糖類和植物生長調節(jié)劑對冬蟲夏草子實體人工培養(yǎng)的影響

陶海平，曹 莉，韓日疇*

(1.華南農業(yè)大學農學院，廣州 510640；2.廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣東省生物資源應用研究所，廣州 510260)

冬蟲夏草是青藏高原特有的名貴生物資源，由冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis侵染蝙蝠蛾Thitarodes/Hepialus幼蟲形成的幼蟲尸體與真菌子座復合物(丘雪紅等，2016；韓日疇等，2019)。冬蟲夏草含有多種活性成分，如多糖、核苷、甾醇、蟲草酸等，具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗腫瘤、護肝腎等廣泛藥理作用，與人參、鹿茸并稱“中藥三大寶”(Loetal.，2013；Zhouetal.，2014；丘雪紅等，2016；韓日疇等，2019)。

由于冬蟲夏草菌寄主單一，蝙蝠蛾幼蟲生長期長、生長環(huán)境苛刻、加上人類過度采挖，野生冬蟲夏草日趨枯竭，現已被納入瀕危物種(李文佳等，2016)。為了滿足人們對冬蟲夏草的正當需求，保護野生冬蟲夏草資源，人工培育是必由之路。于廣州低海拔實驗室，從四川、云南、青海分離獲得的冬蟲夏草菌在米飯培養(yǎng)基中成功培育出具有子囊孢子的冬蟲夏草子實體(曹莉和韓日疇，2014；Caoetal.，2015)，這不僅為冬蟲夏草菌的產業(yè)化開辟了新途徑，同時直接證明了中國被毛孢Hirsurellasinensis為冬蟲夏草菌真正的無性型。菌株篩選、培養(yǎng)基組分、溫度以及誘導劑是冬蟲夏草子實體生長的關鍵因子(韓日疇等，2019)。

冬蟲夏草菌在固體和液體培養(yǎng)基中可觀察到分生孢子、芽生孢子和菌絲。冬蟲夏草菌的最佳生長溫度是18～20℃，溫度高于25℃時，菌絲停止生長。最適的pH范圍為5～6；最佳碳源是葡萄糖，氮源是蛋白胨(王忠，2001a，b)。于液體培養(yǎng)基中麥芽糖比葡萄糖更有利于獲得高產量的芽生孢子(Liuetal.，2019)。冬蟲夏草菌液體培養(yǎng)參數包括接種量、溫度、pH、通氣等(李春如等，2004；劉欣等，2013；毛雄民等，2013；Meietal.,2013；賀宗毅等，2016；李婷婷，2017)。從新鮮冬蟲夏草不同部位分離得到的菌株在固體培養(yǎng)基上特性不同；單子囊孢子、雙子囊孢子和多子囊孢子菌株固體發(fā)酵時菌絲生長旺盛，分生孢子產量顯著高于組織分離菌株(呂延華等，2016)。

不同菌株和培養(yǎng)基對子實體產量影響顯著，如采自四川KD1202、云南的YN1202和青海的QH1208冬蟲夏草菌株在人工培養(yǎng)基上子實體出草率分別為50%～67%、30%～35%和3%～5%(Caoetal.，2015)。在食用菌或其它真菌子實體培養(yǎng)過程中，經常使用安全的植物生長調節(jié)劑如吲哚乙酸、赤霉素和2,4-二氯苯氧乙酸等提高子實體的產量(張慧鋒，2005；徐莉等，2008；李珍等，2016)。這些化學試劑通過調節(jié)細胞分裂、細胞增殖、細胞分化和極性，以及促進器官(如根、枝條、葉、花和果)發(fā)育發(fā)揮不同的作用，還調控植物各個生長過程，以及與病原和共生菌的相互作用(Ludwig-Müller，2015；Fricketal.，2018)。國際上已把植物生長調節(jié)劑應用作為21世紀農業(yè)實現超產的主要措施之一(朱杰麗等，2013)。

但是，目前冬蟲夏草子實體人工培養(yǎng)的參數仍未優(yōu)化。為了優(yōu)化人工培養(yǎng)參數，本實驗測定培養(yǎng)基中糖類和植物激素對冬蟲夏草子實體產量的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

冬蟲夏草菌種KD1223從中國四川省康定野生冬蟲夏草中采用常規(guī)方法分離、純化獲得(Caoetal.，2015)。以15%甘油貯存于-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

Hipure Fungal DNA Mini Kit II試劑盒購自Magen公司(中國，廣州)。氯仿、異丙醇、乙醇、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸銨、維生素B1、氯化鈉、酵母膏等購自廣州化學試劑廠；葡萄糖、蔗糖、購自廣州化學試劑廠，麥芽糖購自BioForxx GmbH，蠶蛹粉購自廣東信達繭絲綢股份有限公司。十種化學試劑如6-芐氨基腺嘌呤(6-benzyl adenine，6-BA)、環(huán)磷腺苷(3′,5′-cyclic AMP)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、乙烯利(ethephon)、赤霉素(gibberellin acid，GA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)、α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，α-NAA)、三十烷醇(triacontanol)和玉米素(zeatin)購自Sigma公司。5%、15%、31%、50%的乙醇分別用于溶解α-NAA，吲哚乙酸、玉米素、吲哚丁酸、2,4-D，2%NaOH用于溶解6-BA，1%、4.8%的二甲亞砜(DMSO)分別用于溶解乙烯利、赤霉素，純氯仿用于溶解三十烷醇。配制的試劑在超凈工作臺上以細菌過濾器(0.22 μM，Gelman Sciences)過濾后使用。

1.2 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉16 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min。液體PPDA：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂，20 mg維生素B1，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。固體PPDA：每1 L固體PPDA培養(yǎng)基在液體PPDA培養(yǎng)基加16 g瓊脂粉。PM液體培養(yǎng)基：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g麥芽糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂，20 mg維生素B1，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

大米小麥培養(yǎng)基：100 mL的培養(yǎng)瓶中加入大米8 g、小麥8 g、蠶蛹粉0.4 g，營養(yǎng)液22 mL；營養(yǎng)液配方為每1 L營養(yǎng)液中糖類20 g(葡萄糖、麥芽糖或蔗糖)，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，檸檬酸銨1 g，維生素B1 20 mg；將培養(yǎng)基組分加入100 mL的培養(yǎng)瓶中，室溫下浸泡1 h，然后121℃高壓滅菌1 h，冷卻至室溫備用。

1.3 菌種鑒定

以Hipure Fungal DNA Mini Kit II試劑盒提取液體PPDA培養(yǎng)基中(100 rpm，9～13℃)已培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌DNA。以DNA為模板，參照冬蟲夏草菌通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)、ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′)擴增核糖體DNA(ITS；ITS1-5.8S-ITS2)序列(Caoetal.，2015)，以2×Easy Taq PCR Super Mix進行PCR。反應體系(25 μL)：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，用ddH2O補充至25 μL。反應條件為94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(120 V，20 min)。將PCR產物送至上海生工生物公司測序，測序結果于NCBI中BLAST進行比對，同時構建進化樹證實比對結果。

1.4 子實體培養(yǎng)參數測定

本論文測定的培養(yǎng)參數包括營養(yǎng)液中的糖類(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)和植物生長調節(jié)劑。

總體培養(yǎng)方法如下：于超凈工作臺上將冬蟲夏草菌培養(yǎng)的子實體以無菌剪刀剪碎，再以無菌鑷子夾取2～3塊(長約0.5 cm)加入液體PPDA培養(yǎng)基中，置于120 rpm搖床、9～13℃下培養(yǎng)60 d；以PPDA和LB平板檢測所培養(yǎng)的菌液是否被污染；從上述培養(yǎng)液中取1～3 mL轉接至新的液體PPDA培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)30 d。培養(yǎng)30 d的菌液稀釋一倍后，以每瓶12 mL量(每毫升含分生孢子3×109個，芽生孢子4.5×106個)加入上述大米小麥培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于9～13℃下培養(yǎng)60 d，當米飯小麥培養(yǎng)基表面菌絲全部覆蓋時，將培養(yǎng)瓶置于4℃下誘導原基分化，根據不同參數確定不同時間收獲子實體。

營養(yǎng)液中加入不同糖類(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)的大米小麥培養(yǎng)基中接入PPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的菌液后，9～13℃下培養(yǎng)60 d，然后置于4℃下分別培養(yǎng)第9、10、11個月后收獲子實體，將收獲的子實體置于烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重，記錄不同處理的子實體干重和每瓶的條數。該實驗每個處理設14培養(yǎng)瓶，3個重復，共42瓶。每次隨機取樣4瓶，收獲子實體。

植物生長調節(jié)劑對子實體生長影響測定步驟如下：將10 μL的各種化學試劑與12 mL菌液混合，使每毫升菌液中各種化學試劑的濃度分別為1 μg、10 μg或100 μg，然后分別加入含大米小麥培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。以菌液中分別加入5%、15%、31%、50%乙醇，2%NaOH，1%、4.8%DMSO，100%氯仿作為對照。按照上述方法培養(yǎng)，4℃培養(yǎng)后8個月采收子實體。該實驗每個處理設14培養(yǎng)瓶，3個重復，共42瓶。每次隨機取樣10瓶，收獲子實體。

1.5 數據分析

不同處理下冬蟲夏草菌子實體的干重值以SPSS軟件(16.0 software，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進行T檢驗和方差分析。以Tukey進行處理組之間多重比較。P<0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草菌鑒定

以ITS4、ITS5引物對冬蟲夏草菌DNA進行PCR擴增，將PCR產物測序，得到的序列在NCBI數據庫中進行Blast，發(fā)現與業(yè)已報道冬蟲夏草菌的序列(序列號：EU570927.1)(張倢，2016)相似度達99%，同時進化樹也證明實驗采用菌株為冬蟲夏草菌。

2.2 含糖培養(yǎng)基對子實體培養(yǎng)的影響

冬蟲夏草菌在大米小麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月之后檢查3種糖在培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況。葡萄糖培養(yǎng)基和蔗糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草菌菌絲已經覆蓋培養(yǎng)基表面，呈灰白色；麥芽糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草菌菌絲生長緩慢，菌絲呈稀疏分布，處于米黃色狀態(tài)。說明冬蟲夏草菌在麥芽糖培養(yǎng)基中比在葡萄糖和蔗糖中的長得慢。

培養(yǎng)瓶轉入4℃下7個月進行子實體第一次采收。葡萄糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體長勢最好，條數均值為每瓶8.33條，干重均值為0.4 g；麥芽糖和蔗糖培養(yǎng)基中均未長出子實體。

培養(yǎng)瓶轉入4℃下9個月后，對冬蟲夏草子實體進行第二次采收。葡萄糖培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體已完成生長(子實體占滿培養(yǎng)瓶，且沒有白色氣生菌絲，圖1)，麥芽糖培養(yǎng)基中此時只有短小的子實體，說明葡萄糖培養(yǎng)基中子實體生長比麥芽糖培養(yǎng)基中的快至少2個月；而蔗糖培養(yǎng)基中仍未長出子實體且在培養(yǎng)瓶內出現大量的氣生菌絲。

圖1 培養(yǎng)基含葡萄糖冬蟲夏草菌子實體Fig.1 Medium containing glucose Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：上圖為營養(yǎng)液中含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)9個月的冬蟲夏草菌子實體。Note:The fruit body of Ophiocordyceps sinensis was cultured in glucose medium in nutrient solution for 9 months.

圖2 不同糖類培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體干重差異Fig.2 The dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body was different in different sugar medium注：圖為冬蟲夏草菌在營養(yǎng)液中含有葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的培養(yǎng)基中4℃下培養(yǎng)9個月后子實體干重差異。柱圖中不同字母表差異顯著(P<0.05,T test)。Note:Dry weights of fruiting bodies (at 4℃ after 9 months) of Ophiocordyceps sinensis from the media containing glucose (A);maltose (B);sucrose (C).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,T test).

將收獲的子實體用烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重。葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基的子實體干重顯著差異(t=3.17，df=5.148，P=0.024<0.05)(圖2)。培養(yǎng)基中含葡萄糖時冬蟲夏草子實體產量是麥芽糖的7.6倍，培養(yǎng)基中含蔗糖時未獲得任何子實體，盡管出現大量氣生菌絲。

2.3 植物生長調節(jié)劑對子實體培養(yǎng)的影響

加入環(huán)磷腺苷、三十烷醇和玉米素的培養(yǎng)瓶均未發(fā)現菌絲生長，說明這些化合物強烈抑制冬蟲夏草菌的生長。加入100 μg/mL 6-芐氨基腺嘌呤的培養(yǎng)瓶可見菌絲生長，但未見原基分化。

加有1 μg/mL赤霉素或α-萘乙酸的培養(yǎng)瓶未長出菌絲，但在加入濃度為10 μg/mL、100 μg/mL時均有菌絲長出，似乎低濃度的赤霉素或α-萘乙酸對冬蟲夏草菌的生長具有抑制作用。2,4-D濃度為10 μg/mL、100 μg/mL時，培養(yǎng)瓶中冬蟲夏草菌均未長出菌絲，但加入濃度為1 μg/mL的培養(yǎng)瓶中菌絲生長，說明10 μg/mL和100 μg/mL的2,4-D對冬蟲夏草菌生長具有明顯抑制作用，但1 μg/mL濃度支持菌絲生長。

轉入4℃下6個月后，收獲子實體。各處理間子實體干重數據單因素方差分析，結果顯示，8個不同種類和濃度的溶劑與對照均未見顯著差異(df1=7，df2=112，F=0.690，P=0.681)(P>0.05)(圖3)，說明不同種類和濃度的溶劑對冬蟲夏草子實體的生長未產生顯著影響；但是，各處理間差異顯著(df1=10，df2=153，F=32.927，P=0.000)(P<0.05)(圖4)。

圖3 不同種類和濃度的溶劑對冬蟲夏草子實體生長的影響Fig.3 Effects of different kinds and concentrations of solvents on the growth of Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：不同種類和濃度的溶劑(2%NaOH，5%、15%、31%和50%乙醇，1%、4.8%DMSO，100%氯仿)與對照(未加入任何植物生長調節(jié)劑和溶劑)培養(yǎng)瓶中冬蟲夏草子實體的干重。柱圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05,Tukey test) 。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the culture bottles containing different solvents (2%NaOH，5%、15%、31% and 50% ethanol，1%、4.8%DMSO，100%chloroform) and from the control (without any plant growth regulators or solvents).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,Tukey test).

圖4 不同植物激素種類和濃度對冬蟲夏草子實體干重的影響Fig.4 Effects of different plant hormone types and concentrations on the dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body注：圖為加入不同種類和濃度植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體干重的比較。IAA，吲哚乙酸；IBA，吲哚丁酸；GA，赤霉素；ETH，乙烯利；α-NAA，α-萘乙酸；2,4-D，2,4-二氯苯氧乙酸；CK，對照(未加入任何植物生長調節(jié)劑)。1，2，3表示濃度1 μg/mL，10 μg/mL和100 μg/mL。柱圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05，Tukey test)。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the media containing different kinds and concentrations plant growth regulators at three concentrations.IAA,indole-3-acetic acid;IBA,indole-3-butyric acid;GA,gibberellin acid;α-NAA,α-Naphthalene acetic acid;2,4-D,2,4-dichlorophenoxyacetic acid;CK,control (without any plant growth regulators).1,2,3 indicate the concentrations of 1 μg/mL,10 μg/mL or 100 μg/mL.Bars with different letters indicate significant difference (P <0.05,Tukey test).

與對照相比，加入100 μg/mL吲哚乙酸，1 μg/mL 和100 μg/mL吲哚丁酸，10 μg/mL赤霉素，1 μg/mL和10 μg/mL乙烯利，以及1 μg/mL 2,4-D的培養(yǎng)瓶中子實體干重均顯著提高(圖4)，其中加入1 μg/mL吲哚丁酸和1 μg/mL 2,4-D的培養(yǎng)瓶的子實體產量是對照的15倍。加入100 μg/mL赤霉素，100 μg/mL乙烯利以及10 μg/mL α-NAA-2的培養(yǎng)瓶子實體產量與對照的均沒有顯著差異。

可知吲哚乙酸在濃度范圍為1～100 μg/mL時，低濃度時對子實體產量具有抑制作用，高濃度時具有促進作用。吲哚丁酸在測定濃度范圍時均對冬蟲夏草子實體產量具有促進作用(加入10 μg/mL的處理由于受到污染未獲得數據)。當赤霉素和乙烯利濃度為10 μg/mL時子實體產量最高。α-萘乙酸在低濃度和高濃度都表現出抑制作用，中間濃度未產生抑制和促進作用。加入1 μg/mL 2,4-D對子實體產量具有強烈的促進作用，但濃度增加后產生抑制作用。

3 結論與討論

本實驗研究結果表明培養(yǎng)基營養(yǎng)液中加入不同糖類時冬蟲夏草子實體干重葡萄糖>麥芽糖>蔗糖。各類糖如葡萄糖、麥芽糖和蔗糖等已廣泛用于真菌或食用菌子實體的培養(yǎng)。不同真菌最佳糖源多樣，如桑黃菌(蔗糖)(吳亞召等，2014)、白靈菇Pleurotusnebrodensis(可溶性淀粉)(李珍等，2015)、雙胞蘑菇Agaricusbisporus(麥芽糖)(張倢，2016)、秀珍菇Pleurotusgeesteranus(麥芽糖)(李碧瓊等，2017)、雞樅菌Termitomycesalbuminosu(蔗糖)(李艷麗，2018)和蛹蟲草Cordycepsmilitaris(蔗糖)(楊心如等，2019)。顯然，這與真菌的糖代謝能力有關。本實驗中，加入葡萄糖的大米小麥培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體的生長速率和干重顯著優(yōu)于麥芽糖培養(yǎng)基的。在液體培養(yǎng)基中，麥芽糖比葡萄糖更有利于獲得高產量的芽生孢子(Liuetal.，2019)?？赡苡欣谘可咦由L的麥芽糖不利于大米小麥固體培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實體的形成。有趣的是，與許多真菌不同，蔗糖不利于冬蟲夏草形成子實體，盡管在培養(yǎng)基中出現大量氣生菌絲。誘導冬蟲夏草子實體形成的糖代謝通路值得進一步研究。

在本實驗結果中1 μg/mL IBA和2,4-D對冬蟲夏草菌子實體生長促進效果最佳。植物生長調節(jié)劑是包括人工合成的化合物和從生物中提取的天然植物激素，用于有效調節(jié)作物生育過程，達到穩(wěn)產增產、改善品質、增強作物抗逆性等目的。科學研究表明，植物生長調節(jié)劑的使用可使蔬果產量增加5%～30%(朱杰麗等，2013)。為避免食用過量，世界各國國均制定植物生長調節(jié)劑最大殘留限量值規(guī)定，如歐盟規(guī)定食用菌中多效唑、氣吡脲、抗倒酯、環(huán)丙酸酰胺的最大殘留限量值0.01 mg/kg，日本規(guī)定食用菌中氯苯胺靈的最大殘留限量值為0.02 mg/kg；我國和美國暫未有食用菌中植物生長調節(jié)劑的限量規(guī)定(邱世婷等，2019)，盡管在果蔬上具有殘留限量標準(朱杰麗等，2013)。

各種植物生長調節(jié)劑對真菌子實體的作用不同，如吲哚乙酸促進粉被蟲草Cordycepspruinosa子實體生成，環(huán)磷腺苷(cAMP)增加鮮重(徐莉等，2008)；茉莉酸甲酯和吲哚乙酸能顯著縮短猴頭菇Hericiumerinaceus的生長周期，赤霉素、萘乙酸及吲哚乙酸能顯著提高猴頭菇的產量(Thuan等，2017)。本實驗結果為利用安全的植物生長調節(jié)劑促進冬蟲夏草子實體人工培育提供的思路。