草珊瑚粗多糖對運動性骨骼肌損傷(EIMD)的干預(yù)效果及機制

王 勇 ，侯改霞，劉艷秋

（1.三明學(xué)院 體育與康養(yǎng)學(xué)院，福建 三明 365004；2.河南大學(xué) 體育學(xué)院，河南 開封475001）

草珊瑚是我國傳統(tǒng)的中藥，學(xué)名Sarcandra glabra(Thunb).Nakai，金粟蘭科草珊瑚屬多年生常綠亞灌木，《中國藥典》記載其性味苦辛、平，具清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[1-2]，草珊瑚具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、祛風(fēng)活血、消腫止痛、促進骨折愈合等多種藥理作用。劉艷秋[3]研究認為草珊瑚多糖有防止細胞凋亡、抗氧化、改善應(yīng)激負荷大鼠的免疫功能及抗疲勞作用，謝勇[4]研究認為草珊瑚多糖是草珊瑚抗炎作用的主要活性部位。本研究通過大鼠大強度離心運動訓(xùn)練，觀察骨骼肌組織出現(xiàn)的損傷特征及炎癥因子NLRP3、IL-18和IL-1β的表達情況，為進一步研究大強度離心運動對骨骼肌細胞所形成的損傷現(xiàn)象，并探討伴隨的炎癥反應(yīng)過程及草珊瑚粗多糖對炎癥反應(yīng)因子表達的抑制效果。

長時間大強度運動后會引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性變化出現(xiàn)運動性骨骼肌損傷(exerciseinduced muscle damage，EIMD)，徐飛[5]研究認為大強度離心運動造成肌纖維微損傷和延遲性肌肉酸痛是EIMD的主要癥狀，后者可導(dǎo)致機體運動能力顯著降低，嚴重影響運動訓(xùn)練和比賽。關(guān)于EIMD的發(fā)生機制國內(nèi)外學(xué)者進行大量的研究，主要包括機械牽拉學(xué)說、代謝學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說等,有研究認為[6]代謝因素可能是EIMD發(fā)生中心環(huán)節(jié)，包括肌糖原的耗竭與再生障礙、氧化應(yīng)激增強、離子代謝紊亂等。本研究主要從EIMD發(fā)生的代謝因素角度出發(fā)，旨在觀察草珊瑚粗多糖對減輕和延緩EIMD癥狀及其修復(fù)效果，為運動營養(yǎng)補劑提供參考依據(jù)。

研究［7］認為，運動訓(xùn)練后肌肉損傷伴隨著炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激過程，而該過程也是肌纖維重塑及功能強化的必經(jīng)過程，是伴隨運動訓(xùn)練出現(xiàn)的常見現(xiàn)象。骨骼肌細胞在大強度離心運動時由于大強度牽拉肌細胞，骨骼肌出現(xiàn)運動性損傷（EIMD）,肌纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞、變性、壞死、血腫現(xiàn)象明顯，損傷后繼發(fā)炎癥細胞和致炎因子浸潤至損傷部位，發(fā)生炎癥反應(yīng)，將直接影響到運動者的體育鍛煉與運動訓(xùn)練水平的提高。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物

實驗使用成年健康雄性SD大鼠，24只，SPF級，體重250～300 g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，大鼠隨機分為損傷組（M）、自然恢復(fù)組（N）、草珊瑚干預(yù)組（S），另增設(shè)安靜對照組（C），每組6只。

1.1.2 實驗材料

草珊瑚多糖的提取采用邵佳等[8]的提取工藝，將全草經(jīng)粉碎-乙醇浸提-烘干-水浴浸提-醇析等過程提取得草珊瑚粗多糖，草珊瑚是由福建省三明市草珊瑚國家種植基地提供。

1.2 動物模型

在實驗過程中大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫(24±3)℃、濕度 45%～60%，自由飲水和進食,采用自然光照。運動造模方案：采用四周連續(xù)下坡跑離心運動，跑臺坡度設(shè)為-16°，每周運動5 d。

表1 大鼠大強度離心運動運動方案

1.3 實驗取材

最后一次離心運動結(jié)束24 h后，安靜對照組（C）與損傷組（M）大鼠采用腹腔內(nèi)注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血，取材。自然恢復(fù)組（N）采用自然恢復(fù)7 d，草珊瑚干預(yù)組（S）按大鼠體重210(mg/kg)·(BW/d)灌胃給藥，共7 d。自然恢復(fù)組（N）和草珊瑚干預(yù)組（S）大鼠在最后一次給藥后，大鼠過夜禁食12 h后，稱重后腹腔麻醉，剖腹，腹主動脈采血，取材。

1.4 測試指標與方法

1.4.1 指標測試

乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，ELISA試劑盒購自e Bioscience，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo，實驗嚴格按試劑盒說明操作。

1.4.2 RNA提取及q PCR檢測mRNA表達

Trizol提取大鼠股四頭肌總RNA。取2 μg RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。根據(jù)說明書利用PCR試劑盒進行Real-time PCR系統(tǒng)檢測，每個樣本設(shè)3組獨立重復(fù)實驗。實驗所用引物序列見表 2。

表2引物經(jīng)武漢賽維爾生物科技有限公司合成后按照Bio-Rad的SYBR體系進行 qPCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過溶解曲線檢驗，將目的基因擴增產(chǎn)物與內(nèi)參基因βactin 進行比較，經(jīng) 2-ΔΔct方法計算出該基因信使 RNA (messenger RNA，mRNA)的相對表達量。

1.4.3 電鏡標本制備與圖片

取經(jīng)固定的大鼠比目魚肌，經(jīng)漂洗-后固定-脫水-滲透-包埋-染色等步驟處理，經(jīng)透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

表2 人相關(guān)基因的引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果用GraphPad Prism 5.0和SPSS 22.0進行處理，結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)進行組間t-檢驗，顯著性差異以 P＜0.05和 P＜0.01表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同組別大鼠骨骼肌電鏡觀察

通過對骨骼肌組織電鏡（圖1）觀察，從肌原纖維、肌小節(jié)的排列狀況，肌節(jié)中I帶和A帶的完整性以及Z線的變化情況等指標進行分析?？梢奀組中的肌原纖維排列整齊，肌節(jié)、Z線清晰排列整齊；從M組則可明顯觀察到肌原纖維與肌節(jié)紊亂，肌節(jié)參差不齊，肌絲排列改變、粗肌絲相互位置紊亂、部分肌絲斷裂或消失，Z線出現(xiàn)異常包括Z帶扭曲、Z線波形變化；N組可見有一定修復(fù)與改善，肌原纖維肌節(jié)與Z線結(jié)構(gòu)等得到一定程度上的修復(fù)改善；S組則基本修復(fù)正常，肌原纖維、肌節(jié)排列、Z線結(jié)構(gòu)基本正常。

圖1 不同組別大鼠骨骼肌電鏡觀察（×6000）

2.2 草珊瑚多糖對大強度離心運動大鼠血清CK、LDH活性的影響

由表3和圖2均可以看出大強度離心運動后M組和N組血清中CK、LDH的活性出現(xiàn)明顯升高，分別具有顯著性（P＜0.05）和極顯著性（P＜0.01）；而S組血清中CK活性比M組、N組有顯著性降低分別具有顯著性（P＜0.05）和極顯著性（P＜0.01），與安靜對照組相比無顯著變化；S組血清中LDH活性比M組和N組均有顯著性下降（P＜0.05），與N組相比無明顯變化?？梢钥闯龃髲姸入x心運動后大鼠血清中的CK、LDH的活性有顯著性提高，表明大強度離心運動后骨骼肌出現(xiàn)的EIMD導(dǎo)致CK和LDH活性增加，草珊瑚多糖干預(yù)后的CK、LDH活性得到良好的影響，活性明顯低于M組，提示草珊瑚多糖對大強度離心運動后的骨骼肌EIMD具有良好的干預(yù)效果，對骨骼肌后續(xù)的修復(fù)起到重要意義。

表3 草珊瑚粗多糖對大鼠血液CK、LDH的活性影響

圖2 大強度離心運動后大鼠骨骼肌血清CK、LDH的活性變化

2.3 草珊瑚多糖對大強度離心運動大鼠血清TNF-α含量的影響

由表4和圖3可以看出大強度離心運動后大鼠血清中TNF-α含量的變化，與安靜對照組相比，各組大鼠血清中TNF-α含量均有顯著性升高分別為P＜0.05和 P＜0.01；草珊瑚干預(yù)組與運動損傷組和自然恢復(fù)組相比大鼠血清中TNF-α含量有明顯下降分別為P＜0.05和 P＜0.01。大強度離心運動后大鼠血清中TNF-α含量的變化，表明大強度離心運動后機體存在明顯的炎癥反應(yīng)過程，而草珊瑚多糖干預(yù)后的大鼠血清中TNF-α含量明顯低于自然恢復(fù)組，提示草珊瑚多糖具有良好的抗炎消炎，保護骨骼肌組織的效果。

表4 草珊瑚粗多糖對大鼠血清中TNF-α含量的變化

圖3 大強度離心運動后大鼠血清中TNF-α的含量變化

2.4 大強度離心運動后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18基因的表達

表5和圖4可以看出，因大強度離心運動后所致EIMD，伴隨炎癥反應(yīng)的IL-1β、IL-18在骨骼肌中的表達水平升高。與安靜對照組相比，M組和N組的大鼠骨骼肌中的IL-1β、IL-18表達水平升高，具有極顯著性（P＜0.01）；S組與M組和N組相比，S組的骨骼肌中IL-1β、IL-18的表達水平均有明顯下降，具有顯著性（P＜0.05），其中S組和M組中IL-18的表達水平具有極顯著性差異（P＜0.01）?？梢钥闯龃髲姸入x心運動后大鼠骨骼肌因EIMD的原因，IL-1β、IL-18蛋白表達水平均有顯著性提高，表明組織中存在明顯的炎癥反應(yīng)過程，而草珊瑚多糖具有良好的抑制二者表達。

表5 大強度離心運動后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18基因的表達

圖4 大強度離心運動后大鼠骨骼肌IL-1β、IL-18的表達

3 結(jié)果與討論

3.1 大強度離心運動致EIMD微觀結(jié)構(gòu)變化

研究[9]表明，大強度離心運動可對骨骼肌細胞產(chǎn)生顯著的刺激，更易出現(xiàn)運動性的肌損傷EIMD，這種運動損傷常見于人們體育鍛煉和運動訓(xùn)練中，而骨骼肌損傷后局部將出現(xiàn)肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、變性、壞死、血腫[10],之后炎癥細胞和致炎因子浸潤至損傷部位，發(fā)生炎癥反應(yīng)。雖然隨后的肌肉會發(fā)生再生修復(fù)，但炎癥反應(yīng)將直接影響到運動者的運動訓(xùn)練的過程及水平。有研究認為運動訓(xùn)練過程中肌肉損傷和炎癥發(fā)生是骨骼肌收縮導(dǎo)致肌節(jié)重塑及功能強化的的必經(jīng)過程，是伴隨運動訓(xùn)練出現(xiàn)的常見生理現(xiàn)象[11]。研究發(fā)現(xiàn)，大強度離心運動后大鼠骨骼肌組織電鏡中可明顯觀察到肌原纖維與肌節(jié)紊亂，肌節(jié)參差不齊，肌絲排列改變、粗肌絲相互位置紊亂、部分肌絲斷裂或消失，Z線出現(xiàn)異常包括Z帶扭曲、Z線波形變化；通過一周自然修復(fù)，可見肌原纖維肌節(jié)與Z線結(jié)構(gòu)等到一定程度上的修復(fù)改善。大量研究顯示骨骼肌在離心運動后出現(xiàn)包括肌絲紊亂、排列不規(guī)則、Z帶扭曲及細胞漿Ca2+代謝紊亂等[12-14]，與本實驗結(jié)果相符。

本研究認為由于肌細胞受到大強度張力下將激活鈣蛋白酶水解過程,致使肌節(jié)被拆解成有利于修復(fù)損傷的蛋白或合成新的蛋白并進行重塑，而肌節(jié)拆卸和重塑過程必然經(jīng)歷了肌肉損傷和炎性細胞浸潤過程。本研究中發(fā)現(xiàn)草珊瑚粗多糖干預(yù)下的大鼠骨骼肌肌原纖維、肌節(jié)排列、Z線結(jié)構(gòu)得到較好的修復(fù)效果，干預(yù)途徑與草珊瑚粗多糖較好的抗炎、消炎活性效果相關(guān)，能有效改善骨骼肌細胞損傷后的炎性反應(yīng)過程，從而有效促進骨骼肌細胞微結(jié)構(gòu)的修復(fù)過程。

3.2 EIMD對血清中CK、LDH的影響

肌酸激酶(CK)屬于能量代謝酶,作為大分子蛋白主要存在骨骼肌與心肌等組織細胞內(nèi)，乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解通路中的主要酶，可催化乳酸→丙酮酸轉(zhuǎn)換過程。研究認為，血清CK和LDH的活性是評價骨骼肌的損傷狀況的敏感指標，EIMD后血清中CK、LDH活性可顯著增加，血清CK和LDH活性越高，核磁共振成像（MRI）信號越強，骨骼肌機械損傷越嚴重［15］。馬新東等［16］通過一次性間歇離心運動模型來觀察大鼠骨骼肌骨架蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)運動后大鼠血清CK及LDH活性非常顯著高于安靜對照組水平，隨后逐漸下降。文中研究結(jié)果顯示大強度離心運動致骨骼肌出現(xiàn)EIMD，導(dǎo)致血清中的CK、LDH的活性水平有顯著性提高，而草珊瑚粗多糖干預(yù)能有效降低血清中CK、LDH的活性，提示草珊瑚粗多糖對大強度離心運動后的骨骼肌EIMD具有良好的干預(yù)效果，對骨骼肌細胞的修復(fù)和重塑起到了重要意義，有效改善了骨骼肌細胞修復(fù)的過程。

3.3 EIMD對TNF-α、IL-1β、IL-18等致炎因子的影響

研究認為，免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)兩種反應(yīng)過程與內(nèi)環(huán)境關(guān)聯(lián)密切，其中白細胞介素、腫瘤壞死因子超家族、生長因子等細胞因子對兩種反應(yīng)過程具有重要意義[17]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有誘導(dǎo)細胞凋亡、壞死及激活淋巴細胞因子等多種抗腫瘤活性，發(fā)揮抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能［18-19］,在機體受到刺激時，巨噬細胞會迅速釋放TNF-α和IL-1β等細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)作用。通常較低濃度的TNF-α，可在一定程度上能保護機體，而高濃度則是重要的促炎癥遞質(zhì)，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的許多病理過程，使機體器官甚至系統(tǒng)多處受損[20]，研究中顯示TNF-α在大強度離心運動后血清中濃度顯著性增加，草珊瑚多糖干預(yù)下能有效降低其濃度，顯示出對骨骼肌的炎癥反應(yīng)有良好的干預(yù)以及對組織保護作用。白細胞介素-18（IL-18）是由巨噬細胞分泌的具有促炎作用的細胞因子，在對病原體天然免疫的防御中起重要作用，而白細胞介素-1β（IL-1β）是主要由白細胞特別是單核巨噬細胞產(chǎn)生的炎性因子，參與機體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答過程，二者促炎細胞因子成熟后被分泌到細胞外發(fā)揮其生物學(xué)作用而形成相應(yīng)的炎性反應(yīng)過程[21]。

本研究顯示IL-1β、IL-18等炎性因子的表達水平，伴隨肌細胞損傷過程，血清中的CK、LDH活性升高，提示大強度離心運動所致的EIMD造成肌細胞結(jié)構(gòu)的破壞，TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子表達水平有顯著性升高，顯示出機體的炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)出增高狀態(tài)；其作用機制可能與大強度離心運動致骨骼肌細胞出現(xiàn)EIMD，而EIMD進一步促進免疫調(diào)節(jié)機制，通過對巨噬細胞產(chǎn)生相關(guān)效應(yīng)、引起炎癥反應(yīng)過程加強，而草珊瑚粗多糖干預(yù)能有效降低炎癥反應(yīng)各相關(guān)指標，提示草珊瑚粗多糖可通過降低組織炎癥反應(yīng)過程對大強度離心運動產(chǎn)生的EIMD具有良好的修復(fù)和保護作用。

3.4 草珊瑚粗多糖對EIMD改善的效果及可能性機制

草珊瑚含豐富的多糖、黃酮類化合物以及鐵、硒、錳、鎂、鋅、銅等物質(zhì)。研究表明草珊瑚多糖具有良好的抗炎活性作用[4]，可以提高IL-1β，IL-10，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表達[1]，草珊瑚多糖其作用主要通過抑制細胞一氧化氮表達及巨噬細胞吞噬活性，調(diào)節(jié)巨噬細胞促炎和抗炎性細胞因子的表達，對免疫平衡功能進行調(diào)節(jié)。

研究中顯示出大強度離心運動后大鼠骨骼肌組織出現(xiàn)EIMD，肌纖維結(jié)構(gòu)可明顯觀察到肌原纖維與肌節(jié)紊亂，肌節(jié)參差不齊，肌絲排列改變、粗肌絲相互位置紊亂、部分肌絲斷裂或消失，Z線出現(xiàn)異常包括Z帶扭曲、Z線波形變化等現(xiàn)象。草珊瑚粗多糖的干預(yù)對于機體的炎癥反應(yīng)有良好的影響，其中TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子在草珊瑚多糖的作用下起到良好的抑制作用，骨骼肌組織中肌原纖維、肌節(jié)與Z線結(jié)構(gòu)得到一定程度上的修復(fù)與重塑。研究顯示出草珊瑚粗多糖對EIMD的干預(yù)機制可能是通過其抗炎消炎、抑制致炎因子的水平，改善機體的炎癥反應(yīng)，來有效改善大強度離心運動后的骨骼肌損傷，并對損傷后骨骼肌結(jié)構(gòu)修復(fù)和重塑過程起到良好的作用。

4 結(jié)論

大強度離心運動致使大鼠骨骼肌組織出現(xiàn)損傷，并伴隨炎癥反應(yīng)過程，草珊瑚粗多糖能夠有效干預(yù)炎性反應(yīng)，促進骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)修復(fù)。因此研究得到以下結(jié)論：

（1）M組骨骼肌細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性變化，可見肌節(jié)排列紊亂，出現(xiàn) Z線流、Z線波形變化等，N組可見有一定修復(fù)與改善，S組則基本修復(fù)，肌節(jié)排列、Z線結(jié)構(gòu)基本正常；

（2）大強度離心運動后骨骼肌與血清中的肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子（TNF-α）活性升高，同時IL-1β、IL-18蛋白表達在大鼠大強度離心運動后顯著性升高，自然修復(fù)7d后仍然保持較高水平，這些指標呈現(xiàn)出骨骼肌損傷表現(xiàn)及生理修復(fù)情況；

（3）草珊瑚粗多糖在干預(yù)7d后能夠有效改善相關(guān)酶上午活性，并抑制相關(guān)炎性因子的表達水平，顯現(xiàn)出草珊瑚能夠?qū)\動性骨骼肌微損傷EIMD具有良好的改善效果，其可能性機制可能與炎性因子的調(diào)控有關(guān)。