(yè)科學研究院，2017.

[19]譚文麗. 木薯SSR標記與表型的關(guān)聯(lián)分析[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2014.

收 稿日期：2019-02-12

基金項目：四川省“十三五”重點攻關(guān)項目（編號：2016NYZ0038）。

作者簡介：王麗麗（1992—），女，山東臨沂人，碩士，從事植物遺傳與品種改良。E-mail：1298901076@qq.com。

通信作者：胡尚連，博士，教授，從事植物生理與生物技術(shù)研究。E-mail：hashanglian@126.com。