原子轉(zhuǎn)移自由基聚合調(diào)控制備兩親性嵌段共聚物納米膠束及其載藥性能

吳梓斌 ，徐德忠 ，冷 欣 ，苗慶顯 ，肖旺釧 ，2

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 材料工程學(xué)院，福建 福州350108；2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院，福建 三明365004）

兩親性嵌段共聚物組裝形成的膠束應(yīng)用于多種藥物的負(fù)載，是最有發(fā)展和應(yīng)用前景的納米載體材料之一[1]。嵌段共聚物是利用有機化學(xué)和高分子化學(xué)合成的手段將兩種或幾種不同性質(zhì)的單體或聚合物鏈接起來，形成一種新的高分子聚合物，從而獲得更好的性能的材料。兩親性的高分子鏈段同時包含親水和疏水兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)，對油相和水相都具有很好的親和性，同時還具有高分子的增黏性和低分子的表面活性[2-3]。兩親性嵌段共聚物在油相溶液和水溶液中均會進(jìn)行不同自組裝以使其適應(yīng)當(dāng)下的環(huán)境。在水溶液中，疏水性鏈段會盡可能減少與水溶液的接觸面積而團(tuán)聚收縮形成類似于核結(jié)構(gòu)，親水性鏈段則會盡可能增大與水溶液接觸面積而伸展形成類似殼結(jié)構(gòu)，此為水溶液中兩親性膠束的自組裝形態(tài)。這種能自組裝為核-殼結(jié)構(gòu)的聚合物膠束在難溶性藥物的遞送及藥物定位控制釋放[4]、基因治療[5]、蛋白質(zhì)分離與提取[6]、生物智能響應(yīng)性傳感器[7]、診斷治療疾病[8]等領(lǐng)域具有非常好的應(yīng)用前景。在藥物遞送方面，膠束載體的大小通常為十分之幾到幾百納米，以允許全身（靜脈內(nèi)）或局部（粘膜）給藥，并促進(jìn)它們在細(xì)胞內(nèi)擴散。此外，膠束的表面功能改性可以賦予納米載體控制其藥代動力學(xué)和生物分布的能力，盡可能提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。

在藥物遞送研究領(lǐng)域，聚合物膠束由于其多樣性，譬如能夠增溶難溶性的藥物、減少藥物被腎濾系統(tǒng)清除、藥物緩慢釋放、減少藥物的毒副作用、藥物靶向遞送、提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間等，倍受專家學(xué)者的研究和開發(fā)[9-11]。智能兩親性嵌段聚合物膠束會在特定的外界環(huán)境下表現(xiàn)出不同的響應(yīng)性[12]，主要有以下響應(yīng)，pH敏感[13-14]，溫度敏感[15]、光敏感[16]等。pH敏感型是指在某一pH值范圍之內(nèi)，鏈段的結(jié)構(gòu)會發(fā)生了某種轉(zhuǎn)變的過程[17]。欒淑娟等制備合成mPEG-Hz-PLA嵌段共聚物，聚合物膠束能自組裝成具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束。進(jìn)一步研究了該聚合物的載藥能力和在不同pH值條件下藥物釋放的能力，以驗證其pH響應(yīng)性[18]。溫度敏感型是指當(dāng)在特定溫度發(fā)生變化時，聚合物某一鏈段從溶解到不溶解或者從不溶解到溶解以便藥物進(jìn)行釋放[19]。郭莉等[20]以聚異丙基丙烯酰胺作為溫度敏感段、以聚丙烯酸作為pH敏感段成功制備了雙重敏感性的兩親性嵌段共聚物。該聚合物成功負(fù)載了抗癌藥物紫杉醇(PTX)，并進(jìn)一步探究了載藥膠束在人體環(huán)境中的控釋行為。光度敏感性共聚物指在共聚物中含有感光性的鏈段，該感光鏈段在吸收光源之后，對該鏈段產(chǎn)生物理或者化學(xué)的變化，自行組裝的納米膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，使之對于藥物的負(fù)載更加的高效[21]。趙發(fā)寶等[22]以溴封端聚乙二醇單甲醚(mPEG-Br)為大分子引發(fā)劑，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)反應(yīng)制備了不同嵌段比例且分子量分布較窄的光學(xué)活性聚乙二醇單甲醚嵌段聚(N-甲基丙烯酰-L-亮氨酸甲酯)(mPEG-b-PMALM)聚合物。就當(dāng)前的研究情況分析，在響應(yīng)性藥物靶向傳遞和可控釋放領(lǐng)域內(nèi)，pH響應(yīng)性由于其特點引起了研究者的廣泛研究[23]。當(dāng)聚合物膠束從血液進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中，pH環(huán)境生變化會引起pH敏感的聚合物膠束發(fā)生變化，從而膠束解離，藥物釋放。聚酯類材料在人體內(nèi)的降解性良好，且生物的降解性也很好，在人體內(nèi)最終可以降解成二氧化碳和水，從而排出體外[24]。基于以上科學(xué)問題，本文擬設(shè)計一種低成本、合成工藝簡單且所得粒徑便于調(diào)控的新型兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA）是作為該共聚物的親水嵌段，其具有無免疫原性及抗原性、無毒無害、能與眾多溶劑互溶、不易被蛋白質(zhì)和血小板吸附等優(yōu)點。甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）最為該共聚物的疏水嵌段，具有良好的生物相容性、價格低廉等優(yōu)點，且因其反應(yīng)活性高、疏水性強廣泛應(yīng)用于制備功能化微球和嵌段共聚物。因此本文采用兩步再生電子轉(zhuǎn)移生成催化劑原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ARGET ATRP）反應(yīng)制備該兩親性嵌段共聚物。第一步ARGET ATRP反應(yīng)是使用2-溴異丁酸乙酯作為引發(fā)劑對甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PEGMA）進(jìn)行修飾，并使單體（PEGMA）發(fā)生自聚，目的在其鏈段端引入溴原子得到具備引發(fā)功能的親水鏈段PPEGMA-Br；第二步ARGET ATRP反應(yīng)是通過大分子引發(fā)劑PPEGMA-Br引發(fā)甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）聚合，從而得到兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)的表征和藥物包埋、藥物控制釋放性能的測試。

1 實驗部分

1.1 藥品和儀器

1．1．1 藥品

甲基丙烯酸聚乙二醇酯（99%），甲基丙烯酸叔丁酯（99%），溴化銅（99%），2-溴異丁酸乙酯（99%），苯甲醚（99.7%），三(2-吡啶甲基)胺（98%），丙酮（98%），正己烷（97%），異辛酸亞錫（95%），鹽酸阿霉素（DOX）（99%），中性氧化鋁，以上試劑購買自阿拉丁，直接使用。

1．1．2 儀器

實驗所用儀器見表1。

表1 實驗中所用主要檢測儀器

1.2 實驗步驟

1．2．1 具有引發(fā)功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA-Br）的合成

用電子天平稱取約4.6 mg三 (2-吡啶甲基)胺、3.6 mg溴化銅、3.84 g甲基丙烯酸聚乙二醇酯、31.2 mg 2-溴異丁酸乙酯和15 mL溶劑苯甲醚置于100 mL兩口燒瓶中，并將燒瓶置于超聲波清洗器中超聲分散。待溴化銅充分分散，將兩口燒瓶置于40℃的油浴鍋內(nèi)，并用反口塞密封兩口燒瓶。利用長針頭持續(xù)往兩口燒瓶內(nèi)注入高純氮氣，同時利用短針頭保持兩口燒瓶內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。在另一個瓶子中加入160 μL異辛酸亞錫和3 mL苯甲醚，并注入氮氣進(jìn)行保護(hù)，防止其氧化。待兩口燒瓶內(nèi)的反應(yīng)持續(xù)45 min時，把瓶內(nèi)的異辛酸亞錫和苯甲醚混合液體注入兩口燒瓶中，并保持高純氮氣的持續(xù)注入。反應(yīng)24 h，待冷卻后，將所得的反應(yīng)產(chǎn)物逐滴加入到過量且快速攪拌的正己烷中，靜置后倒掉上清液，所得沉淀即為聚合物粗產(chǎn)物。進(jìn)一步用過柱的辦法除去聚合物粗產(chǎn)物中的溴化銅，在玻璃柱中加入適量的中性氧化鋁，所得的聚合物粗產(chǎn)物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作為洗脫劑進(jìn)行洗脫。過柱所得的液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，再次逐滴滴入過量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。干燥后的固體即為PPEGMA-Br。

1．2．2 甲基丙烯酸聚乙二醇酯-甲基丙烯酸叔丁酯（PPEGMA-b-PtBMA）嵌段共聚物的合成

稱取 1 mmol的 PPEGMA-Br、0.05 mmol的溴化銅、0.05 mmol的三(2-吡啶甲基)胺、20 mmol的甲基丙烯酸叔丁酯和15 mL溶劑苯甲醚置于兩口燒瓶中。反應(yīng)步驟與上述步驟大致相同。將兩口燒瓶置于40℃的油浴鍋內(nèi)攪拌45 min后，保持高純氮氣的持續(xù)注入條件下，快速注入0.5 mmol異辛酸亞錫和3 mL苯甲醚的混合物，持續(xù)反應(yīng)24 h。待冷卻后，將所得的反應(yīng)產(chǎn)物逐滴加入到過量且快速攪拌的正己烷中，靜置后倒掉上清液，所得沉淀即為聚合物粗產(chǎn)物。進(jìn)一步用過柱的辦法除去聚合物粗產(chǎn)物中的溴化銅，在玻璃柱中加入適量的中性氧化鋁，所得的聚合物粗產(chǎn)物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作為洗脫劑進(jìn)行洗脫。過柱所得的液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，再次逐滴滴入過量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。所得的產(chǎn)物即為兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。

1．2．3 臨界膠束濃度（CMC）測定

近年來，快速發(fā)展的熒光探針技術(shù)是研究膠束體系的重要手段，其中最為常見的是以芘為熒光探針。首先，稱量芘2.4 mg溶于1 000 mL的甲醇，配置成1.2×10-5mol/L芘的甲醇溶液待用。將10 mg聚合物溶于少量丙酮中，再往里加入10 mL超純水，慢速攪拌24 h（揮發(fā)丙酮），從而獲得1 mg/mL的聚合物母液。隨后將母液稀釋成 5×10-1、2.5×10-1、1×10-1、7.5×10-2、5×10-2、2.5×10-2、1×10-2、7.5×10-3、5×10-3、2.5×10-3、1×10-3、7.5×10-4、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4mg/mL 一系列濃度。 取 0.5 mL 芘的甲醇溶液置于相應(yīng)數(shù)量的試樣瓶中，隨即伴隨著晃動試樣瓶通氮氣將甲醇吹干。往含芘的試樣瓶中加入10 mL聚合物的稀釋液超聲1 h并避光平衡24 h后進(jìn)行測試。芘在樣品溶液中的濃度為6×10-7mol/L。用熒光分光光度計測試溶液的熒光激發(fā)光譜，對激發(fā)波長為337和335 nm數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄，以二者的比值為縱坐標(biāo)，聚合物濃度求對數(shù)后數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖。

1．2．4 PPEGMA-b-PtBMA空白膠束以及載DOX膠束的制備

通過透析方法形成空白的聚合物膠束。將20 mgPPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速攪拌5 h，然后超聲0.5 h。隨后，在劇烈攪拌下，以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去離子水。將所得的溶液轉(zhuǎn)移至分子截留酯為8 000～12 000的透析24 h。在透析前6 h中每2 h更換一次去離子水，然后每6小時更換一次。 最后，將溶液冷凍干燥48 h得到固體產(chǎn)物，即為PPEGMA-b-PtBMA空白膠束。

載藥膠束的制備方法與上述方法相似。稱取2 mg鹽酸阿霉素置于小瓶，并用1 mL丙酮使其完全溶解。將20 mg PPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速攪拌5 h，然后超聲0.5 h。隨后將鹽酸阿霉素的丙酮溶液加入至聚合物溶液劇烈攪拌，再以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去離子水。 滴加結(jié)束后在避光的條件下將聚合物溶液轉(zhuǎn)移透析袋 （相對分子量分子量截留值為 8 000～12 000）中，用去離子水透析24 h。在透析前6 h中每 2 h更換一次去離子水，然后每6 h更換一次。 最后，將溶液冷凍干燥48 h得到固體產(chǎn)物，即為PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束。

1．2．5 載藥量和包封率的測定

將5 mg鹽酸阿霉素（DOX）溶解于5 mL丙酮中，配置成1 mg/mL的母液。隨后將母液配置成0.75、 0.50、0.25、0.10、0.075、0.05、0.025、0.01 mg/mL 一系列濃度。 用紫外分光光度計檢測其 485 nm處的吸光度，并繪制鹽酸阿霉素/丙酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將1 mg所制備的PPEGMA-b-PtBMA載藥膠束溶解于10 mL的丙酮中，使膠束形態(tài)發(fā)生變化（親水段為核，疏水段為殼），所載DOX溶解于丙酮中，隨后用紫外分光光度計檢測其485 nm處的吸光度，對比鹽酸阿霉素/丙酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算膠束的載藥量（LC）及包封率（EE）。

1．2．6 DOX 的體外釋放

用紫外/可見分光光度計來模擬計算載藥膠束的藥物釋放。具體方法如下，將一定量的載藥膠束裝入透析袋中，放入50 mL的釋放介質(zhì)在37℃的條件下進(jìn)行透析。釋放介質(zhì)分別為0.1 mol/L，pH=7.4 的磷酸鹽緩沖溶液和 0.1 mol/L，pH=4.0 的磷酸鹽緩沖溶液。分別在時間為 0.5、1、3、6、9、12、24 h分別取樣3 mL，每次取樣后補充3 mL新鮮的釋放介質(zhì)。隨后用紫外分光光度計測其吸光度并計算出鹽酸阿霉素的濃度。

1.3 測試表征

（1）核磁共振表征：使用氘代氯仿（CDCl3-d）作為溶劑，四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)，對聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行核磁共振檢測（1H-NMR，Bruker AVANCEⅢ 400）。

（2）粒徑分布測定：樣品的尺寸大小及分布采用英國馬爾文激光粒度儀Zetasizer Nano-ZS進(jìn)行測定，分析空白膠束及載藥膠束的粒徑分布情況，并與透射電鏡觀察的膠束粒徑進(jìn)行對比。

（3）透射電鏡分析：稱取一定量聚合物空白膠束及載藥膠束滴在銅網(wǎng)上，待其干燥后采用JEM-1010透射電鏡對其進(jìn)行粒徑和形貌觀察。

（4）紫外/可見分光吸光度測試：測定波長為485 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPEGMA-b-PtBMA的合成

為了構(gòu)建一種兩親性pH敏感的兩嵌段聚合物膠束作為藥物輸送載體，本文采用的ARGET ATRP法可獲得一種A-B型高分子PPEGMA-b-PtBMA，同時研究聚合物的載藥量、pH敏感性以及藥物釋放的情況。首先，在苯甲醚溶劑中，以三(2-吡啶甲基)胺/溴化銅為催化體系，異辛酸亞錫作為還原劑，2-溴異丁酸乙酯作為配體，以甲基丙烯酸聚乙二醇酯作為單體，用AGGET ATRP方法自聚，調(diào)控親水端的分子量的同時并引入了端基溴原子得到具有引發(fā)功能的大分子引發(fā)劑PPEGMA-Br，合成路線如圖1。然后對所得的大分子引發(fā)劑，再次使用AGGET ATRP方法接枝甲基丙烯酸叔丁酯，經(jīng)提純后即得聚合物PPEGMA-b-PtBMA。

圖1 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA合成示意圖

為了進(jìn)一步表征聚合物結(jié)構(gòu)，以CDCl3為溶劑，采用核磁共振譜儀測定聚合PPEGMA-Br和PPEGMA-b-PtBMA的核磁氫譜。圖2為PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的1H-NMR譜圖。從PPEGMA-Br的1H-NMR譜圖可見，化學(xué)位移為3.7（b）處是PEGMA鏈節(jié)上兩類亞甲基氫質(zhì)子化學(xué)位移峰，在1.95（a）處是PEGMA以2-溴異丁酸乙酯為引發(fā)劑自聚后引入的異丙基的氫質(zhì)子峰。經(jīng)過ARGET ATPR反應(yīng)后，PPEGMA-b-PtBMA的譜圖中1.42（c）處出現(xiàn)叔丁基上的氫質(zhì)子峰。因此，可以判定兩親性聚合物PPEGMA-b-PtBMA成功合成。

圖2 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的核磁共振氫譜圖

2.2 臨界膠束濃度的測定

在藥物輸送的領(lǐng)域內(nèi)，臨界膠束濃度是一個極其重要的指標(biāo)，用于評估聚合物膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定程度。芘溶液的熒光光譜包含一個振動帶，對芘環(huán)境的極性具有很高的靈敏度。當(dāng)膠束形成時，芘分子最好位于膠束的疏水核心內(nèi)或靠近其疏水核心，從而改變其光物理特性。以芘的熒光探針法測定PPEGMA-b-PtBMA聚合物自組裝成膠束的臨界膠束濃度。隨著PPEGMA-b-PtBMA濃度增加，芘的激發(fā)光譜強度不斷增加且第三個峰的位置發(fā)生化學(xué)位移，逐漸從335 nm轉(zhuǎn)移到337 nm。以I337和I335的比值為縱坐標(biāo)、濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。從圖3可見，I337/I335急劇增加的轉(zhuǎn)折點即為聚合物的CMC值。PPEGMA-b-PtBMA的CMC值為5.0 mg/L。研究表明，隨著聚合物疏水嵌段的增長，在水溶液中，其自組裝為膠束的能力越強。本文所合成的PPEGMA-b-PtBMA聚合物具有較低的臨界膠束濃度，表明其水溶液的核-殼結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，即使?jié)舛容^低，亦能保持完整結(jié)構(gòu)，有利于增長其在人體內(nèi)的循環(huán)時間。

圖3 PPEGMA-b-PtBMA的臨界膠束濃度圖

2.3 載藥膠束的制備與表征

由于PPEGMA-b-PtBMA具有優(yōu)異的兩親性能，可在水溶液中自組裝形成穩(wěn)定的膠束結(jié)構(gòu)。親水性的PPEGMA鏈段作為膠束的外殼，疏水性的PtBMA鏈段作為膠束的內(nèi)核，使得該聚合物形成具有殼核結(jié)構(gòu)的冠狀膠束。采用透析法制備PPEGMA-b-PtBMA載藥膠束。經(jīng)紫外/可見分光光度計表征載藥膠束的丙酮溶液，計算得知PPEGMA-b-PtBMA的載藥量（LC）為4.1%，包封率（EE）為63%，表明該聚合物膠束能有效包裹疏水性藥物。

利用動態(tài)光散射測試了PPEGMA-b-PtBMA組裝膠束的尺寸及其分布范圍。對于PPEGMA-b-PtBMA所形成的膠束，未載藥前膠束的直徑大約為130 nm，載藥后膠束的平均直徑約210 nm，如圖4。就載藥前后膠束的粒徑進(jìn)行對比，載DOX后粒徑明顯增大，表明膠束空腔內(nèi)能包裹一定量的DOX。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對膠束的形貌進(jìn)行觀察，從PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的TEM圖像（圖5）可以觀察到，載藥膠束總體呈球形，尺寸大約為200 nm?？梢?，TEM表征結(jié)果大概與動態(tài)光散射的粒徑表征一致。

圖4 PPEGMA-b-PtBMA膠束的粒徑分布

2.4 DOX的體外釋放性能研究

DOX的體外釋放行為以pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液和pH=4.0的磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，在37℃模擬體溫下進(jìn)行。從圖6可見，在酸性條件下，DOX的釋放率較快，24 h的藥物釋放量可達(dá)76%。而在中性環(huán)境下，DOX的釋放速率明顯減慢，24 h的釋放率僅為37%。由于載藥膠束在不同pH環(huán)境下其藥物釋放量差距較大，初步推斷此聚合物膠束具有pH敏感性。在pH=7.4的環(huán)境下（相當(dāng)于人體的正常體內(nèi)環(huán)境），藥物的釋放緩慢，有利于藥物在體內(nèi)的循環(huán)，降低藥物的使用劑量，減少藥物對人體的副作用。而在pH=4.0的環(huán)境下（相當(dāng)于人體腫瘤部位的所處環(huán)境），藥物快速釋放，有利于在短時間內(nèi)作用于病患位置，減少治療時間。

圖5 PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的TEM圖像

圖5 PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的體外釋放曲線

3 結(jié)論

本文通過設(shè)計合成一種pH響應(yīng)兩親性兩嵌段的聚合物PPEGMA-b-PtBMA，使其在水溶液中發(fā)生自組裝成核-殼結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步研究其載藥及藥物釋放性能，認(rèn)定該聚合物符合難溶性藥物遞送的用途。通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ARGET ATRP）合成了該嵌段共聚物，并用核磁共振對聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。使用熒光探針技術(shù)計算其CMC非常低，說明膠束穩(wěn)定性良好。采用透析法制備PPEGMA-b-PtBMA空白及載藥膠束，并使用透射電鏡、激光粒度儀觀測膠束的粒徑大小及形貌，空白膠束粒徑大約130 nm，載藥膠束粒徑大約210 nm，形狀為球形。載藥膠束具有pH敏感性，在pH值4.0條件下的釋放速率明顯高于pH值7.4條件下的釋放速率，說明該膠束可快速作用于病患位置。這種粒徑小，具有pH敏感性，通過活性基聚合，生物降解性良好的納米級載藥膠束，為研發(fā)新一代的納米級載藥膠束提供了理論基礎(chǔ)及技術(shù)指導(dǎo)。