馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲SCAR標(biāo)記的建立及應(yīng)用

郭木娟，陳詩敏，庾家琪，葉翠怡，邱寶利，李文香，潘慧鵬*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)害蟲生物防治工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北張家口 075000)

馬鈴薯瓢蟲Henosepilachnavigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢蟲Henosepilachnavigintioctopunctata(Fabricius)均被稱為二十八星瓢蟲，屬鞘翅目瓢蟲科。馬鈴薯瓢蟲以成蟲越冬，多分布在我國北方地區(qū)，其成蟲體形為半球形、赤褐色，各鞘翅上均具有14個(gè)黑斑(郭文英等，2005)，其主要為害的經(jīng)濟(jì)作物有馬鈴薯、茄子、番茄及辣椒等茄科蔬菜，但以危害馬鈴薯為主(高芳瑞，2018)。茄二十八星瓢蟲的外形與馬鈴薯瓢蟲相似度極高，危害的農(nóng)作物種類也幾乎相同，但茄二十八星瓢蟲以危害茄子為主，分布的范圍更為廣泛(張曉寧和歐曉紅，2010)。兩種瓢蟲的幼蟲及成蟲均以葉片為食，初孵幼蟲主要群集于葉片背面取食葉肉，幼蟲稍大后擴(kuò)散危害，受害葉片通常形成不規(guī)則透明斑或穿孔，后期變?yōu)楹稚枷莅吆?。此外，嫩莖、花瓣、萼片、果實(shí)等也會受其危害，導(dǎo)致植株產(chǎn)量下降、果實(shí)品質(zhì)不佳或植株枯死，嚴(yán)重影響馬鈴薯、茄子等農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(宋萍等，2008；王婧瑜等，2018)。

雖然有文獻(xiàn)提出利用二十八星瓢蟲外表形態(tài)在細(xì)微結(jié)構(gòu)上的區(qū)別來鑒定馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的方法(王波，2012)，但是這兩種害蟲外部形態(tài)的區(qū)分對于非昆蟲分類專業(yè)人員來說仍比較困難。近幾年來，隨著氣候變暖、貿(mào)易發(fā)展及種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的危害越發(fā)嚴(yán)重，發(fā)生范圍有擴(kuò)大蔓延的趨勢(Lüetal.,2019)。然而這兩種二十八星瓢蟲經(jīng)常被人們混為一談，導(dǎo)致難以制定針對性的田間防治方案，因此尋找一種能快速區(qū)分馬鈴薯瓢蟲及茄二十八星瓢蟲的方法十分有必要。

序列特征擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterized amplified regions,SCAR)是基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)發(fā)展而來，經(jīng)過對RAPD標(biāo)記技術(shù)所擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行克隆、測序并分析序列，而后根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)出來的穩(wěn)定性標(biāo)記(黃茜等，2016)。Paran等(1993)首次提出SCAR標(biāo)記技術(shù)后，近二十多年來SCAR標(biāo)記技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域。其中，在昆蟲的種類鑒定方面也被廣泛應(yīng)用，例如，王金娜等(2012)利用SCAR標(biāo)記技術(shù)篩選出能準(zhǔn)確鑒定溫室白粉虱Trialeurodevaporariorum的特異性引物；孟祥欽等(2010)通過SCAR標(biāo)記技術(shù)確立了快速鑒定西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的分子生物學(xué)方法。與其它分子標(biāo)記方法相比，SCAR標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、操作簡便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(馬麗娜等，2017)。

本研究通過對馬鈴薯瓢蟲及茄二十八星瓢蟲進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，找到兩種二十八星瓢蟲中具有的特異性擴(kuò)增條帶后，通過切膠回收、克隆及測序后設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記引物，從而在分子水平上建立快速區(qū)分馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的方法，該鑒定方法高效便捷，且對二十八星瓢蟲的田間精準(zhǔn)性防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試蟲

馬鈴薯瓢蟲2018年5月采于河北省張家口北方學(xué)院的教學(xué)基地，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確定為馬鈴薯瓢蟲；茄二十八星瓢蟲2018年4月采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的龍葵上，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確定為茄二十八星瓢蟲。

1.2 供試試劑

隨機(jī)引物采用生工生物工程(上海)股份有限公司的RAPD通用引物系列，分別為OPH、OPI、OPJ，每個(gè)系列的引物各20條。特異性引物合成以及DNA序列測序均委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司完成。PCR擴(kuò)增中所用到的2XPCR Taq MasterMix購自abm生物科技有限公司，DNA提取所用試劑盒、DNA純化回收所用的試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司、克隆試劑盒購自TAKARA生物技術(shù)有限公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)Maker購自深圳輝諾生物科技有限公司。

1.3 單頭馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲DNA提取

單頭馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲成蟲DNA提取使用DNA提取試劑盒，DNA濃度用微量核酸濃度測定儀測定，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RAPD擴(kuò)增

分別以兩種二十八星瓢蟲的DNA溶液作為模板，利用合成的60條隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩種瓢蟲分別設(shè)置4個(gè)重復(fù)，以確保篩選出穩(wěn)定的特異性條帶。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中包括6 μL ddH2O、10 μL 2XPCR Taq MasterMix、1 μL DNA模板及3 μL RAPD引物(10 mM)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫冗M(jìn)行94℃預(yù)變性4 min，之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(包括94℃變性1 min、37℃退火50 s、72℃延伸95 s)，最后72℃延伸10 min。PCR程序反應(yīng)完成后，從各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中吸取5 μL 于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(120 V,20 min)，并利用凝膠成像分析儀對結(jié)果進(jìn)行分析，明確特異性擴(kuò)增的條帶。

1.5 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的回收克隆

對經(jīng)RAPD擴(kuò)增后在兩種二十八星瓢蟲中獲得的特異性條帶，采用DNA純化回收試劑盒對其進(jìn)行純化回收。然后使用克隆試劑盒，根據(jù)說明書步驟，將純化回收的目的片段連接到PMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)，挑白色陽性克隆于10 μL ddH2O中作為模板，利用通用引物M13(F:5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′,R:5′-CACACAGGAAACAG CTAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證目的條帶，根據(jù)電泳結(jié)果確定目的條帶成功連接到PMD-18T載體上后，將具有目的條帶的模板加入5 mL含Amp的LB培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)(200 rpm,37℃)，將菌液送廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 SCAR引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

基于測序結(jié)果，在https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index網(wǎng)頁上設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記特異性引物，并利用所提取的馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的DNA作為模板，驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括去離子水7 μL、2XPCR Taq MasterMix 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL及DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫冗M(jìn)行94℃預(yù)變性3 min，之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(包括94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物同樣使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增

在60條隨機(jī)引物中，引物OPI-6(AAGGCGGCAG)在馬鈴薯瓢蟲中擴(kuò)增到一條約為750 bp的條帶，而在茄二十八星中沒有擴(kuò)增到此大小的條帶；另外，引物OPJ-15(TGTAGCAGGG)在茄二十八星中擴(kuò)增到一條約為750 bp的條帶，而在馬鈴薯瓢蟲中沒有擴(kuò)增到此大小的條帶。圖1顯示了OPI-6在馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲中的隨機(jī)擴(kuò)增結(jié)果圖譜，圖2顯示了OPJ-15在馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲中的隨機(jī)擴(kuò)增結(jié)果圖譜。

圖1 引物OPI-6在兩種二十八星瓢蟲中的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.1 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPI-6注：M，2 000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4，馬鈴薯瓢蟲；5-8，茄二十八星瓢蟲。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

圖2 引物OPJ-15在兩種二十八星瓢蟲中的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.2 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPJ-15注：M，2 000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4，馬鈴薯瓢蟲；5-8，茄二十八星瓢蟲。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

2.2 SCAR引物擴(kuò)增

對經(jīng)RAPD擴(kuò)增在兩種瓢蟲中分別得到的特異性條帶進(jìn)行DNA切膠回收、克隆并測序后(表1)，根據(jù)測序得到的片段設(shè)計(jì)了兩對SCAR引物，分別為OPI-6 test F:5′-CGTCTCGGGTCTAGAG AT-3′,OPI-6 test R:5′-GACATACCGCCCGATTAG-3′和OPJ-15 test F:5′-GGTATGGAGTATCACCAAT-3′,OPJ-15 test R:5′-ATTCCTCCGTATCTCTTTC-3′。經(jīng)過PCR及凝膠電泳檢測，確定根據(jù)OPI-6 test的測序結(jié)果所設(shè)計(jì)的SCAR引物僅能在馬鈴薯瓢蟲中擴(kuò)增出大小為645 bp的條帶，而根據(jù)OPJ-15 test的測序結(jié)果所設(shè)計(jì)的SCAR引物僅能在茄二十八星瓢蟲中擴(kuò)增出大小為436 bp的條帶。

2.3 SCAR引物靈敏度檢測

經(jīng)微量核酸濃度測定儀檢測，單頭馬鈴薯瓢蟲DNA濃度為146.4 ng/μL，單頭茄二十八星瓢蟲DNA濃度為300.4 ng/μL，將這兩種DNA溶液均依次稀釋10倍作為模板，在馬鈴薯瓢蟲中選取OPI-6 test引物，在茄二十八星瓢蟲中選取OPJ-15 test引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測，結(jié)果表明當(dāng)馬鈴薯瓢蟲DNA濃度稀釋到103倍時(shí)仍能檢測到目的擴(kuò)增條帶，而茄二十八星瓢蟲DNA濃度稀釋到104倍時(shí)仍可以檢測到目的擴(kuò)增條帶，引物靈敏度分別達(dá)到0.1464 ng/μL和0.03004 ng/μL。圖4顯示了OPI-6 test在馬鈴薯瓢蟲不同稀釋倍數(shù)DNA中的擴(kuò)增結(jié)果，圖5顯示了OPJ-15 test在茄二十八星瓢蟲不同稀釋倍數(shù)DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。

圖3 兩對SCAR引物在兩種二十八星瓢蟲中的擴(kuò)增圖譜Fig.3 The amplification profiles of two pairs of SCAR markers in the two 28-spotted ladybeetles注：M，2 000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-2，OPI-6 test(1，馬鈴薯瓢蟲；2，茄二十八星瓢蟲)；3-4，OPJ-15 test(3，馬鈴薯瓢蟲；4，茄二十八星瓢蟲)。Note:M,2 000 bp marker;1-2,OPI-6 test (1,H.vigintioctomaculata;2,H.vigintioctopunctata);3-4,OPJ-15 test (3,H.vigintioctomaculata;4,H.vigintioctopunctata).

圖4 OPI-6 test引物在馬鈴薯瓢蟲不同稀釋倍數(shù)DNA中擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of Henosepilachna vigintioctomaculata with OPI-6 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，單頭馬鈴薯瓢蟲DNA原液146.4 ng/μL；2，DNA濃度稀釋10倍；3，DNA濃度稀釋102倍；4，DNA濃度稀釋103倍；5，DNA濃度稀釋104倍；6，DNA濃度稀釋105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctomaculata was 146.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original DNA of H.vigintioctomaculata.

表1 OPI-6在馬鈴薯瓢蟲與OPJ-15在茄二十八星瓢蟲中特異性擴(kuò)增子核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of the specific amplicons from OPI-6 in Henosepilachna vigintioctomaculata and OPJ-15 in Henosepilachna vigintioctopunctata

圖5 OPJ-15 test在茄二十八星瓢蟲不同稀釋倍數(shù)DNA中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of Henosepilachna vigintioctopunctata with OPJ-15 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，單頭茄二十八星瓢蟲DNA原液300.4 ng/μL；2，DNA濃度稀釋10倍；3，DNA濃度稀釋102倍；4，DNA濃度稀釋103倍；5，DNA濃度稀釋104倍；6，DNA濃度稀釋105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctopunctata was 300.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original genomic DNA of H.vigintioctopunctata.

3 結(jié)論與討論

本研究共篩選出兩條可用于鑒別馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的RAPD引物，分別為OPI-6和OPJ-15。其中根據(jù)OPI-6擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)的SCAR引物OPI-6 test能在馬鈴薯瓢蟲中擴(kuò)增出大小為645 bp的條帶，在茄二十八星瓢蟲中無擴(kuò)增條帶；而根據(jù)OPJ-15擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)的SCAR引物OPJ-15 test能在茄二十八星瓢蟲中擴(kuò)增到大小為436 bp的條帶，在馬鈴薯瓢蟲中無擴(kuò)增條帶。馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的SCAR引物在其DNA的濃度很低時(shí)，仍能檢測到目的擴(kuò)增條帶。所以，這兩對SCAR引物能夠準(zhǔn)確且靈敏的區(qū)分兩種二十八星瓢蟲。

馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲均為我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲，兩者外形相似度極高，寄主植物也幾乎相同，但對于寄主植物的嗜好不同，且對不同種的化學(xué)農(nóng)藥所表現(xiàn)的抗藥性也不相同(張貴森等，2014；牛建群等，2016)。但目前，對于這兩種瓢蟲的防治，還是簡單粗糙的采用同樣的化學(xué)殺蟲劑。隨著近幾年蔬菜種植面積的不斷擴(kuò)增，二十八星瓢蟲在我國蔬菜種植區(qū)頻繁爆發(fā)(魏鴻鈞，1995；周雷等，2014)，嚴(yán)重影響馬鈴薯、辣椒及茄子等茄科蔬菜的經(jīng)濟(jì)效益。因此，準(zhǔn)確區(qū)分這兩種二十八星瓢蟲，能夠針對性地制定防治方案。但是，目前只有文獻(xiàn)提出利用外表形態(tài)特征的細(xì)微差異對馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲進(jìn)行鑒別(虞國躍，2000；張迎春等，2002)，利用該方法對兩種二十八星瓢蟲進(jìn)行鑒別難度較大，且對于標(biāo)本的完整程度有較高的要求。本文首次開發(fā)了快速鑒別馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的分子生物學(xué)方法，該方法操作簡單方便且對標(biāo)本的完整性無要求，對二十八星瓢蟲的精準(zhǔn)防控有重要的意義。

本研究中所設(shè)計(jì)的兩對SCAR引物在兩種二十八星瓢蟲中的擴(kuò)增圖譜單一，靈敏度高，且實(shí)驗(yàn)操作簡單方便，鑒別準(zhǔn)確且快速，成本較低。所以，該鑒別方法能夠及時(shí)監(jiān)測田間兩種二十八星瓢蟲的發(fā)生動態(tài)，掌握其發(fā)生規(guī)律，為制定精準(zhǔn)防治方案提供技術(shù)支持。