基于醇溶蛋白的木蘭科植物鑒定技術(shù)研究

葉珊珊　王楠　高艷芳　唐密　劉夢(mèng)齡　肖強(qiáng)

摘要：木蘭科（Magnoliaceae）植物分布范圍廣且屬種多樣，屬種之間形態(tài)結(jié)構(gòu)差異存在許多過(guò)渡類(lèi)型，在屬與種之間的鑒定上存在很多爭(zhēng)議。目前，對(duì)于木蘭科植物種子分類(lèi)和鑒定研究中，通常以植物學(xué)形狀特征作為鑒定方法。為了探索對(duì)木蘭科植物種子進(jìn)行鑒別的有效途徑，采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)10種木蘭科植物種子醇溶蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10種木蘭科植物共分離出61條譜帶，條帶數(shù)大多在6～7，最多為9條，最少的6條。利用Quantityone軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同種之間譜帶都存在差異性，可以通過(guò)種子醇溶蛋白譜帶進(jìn)行木蘭科植物物種鑒別。

關(guān)鍵詞：木蘭科（Magnoliaceae）;醇溶蛋白;聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類(lèi)號(hào)：Q94? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）02-0098-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.020? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the identification of Magnoliaceae plants based on the alcohol-soluble protein

YE Shan-shana，WANG Nana，GAO Yan-fangb，TANG Mia，LIU Meng-linga，XIAO Qianga

（a.Hubei key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization;

b.School of Forestry and Horticulture，Hubei Minzu University，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The Magnoliaceae plants are widely distributed and varied in genus and species. There are many controversies in the identification of genus and species because many transitional types were found among different genus and species. At present， botanical shape characteristics are usually used as identification methods for the classification and identification of magnoliaceae plants. In order to further identify the magnolia plants， the acid polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the gliadin of magnolia plants. The results showed that 61 bands were separated from 10 species of magnolia，and most of the bands were between 6 and 7， with a maximum of 9， and the lowest 6. Using Quantityone software to analyze electrophoresis bands， it is found that there are differences between different bands， and species identification can be carried out through spectral bands.

Key words： Magnoliaceae; gliadin; polyacrylamide gel electrophoresis

木蘭科（Magnoliaceae）是被子植物系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中較原始的科，多為常綠性，是集綠化、觀賞、材用、藥用、科研等多種功能于一體的優(yōu)良樹(shù)種[1，2]。木蘭科植物分類(lèi)在植物學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)存在較多爭(zhēng)論;在分類(lèi)學(xué)研究中，一般采用的方法有形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、植物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等，而形態(tài)學(xué)研究是系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究的主要內(nèi)容。在形態(tài)學(xué)研究中，一般通過(guò)觀察木蘭科植物的外在特征進(jìn)行鑒別，并對(duì)其莖、葉、花、果實(shí)、種子等器官進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)解剖[2]。木蘭科植物種子外形極其相似，其種子的種皮分3層，外種皮是顏色鮮艷的革質(zhì)層，中種皮是油質(zhì)的肉質(zhì)層，最內(nèi)一層是堅(jiān)硬、骨質(zhì)的內(nèi)種皮[3];其紅色假種皮富含油細(xì)胞，當(dāng)洗去紅色假種皮后，常常會(huì)在堅(jiān)硬的骨質(zhì)內(nèi)種皮表面發(fā)現(xiàn)一層油脂[4]。徐鳳霞等[5]在解剖鏡下觀察了10屬52種木蘭科植物種子內(nèi)種皮合點(diǎn)區(qū)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)可分為孔型和管型兩大類(lèi)型，并將其運(yùn)用到木蘭科植物屬種的分類(lèi)上[2];由于存在多種不同種類(lèi)木蘭科植物種子合點(diǎn)區(qū)形態(tài)相似的情形，因此，采用這種方式鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)鑒定者要求較高。探索一種在園林育種中對(duì)木蘭科植物種子進(jìn)行有效鑒定的可靠方法具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

醇溶蛋白是種子的一類(lèi)貯藏蛋白，一般不受種植環(huán)境的影響，而與其遺傳特性有關(guān)，既可用來(lái)區(qū)分具有遺傳差異的品種（品系），又能反映出品種（品系）間的親緣關(guān)系，通過(guò)醇溶蛋白來(lái)進(jìn)行不同種類(lèi)植物鑒別得到廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外許多研究學(xué)者采用醇溶蛋白電泳方法對(duì)大米[6]、燕麥[7，8]、蕎麥[8]、意大利小米[9]、日本稗子[10]等進(jìn)行了鑒別研究，取得了較好效果。但將此方法用于木本植物種屬鑒別研究的報(bào)道較少[11，12]，鑒于通過(guò)形態(tài)學(xué)方法鑒別木蘭科植物存在困難，本研究嘗試?yán)镁郾０纺z電泳分析木蘭科植物種子醇溶蛋白特征譜帶，以達(dá)到鑒別木蘭科不同種類(lèi)植物的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

成熟晾干的木蘭科木蘭屬、玉蘭屬、木蓮屬、含笑屬植物種子，由恩施冬升植物開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供。各供試材料名稱(chēng)具體見(jiàn)表1。

1.2? 試驗(yàn)方法

將供試種子去種皮，稱(chēng)取0.2 g，加入1.2 mL的樣品提取緩沖液（含25% 2-氯乙醇、12%尿素和1% 2-巰基乙醇）。充分研磨，轉(zhuǎn)入2 mL的離心管，振蕩10 min，然后在12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液。在上清液中加入等量的40%蔗糖溶液和適量1%的甲基綠溶液，振蕩混勻，在12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，即為電泳上樣液，4 ℃冰箱保存待用。

參照Bushuk等[13]的方法進(jìn)行乳酸鋁酸性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，并稍加修改。醇溶蛋白固定、染色、脫色參照孫克江等[14]的方法，將剝離的凝膠浸入固定液中，室溫下固定0.5 h，倒掉固定液，隨后加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h，取出凝膠，用去離子水洗去凝膠表面附著的染料，脫色液漂洗數(shù)次，直至譜帶背景清晰。采用GEI mage scanner III圖像掃描系統(tǒng)中反射稿模式快速掃描染色后的凝膠，記錄蛋白譜帶。采用Quantity one軟件測(cè)定酶譜帶的相對(duì)遷移率（Relative mobilities，Rf）。采用指紋圖譜分析軟件Cross Checker對(duì)10種木蘭科植物種子醇溶蛋白電泳圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì);在Rf值相同的位置，如果有醇溶蛋白譜帶，則記為1，無(wú)酶譜帶記為0，建立0和1的二元數(shù)據(jù)矩陣。Rf=蛋白質(zhì)譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 木蘭科植物醇溶蛋白譜型分析

采用乳酸鋁酸性電泳對(duì)10種木蘭科植物種子中醇溶蛋白進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)不同種間醇溶蛋白譜型均有明顯差異（圖1）。10種木蘭科種子蛋白譜帶基本上呈現(xiàn)出泳道中部染色強(qiáng)度較上、下部大的特點(diǎn)， 表明這10種木蘭科植物具有相似的遺傳基礎(chǔ)。蛋白譜表型經(jīng)Quantity one軟件分析表明，10種木蘭科植物種子醇溶蛋白譜帶的類(lèi)型共計(jì)61種，各木蘭科植物平均譜帶數(shù)在6～7條，其中木蓮屬毛果木蓮條帶數(shù)最多，有9條。

2.2? 木蘭科植物醇溶蛋白譜親緣分析

為進(jìn)一步了解10種木蘭科植物間的親緣關(guān)系，以Nei氏遺傳距離（表2）為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)馨香玉蘭和大葉玉蘭親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.38;大葉玉蘭和毛果木蓮親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其遺傳距離可達(dá)0.53。

3? 小結(jié)與討論

醇溶蛋白電泳方法具有簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠、低成本等特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于品種鑒定，可作為首選檢驗(yàn)方法，滿(mǎn)足種子檢驗(yàn)數(shù)量大、品種多的需求[15]。20世紀(jì)80年代就已經(jīng)利用醇溶蛋白對(duì)水稻品種進(jìn)行鑒定[16];1989年中國(guó)更是把利用醇溶蛋白鑒定小麥和大麥種子的方法作為一種標(biāo)準(zhǔn)程序[17]。醇溶蛋白在植物品種的鑒定上具有重要價(jià)值。

木蘭科植物鑒定的方法多樣，可以通過(guò)采集樣本與已有標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)，還可以研究種子差異或利用分子生物學(xué)方法對(duì)木蘭科植物進(jìn)行鑒定。1996年，徐鳳霞等[5]提出利用木蘭科種子的內(nèi)種皮在合點(diǎn)區(qū)的特殊結(jié)構(gòu)來(lái)鑒別木蘭科種子。2005年，夏國(guó)華等[1]提出利用觀察種子形態(tài)的方法鑒別木蘭科不同屬的種子，并整理出種子形態(tài)特征分屬檢索表。2013年，李劍等[18]利用ISSR和AFLP兩種分子標(biāo)記方法對(duì)木蘭科植物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)木蘭屬和含笑屬聚類(lèi)在一起，其差異可以用分子標(biāo)記鑒定出來(lái)。2017年，薛曉明等[19]利用電鏡掃描的方法對(duì)木蘭科7種植物花粉進(jìn)行研究，通過(guò)花粉形態(tài)上的差異對(duì)木蘭科植物進(jìn)行鑒定。在木蘭科植物鑒定上，植物形態(tài)學(xué)鑒定難以用肉眼分辨，難度較大。而分子標(biāo)記雖然結(jié)果較精確，但成本和試驗(yàn)條件要求較高，無(wú)法廣泛推廣使用。種子貯藏蛋白的組成由遺傳物質(zhì)決定，不受環(huán)境影響，其組成的差異可以反映基因型的不同，一個(gè)品種通常只有一種蛋白質(zhì)的電泳圖譜[13，14]。因此，利用醇溶蛋白電泳技術(shù)對(duì)木蘭科植物種子進(jìn)行鑒定是可行的。

醇溶蛋白的提取技術(shù)極其重要，它將影響整個(gè)電泳過(guò)程的成功與否。醇溶蛋白屬于一類(lèi)貯存蛋白，存在于谷物的淀粉胚乳層中，具有特殊的溶解性質(zhì)。它不溶于充分稀釋的鹽溶液，可由乙醇-水混合溶液進(jìn)行提取，但有些蛋白質(zhì)在這種條件下是不能溶解的。主要是因?yàn)榇既艿鞍组g或其他蛋白質(zhì)之間存在共價(jià)連接。所以為了提取成功還要加某些還原性試劑來(lái)破壞這些共價(jià)鍵[20]。對(duì)于醇溶蛋白的提取前人做了許多研究，例如在小麥醇溶蛋白提取方面，顏啟傳等[17]提取小麥中的醇溶蛋白時(shí)使用甲基綠粉劑和2-氯乙醇進(jìn)行提取，采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分離;邵錦震等[21]利用由2-氯乙醇和2-巰基乙醇組成的復(fù)合提取劑取得了較好的提取效果。在高粱醇溶蛋白提取方面，王偉等[22]研究表明，根據(jù)蛋白濃度測(cè)定和二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，還原劑二硫蘇糖醇（DDT）濃度為4%的60%叔丁醇溶液，樣品質(zhì)量比提取劑用量為1∶8（g/mL）是提取高粱種子醇溶蛋白的最佳條件。對(duì)油松種子中醇溶蛋白提取及酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）分析表明，由1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復(fù)合提取劑提取效果最佳，其次是由20% 2-氯乙醇、1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復(fù)合提取劑[11]。

在木蘭科植物種子中醇溶蛋白提取中，筆者采用了多種方法提取，其中效果最佳的是由25% 2-氯乙醇、1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復(fù)合提取液。在聚丙烯酰胺凝膠電泳方法上，先后采用SDS-PAGE和A-PAGE電泳技術(shù)，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，A-PAGE方案效果最佳，圖譜中條帶豐富，帶型清晰度高。本研究建立的A-PAGE分析木蘭科植物種子中醇溶蛋白質(zhì)方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢(shì)，在鑒別木蘭科不同種植物種子方面具有較高可行性。但由于收集到的品種有限，尚需進(jìn)一步研究該方法對(duì)更多木蘭科種子的適用性，以建立木蘭科植物種子醇溶蛋白指紋圖譜，為園林育種工作提供快速有效的指導(dǎo)。此外，利用該方法對(duì)木蘭科植物系統(tǒng)進(jìn)化研究，也是值得進(jìn)一步嘗試的領(lǐng)域。

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收稿日期：2019-04-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260057;31460203）;湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710517038;201810517051）

作者簡(jiǎn)介：葉珊珊（1997-），女，廣西桂林人，在讀本科生，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)，（電話(huà)）16677160687（電子信箱）

1271271042@qq.com;通信作者，肖? 強(qiáng)，男，教授，主要從事植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，（電子信箱）275975926@qq.com。