褐飛虱ABCB基因的克隆與表達(dá)分析

閘雯俊，李三和，周 雷，陳志軍，劉 凱，楊國才，徐華山，李培德，游艾青,2*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.長江大學(xué)，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，荊州 434025)

所有的細(xì)胞和細(xì)胞器都是通過脂質(zhì)膜與外界環(huán)境分離的，需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來轉(zhuǎn)運(yùn)這些膜上的多種化合物(Higgins CF，1992)。以下事實(shí)證明了膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要性：在大腸桿菌和人類中，約10%和4%的基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白(Blattneretal.,1997)。大多數(shù)ABC蛋白作為主要的活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用，需要結(jié)合和水解ATP來轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)膜上的底物，其轉(zhuǎn)運(yùn)的底物包括糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物和藥物等(王華丙等，2007)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌，是細(xì)菌質(zhì)膜上的一種具有運(yùn)輸功能的ATP酶，由兩個(gè)結(jié)合和水解ATP的胞質(zhì)核苷酸結(jié)合域(NBD)和兩個(gè)完整的跨膜域(TMD)組成。NBD域包含幾個(gè)保守序列，如Walker A (P-loop)、Walker B和特征基序C(吳轉(zhuǎn)斌和吳金美，2008)?？缒そY(jié)構(gòu)域由5～6個(gè)跨膜螺旋組成，并提供底物特異性。功能性轉(zhuǎn)運(yùn)體的4個(gè)結(jié)構(gòu)域可以存在于一種蛋白質(zhì)中，也可以分布在多種蛋白質(zhì)上。在后者的情況下，ABC蛋白需要同二聚體或異二聚體來形成功能性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(Higgins and Linton，2004)。根據(jù)NBD的序列相似性，ABC蛋白家族被分為8個(gè)亞家族，用字母a～h表示。

褐飛虱Nilaparvatalugens屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在中國長江流域和華南及西南廣大稻區(qū)發(fā)生頻繁、危害嚴(yán)重(王傳之等，2008)。本研究從褐飛虱體內(nèi)分離得到ABCB基因，分析了ABCB基因的全長、結(jié)構(gòu)，為研究褐飛虱ABCB基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

RNA干擾是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。高濃度的dsRNA才能保證靶標(biāo)基因的連續(xù)抑制，利用體外合成的dsRNA來喂養(yǎng)昆蟲成本相對(duì)昂貴。HT115(DE3)菌株是一類特殊的RNase III缺陷型大腸桿菌菌株，可以飼喂線蟲，主要用于秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的RNAi干擾試驗(yàn)。該菌株可以在LB或2YT培養(yǎng)基中正常生長，Tn10轉(zhuǎn)座子的存在使其具有四環(huán)素抗性。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶，在IPTG存在時(shí)可誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶大量表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)線蟲dsRNA的表達(dá))，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，除了用于線蟲RNAi干擾試驗(yàn)，也可用于pET系列、pGEX、pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。利用大腸桿菌表達(dá)dsRNA已在粘蟲Mythimnaseparate(Ganbaataretal.,2017)中得以實(shí)現(xiàn)。

利用dsRNA喂養(yǎng)是目前最方便的方法之一，這種方法已經(jīng)在從屬于7個(gè)目15種的昆蟲物種中實(shí)現(xiàn)了。通過喂養(yǎng)，對(duì)于腸道的靶標(biāo)基因表現(xiàn)出極高的沉默效率。對(duì)于其他組織的靶標(biāo)基因而言，RNAi的效率會(huì)因?yàn)榘袠?biāo)基因的不同和昆蟲種屬的不同而差別很大。例如蜜蜂Apismellifera脂肪體的基因，通過喂養(yǎng)會(huì)誘導(dǎo)90%的卵黃蛋白原表達(dá)下降(Nunes and Simoes,2009)；以及美洲散白蟻Reticulitermesflavipes調(diào)控Hexamerin儲(chǔ)存蛋白表達(dá)下降50%～70% (Zhouetal.,2008)；但是對(duì)于刺舌蠅Glossinamorsitans的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白沒有任何的效果(Walsheetal.,2009)。同時(shí)喂養(yǎng)效率也受昆蟲生長發(fā)育的影響。例如利用nitropin 2 dsRNA處理長紅錐蝽Rhodniusprolixus的4齡若蟲沒有效果，但利用2齡若蟲產(chǎn)生了42%的沉默效果(Araujoetal.,2006)。雖然利用dsRNA喂養(yǎng)的方法是非侵入性和方便的方法，不過喂養(yǎng)時(shí)dsRNA的攝取量和RNAi的效率會(huì)因?yàn)閭€(gè)體之間的差異而變得困難(Turneretal.,2006)。

因此，利用此技術(shù)通過人工喂養(yǎng)dsRNA沉默靶標(biāo)而達(dá)到控制褐飛虱的目的。本研究通過構(gòu)建NlABCB-dsRNA載體，轉(zhuǎn)化E.coliHT115后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，形成NlABCB-dsRNA，喂養(yǎng)褐飛虱后，褐飛虱靶標(biāo)基因抑制，存活率下降。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料

褐飛虱品種為武漢大學(xué)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)在感蟲水稻品種臺(tái)中1號(hào)TN1植株上，環(huán)境條件為25±2℃，相對(duì)濕度為80%，光照周期為L ∶D=16 ∶8。

1.1.2試劑

試驗(yàn)所用大腸桿菌E.coliDH5α，ExTaq酶，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體，5′-Full RACE和3′-Full RACE試劑盒購自Takara公司。引物合成及序列測定由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1總RNA的提取

采用TRIzol法抽提褐飛虱樣品的總RNA，具體操作參考Invitrogen公司TRIzol? reagent試劑說明書。

1.2.2cDNA克隆

利用赤擬谷盜Triboliumcastaneum的ABC transporter蛋白(GenBank登錄號(hào):XP_971735.1)褐飛虱的ESTs數(shù)據(jù)庫(http://bphest.dna.affrc.go.jp/)中進(jìn)行TBLASTN查詢，得到相應(yīng)的相應(yīng)EST片段。設(shè)計(jì)RACE外圍引物3′RACE outer和5′RACE outer以及內(nèi)圍引物3′RACE inner和5′RACE inner。3′RACE和5′RACE模板的合成具體按照BDSMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual說明書步驟操作。利用巢式PCR技術(shù)分別擴(kuò)增褐飛虱基因3′端和5′端。或查詢褐飛虱基因組，結(jié)合Augustus、FgeneSH等基因預(yù)測軟件分析，設(shè)計(jì)引物直接從兩端擴(kuò)增全長cDNA。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NlABCB轉(zhuǎn)錄差異

取-80℃保存不同生長發(fā)育時(shí)期褐飛虱和褐飛虱不同組織總RNA定量，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM定量PCR儀(Corbett research)上進(jìn)行10 μL體系的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min，然后以30～40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s)每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen，2001)，比較不同樣品基因表達(dá)水平。

1.2.4生物信息學(xué)分析

測序拼接獲得cDNA全長后，利用ExPASy Translate tool軟件(http://web.expasy.org/translate/)對(duì)翻譯得到相應(yīng)cDNA編碼框進(jìn)行預(yù)測，再利用下列在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測：同源序列比對(duì)利用Clustalw(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)；進(jìn)化樹圖的繪制利用MEGA 7.0軟件；分子量和等電點(diǎn)分析利用ExPASy Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)；二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)。

1.2.5人工喂養(yǎng)dsRNA

取2齡褐飛虱若蟲用人工飼料作適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)，待若蟲發(fā)育至目標(biāo)基因高表達(dá)階段，向人工飼料中添加dsRNA，每頭幼蟲喂養(yǎng)10 μg(1 μg/μL)dsRNA。RNA干擾設(shè)置2～3個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(純?nèi)斯わ暳?和dsGFP對(duì)照組(含dsGFP的人工飼料)。處理時(shí)，每飼喂裝置接入20頭發(fā)育一致的褐飛虱，設(shè)置3個(gè)重復(fù)?？疾熘笜?biāo)包括靶標(biāo)基因表達(dá)量、個(gè)體存活率、生長發(fā)育狀況等。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱NlABCB基因的克隆

以該EST序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物，克隆得到NlABCB基因的5′cDNA片段和3′cDNA片段。5′cDNA序列長度約為0.9 Kb，3′cDNA序列長度約為0.8 Kb。全長序列經(jīng)過測序拼接后，全長為1 468 bp，含有一個(gè)編碼153個(gè)氨基酸的開放開放閱讀框(圖1)。

2.2 NlABCB蛋白分析鑒定

NlABCB 基因編碼153個(gè)氨基酸。應(yīng)用Computer pI/Mw Tool軟件(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析預(yù)測 NlABCB蛋白的分子量為16.8 kDa，等電點(diǎn)為8.8。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，NlABCB 蛋白α螺旋占44.08%，延伸鏈占21.05%，β折疊占9.87%，隨機(jī)卷曲占25%(圖2)。

通過NCBI的Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序進(jìn)行在線蛋白質(zhì)序列比對(duì)，結(jié)果表明該基因與其它昆蟲的ABCB蛋白序列相似性大于72.54%(表2)。例如與灰飛虱Laodelphaxstriatella的同源性為93.42%，最高；與美洲鱟Limuluspolyphemus的同源性為72.54%，最低。由此可以看出褐飛虱 NlABCB 與其它昆蟲的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列相似性較高，其序列相當(dāng)保守。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 NlABCB 的核苷酸和推測氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of NlABCB

表2 褐飛虱NlABCB基因與其它昆蟲NlABCB基因氨基酸相似性比較Table 2 Amino acid similarities of NlABCB gene of Nilaparvata lugens and other insects

2.3 褐飛虱 NlABCB 基因不同生長發(fā)育時(shí)期和組織的分析

為了解NlABCB基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體中和蟲體不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況，分別提取1齡至5齡發(fā)育至24 h的若蟲和雌雄成蟲蟲體的總RNA以及5齡若蟲的中腸、唾液腺、脂肪體、表皮、腿和頭部組織的總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測該基因在褐飛虱不同發(fā)育階段蟲體中和不同組織的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因在雄成蟲的表達(dá)量較高(圖3)。在不同組織中，在中腸的表達(dá)量最高(圖4)。

圖3 NlABCB 基因在不同生長發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.3 Expression of NlABCB at different growth and development stages

圖4 NlABCB 基因在不同組織的表達(dá)分布Fig.4 Expression and distribution of NlABCB in different tissues

2.4 褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達(dá)及其RNAi效果

以褐飛虱cDNA為模板，擴(kuò)增褐飛風(fēng)ABCB基因片段。Nco I和Sma I雙酶切L4440載體后，轉(zhuǎn)入菌株HT115后，IPTG便可表達(dá)dsRNA(圖5)。分別讓褐飛虱取食NlABCB-dsRNA進(jìn)行RNAi。首先檢測褐飛虱取食dsRNA后，對(duì)其體內(nèi)NlABCBmRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：褐飛虱取食dsRNA后，第2天和第4天分別抑制了25%和48%。因此，人工喂養(yǎng)dsRNA可以抑制靶基因表達(dá)，效果顯著(圖6)。同時(shí)，褐飛虱取食dsRNA后，致死效果明顯。取食NlABCB-dsRNA后，其存活率顯著低于對(duì)照組，對(duì)照組和試驗(yàn)組1 d、2 d、3 d、4 d的存活率分別為88.77%和86.67%、76.9%和70.78%、65.75%和55.67%、56.72%和46.69%。因此NlABCB基因可以進(jìn)一步應(yīng)用于褐飛虱抗蟲(圖7)。

圖5 褐飛虱 NlABCB 的dsRNA電泳圖Fig.5 The dsRNAs produced by the BPH NlABCB gene

圖6 褐飛虱取食dsRNA后 NlABCB mRNA的表達(dá)Fig.6 Expression of NlABCB mRNA in Nilaparvata lugens after feeding on dsRNA

圖7 褐飛虱取食dsRNA后存活率Fig.7 Survival rate of brown planthopper after feeding on dsRNA

3 結(jié)論和討論

ABCB亞家族由半個(gè)(HTS)和整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體(FTS)組成。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中的ABCB-FTS已經(jīng)被廣泛研究，MDR65(ABCB)通過創(chuàng)建血紅素屏障來對(duì)果蠅大腦進(jìn)行化學(xué)保護(hù)(Mayeretal.,2009)，MDR49(ABCB)在生殖細(xì)胞遷移中起著至關(guān)重要的作用(Ricardo and Lehmann，2009)。此外，研究表明果蠅接觸到多環(huán)芳烴會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)的ABCB FT/P-gfp表達(dá)(Vachetal.,2006)。同時(shí)給果蠅食物中添加含有0.1 mmol的抗葉酸藥物甲氨蝶呤后，在果蠅成蟲的馬氏管和腸道中，MDR49(ABCB)、MDR50(ABCB)的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。另一方面，Broehan等人發(fā)現(xiàn)給蛹前期的赤擬谷盜注射ABCB- dsRNA后，赤擬谷盜的蛹成蟲期會(huì)有嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，從而致死；同時(shí)卵巢不能產(chǎn)卵導(dǎo)致雌性不育(Broehanetal.,2013)。

最近的一些成功的例子表明dsRNA喂養(yǎng)可用于作為一種潛在的防治害蟲方式。Baum等通過篩選玉米根蟲DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte 的cDNA文庫鑒定了290個(gè)編碼重要蛋白的靶標(biāo)基因，發(fā)現(xiàn)52 ng/cm2濃度的dsRNA可以產(chǎn)生明顯的死亡率和發(fā)育遲緩(Baumetal.,2007)。通過取食獲得RNAi的效果已在多種昆蟲中得以實(shí)現(xiàn)，如蘋果褐卷蛾P(guān)andemisheparana(Turneretal.,2006)，美洲散白蟻(Zhouetal.,2008)，長紅錐蝽(Araujoetal.,2006)等當(dāng)中都有發(fā)現(xiàn)，所以這已經(jīng)成為一種控制害蟲的新方法。

本研究克隆得到NlABCB基因的全長，并且將氨基酸序列與其他昆蟲的ABCB進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與灰飛虱、濕木白蟻的ABCB蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。并且對(duì)褐飛虱ABCB蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白α螺旋占44.08%，延伸鏈占21.05%，β折疊占9.87%，隨機(jī)卷曲占25%。同時(shí)鑒定了NlABCB基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體中和蟲體不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況，該基因在雌性成蟲的表達(dá)量較高。在不同組織中，在中腸的表達(dá)量最高。中腸組織是昆蟲腸道組織中唯一與細(xì)胞表面直接接觸的。同時(shí)有研究表明家蠶Bombyxmori中的ABCB基因是特異表達(dá)的，在蛻皮和化蛹期間受20E正調(diào)節(jié)(Liuetal.,2011)。同時(shí)構(gòu)建L4440-NlABCB的dsRNA載體，轉(zhuǎn)化E.coliHT115后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，形成NlABCB-dsRNA,喂養(yǎng)褐飛虱取食含NlABCB-dsRNA人工飼料，發(fā)現(xiàn)褐飛虱的存活率明顯降低。

因此，褐飛虱NlABCB基因的表達(dá)特征表明，利用農(nóng)藥防治褐飛虱的最佳時(shí)期是在早齡期。這些結(jié)果可能有利于開發(fā)一些以NlABCB基因?yàn)榘袠?biāo)的安全有效的殺蟲劑，同時(shí)可以利用RNA干擾的方法來抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，達(dá)到控制害蟲的目的。