粉棒束孢 Isaria farinosa 的研發(fā)進(jìn)展

宋文靜，馮世鵬，韓日疇

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570100；2.廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣州 510260)

粉棒束孢Isariafarinosa異名為蟲(chóng)花棒束孢、蟲(chóng)草棒束孢，此前一直被稱(chēng)作粉擬青霉Paecilomycesfarinosus,是一種常見(jiàn)的昆蟲(chóng)病原真菌，世界范圍分布，寄主范圍廣泛，已被用作一種生物因子防治溫帶農(nóng)林害蟲(chóng)、植物病原和線蟲(chóng)，盡管應(yīng)用范圍不及球孢白僵菌Beauveriabassiana、布氏白僵菌B.brongniartii以及綠僵菌Metarhiziumanisopliae(Zimmermann，2008；Wengetal.,2019)。但與綠僵菌和球孢白僵菌相比，粉棒束孢在低溫下能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)、發(fā)育且保持較高致病力，在控制越冬害蟲(chóng)種群時(shí)具獨(dú)特優(yōu)勢(shì)(Zimmermann，2008；Wengetal.,2019)。此外，在冬蟲(chóng)夏草人工培育過(guò)程中，粉棒束孢嚴(yán)重危害冬蟲(chóng)夏草菌的寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)，引起了資源昆蟲(chóng)研究者的高度重視和重點(diǎn)研究(劉飛，2016，2018；韓日疇等，2019)。因此，粉棒束孢研發(fā)呈現(xiàn)兩大重點(diǎn)領(lǐng)域：利用和控制。

作為生防真菌研發(fā)，粉棒束孢的資源分布和篩選，分子鑒定和遺傳多樣性、培養(yǎng)、活性成分和藥效、分子生物學(xué)、害蟲(chóng)生物防治、病害控制、安全性等一直是研究范圍；作為冬蟲(chóng)夏草寄主昆蟲(chóng)病原菌控制，學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界試圖通過(guò)感染特征、侵染機(jī)理和防霉劑篩選等方面研究，為這一真菌的高效安全控制提供措施。本文將綜述粉棒束孢在利用和控制兩大方面的研發(fā)進(jìn)展。

1 鑒定分類(lèi)和遺傳多樣性

大蠟螟誘餌或各種選擇培養(yǎng)基方法通常用于分離粉棒束孢(Zimmermann，1986)。這一真菌不僅分離自被感染的昆蟲(chóng)體，也可從昆蟲(chóng)、蜘蛛和蓖子硬蜱Ixodesricinus活體中分離到(Boetal.，1999；Greifetal.，2007；Munteanuetal.,2014)，甚至分離自人類(lèi)的腸道菌群(Goubaetal.,2013)。從蔬菜地、柑橘園(Ali-Shtayehetal.,2002)以及森林、農(nóng)田中(Ali-Shtayehetal.,2002；Thakuretal.,2010)均可分離粉棒束孢。在加拿大，它分離自云杉食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)Choristoneurafumiferanar(Harneyetal.,1991)；在中歐，這一真菌分離自小蠹蟲(chóng)Trypodendronlineatum(Kirschner，2001)，云杉小蠹蟲(chóng)Ipstypographus(Landaetal.,2001)；分離自白粉菌中(Hijwe-genetal.,1984；Kavkovaetal.,2005；Szentivanyietal.,2006)；粉棒束孢也發(fā)現(xiàn)于熱帶地區(qū)，如在多哥共和國(guó)的胡蜂巢中(Fouillaudetal.,1995)。在我國(guó)，油松毛蟲(chóng)Dendrolimustabu-laeformis(武覲文，1987)，坑切梢小蠹Tomicuspiniperda(澤桑梓等，2006)和馬尾松林生態(tài)系中(張玉波等，2007)均分離到粉棒束孢(表1)。

表1 粉棒束孢的寄主名單Table 1 Host list of Isaria farinosa

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

粉棒束孢區(qū)別于其它真菌種類(lèi)的特征在于：小的橢圓形或梭形分生孢子，白色到黃色菌落；生長(zhǎng)中速；開(kāi)始為白色，后為黃色或乳白色菌落，具有叢毛狀菌絲，有時(shí)微黃色菌絲束；瓶狀孢子梗橢圓形或梭形，帶透明分生孢子(2-3 mm×1-1.8 mm)(圖1)。

圖1 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的粉棒束孢Fig.1 Isaria farinosa cultured in liquid

利用RAPD標(biāo)記物，Chew等(1998)證明從7種昆蟲(chóng)中分離的所有粉棒束孢品系都區(qū)別于其它真菌種類(lèi)。黃勃等(2002a)發(fā)現(xiàn)單起源的棒束孢屬內(nèi)菌株的ITS序列具有多態(tài)性，蟲(chóng)草棒束孢菌株間的差異與地理來(lái)源及寄主均無(wú)相關(guān)性。黃勃等(2001，2002b，2003)認(rèn)為，與基于ITS構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育相比，RAPD聚類(lèi)樹(shù)狀圖不適于分析蟲(chóng)草棒束孢種間親緣關(guān)系。Gams等(2005)和Sung等(2007)也建議粉擬青霉更名為蟲(chóng)草棒束孢。分析5.8S rDNA and ITS1 and ITS2序列可鑒定粉棒束孢(Inglisetal.,2006)。韓燕峰(2007)采用ITS序列鑒定了中國(guó)部分未知的粉棒束孢菌株，描述了棒束孢新種。D’Alessandro等(2013)證明EF1-a和ITS1-5.8S-ITS2基因序列是鑒定和系統(tǒng)分析棒束孢的有力工具。在NCBI庫(kù)中，登錄18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列的數(shù)量最多，其次是登錄功能基因的數(shù)量，關(guān)于18S+ITS1+5.8S，18S+ITS1，5.8S+ITS2，ITS2+28S，5.8S和ITS2的序列信息沒(méi)有登錄(Oborníketal.,2001；劉飛等，2016)。

王四寶等(2002)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的22株球孢白僵菌和21株粉棒束孢酯酶同工酶酶譜多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示同種不同菌株間具有豐富的遺傳多樣性，可作為菌株親緣關(guān)系的可靠的遺傳標(biāo)記。孫召紅等(2011)運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記研究了安徽省6個(gè)不同地理環(huán)境的粉棒束孢種群遺傳異質(zhì)性，結(jié)果顯示，安徽省粉棒束孢的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，各種群之間的地理距離與遺傳距離之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。代永東等(2013)利用ITS對(duì)粉棒束孢及其近緣物種分子系統(tǒng)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)粉棒束孢與其它棒束孢物種形成多系關(guān)系，揭示了棒束孢屬3系分支的系統(tǒng)分類(lèi)格局。代永東等(2015)以ITS序列和RAPD分析對(duì)云南粉棒束孢8個(gè)和蝙蝠蛾擬青霉2個(gè)當(dāng)?shù)鼐尤哼M(jìn)行遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)及其種內(nèi)分化研究，單倍型聚類(lèi)和網(wǎng)狀分支分析表明云南粉棒束孢單倍型類(lèi)型豐富，遺傳多樣性高；粉棒束孢并不存在因地理原因造成的生殖隔離；值得重視的是，ITS單倍型和RAPD分析支持將蝙蝠蛾擬青霉P.hepiali作為粉棒束孢異名處理。利用Scot和ISSR兩種分子標(biāo)記方法研究了80株粉棒束孢的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，四川康定折多山冬蟲(chóng)夏草人工繁育基地的粉棒束孢菌株具有豐富的遺傳多樣性(姜羅雨桐，2016)。以5個(gè)基因(nrSSU、nrLSU、tef-1α、rpb1和rpb2)序列對(duì)棒束孢屬I(mǎi)saria及近緣屬物種進(jìn)行分析表明，棒束孢屬多系起源于蟲(chóng)草菌科中，分3個(gè)不同分支；A支主要由I.cicadae、I.teniupes、I.coleopterorum、I.fumosorosea和I.cateniannulata等組成；B支包括I.poprawkii、I.locustica、I.javanica、I.amoenerosea和I.cateniobliqua；C支僅有I.farinose(代永東等，2016)。Agrawal等(2014)采用全基因組鳥(niǎo)槍法(Whole Genome Shotgun WGS)完成了該菌MTCC4114菌株全基因組序列分析，基因組大小為34.16 Mb，獲得1 314條 Scaffolds序列。利用Hsp70和Hsp90基因序列作為分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析，顯示10個(gè)地理種群的I.farinosa遺傳分化有限(Heetal.,2019)。I.farinosaARSEF 3菌株的線粒體全基因組測(cè)序業(yè)已完成，系統(tǒng)分析證實(shí)這一菌株屬于Cordycipitaceae(Zhangetal.,2019)。

2 培養(yǎng)

粉棒束孢的規(guī)模應(yīng)用依賴其大量培養(yǎng)方法。與培養(yǎng)其它真菌一樣，影響這一真菌培養(yǎng)的參數(shù)包括培養(yǎng)基、溫度、pH、氧氣、水活度等。為將粉棒束孢開(kāi)發(fā)為高效生防菌，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)影響這一真菌孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)和殺蟲(chóng)活性的因素進(jìn)行了深入研究。

金鈞然等(1987)比較系統(tǒng)地介紹了溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)條件等因素對(duì)粉棒束孢孢子產(chǎn)生的影響，菌劑生產(chǎn)工藝條件。張文勤(1999)發(fā)表了一種選擇培養(yǎng)基(在PDA培養(yǎng)基中加入300 mg/L硫酸鉻銨銅、4 mg/L代森鋅、1 800 mg/L硫酸銅、1 000 mg/L KMnO4、100 mg/L結(jié)晶紫、5 000 mg/L氯霉素，自然pH)可有效地抑制土壤雜菌的生長(zhǎng)，高頻獲得粉棒束孢。阿地力等(2000)發(fā)現(xiàn)粉棒束孢在人工培養(yǎng)基上多代培養(yǎng)后致病力明顯下降，連續(xù)培養(yǎng)三代后致病力僅為第一代的28%。王素英等(2002)報(bào)道麥芽糖和蛋白胨作為碳、氮源最適合于粉棒束孢Z26生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量，菌絲體所適應(yīng)的pH范圍比較廣。楊斌等(2005)采用液體發(fā)酵方法，在25℃條件下測(cè)定9種碳源物質(zhì)，7種氮源物質(zhì)和6種無(wú)機(jī)鹽對(duì)粉棒束孢菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，玉米粉、蔗糖、麥芽糖和葡萄糖是這一真菌菌絲生長(zhǎng)較好的碳源；牛肉膏、蛋白胨是較好的氮源物質(zhì)；硫酸亞鐵和硫酸鈣不是菌絲生長(zhǎng)的最適無(wú)機(jī)鹽。張中等(2006)報(bào)道通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)提高粉棒束孢幾丁質(zhì)酶活性的方法。澤桑梓等(2006)詳細(xì)描述了當(dāng)時(shí)粉棒束孢的生產(chǎn)工藝流程，各環(huán)節(jié)的質(zhì)量檢測(cè)以及產(chǎn)品的包裝、貯存、運(yùn)輸方法，為該菌的規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用提供參考。Wang等(2008)利用單因子和正交設(shè)計(jì)方法分別優(yōu)化了培養(yǎng)基組分、發(fā)酵參數(shù)和培養(yǎng)基組分濃度，獲得優(yōu)化的培養(yǎng)基為3.5%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.2%酵母膏、0.1% K2HPO4和0.05% MgSO4；合適的發(fā)酵參數(shù)為初始pH7、溫度25℃，250 mL三角瓶中裝培養(yǎng)液75 mL，接種量5% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間5 d；最多菌絲量為2.124 g/100 mL。Mascarin等(2010)采用兩步法生產(chǎn)粉棒束孢，第一步采用最適液體培養(yǎng)基(甘蔗糖蜜+米糊湯，米糊湯+酵母和甘蔗糖蜜+酵母+米糊湯)生產(chǎn)菌種；第二步為利用固體培養(yǎng)基(糖蜜+米糊湯中添加豆粕+玉米渣)生產(chǎn)孢子。申慧榮(2014)認(rèn)為光照條件有利于從蝙蝠蛾中分離的粉棒束孢分生孢子的生成。龍艷玲等(2017)報(bào)道該菌株最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的培養(yǎng)基分別為薩氏培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，蔗糖和有機(jī)氮源(賴氨酸)有利于該菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢；菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的最適pH均為6.0。粉棒束孢孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的適合溫度通常在20～25℃之間(Clerketal.,1965；Machowicz-Stefaniak，1988；Mietkiewskietal.,1994b；Hallsworthetal.,1999；安建梅，2003；汪章勛等，2005；龍艷玲等，2017)。Liu等(2018)系統(tǒng)優(yōu)化了粉棒束孢的小型發(fā)酵培養(yǎng)條件，認(rèn)為光照未影響菌絲的生長(zhǎng)，最佳碳源為半乳糖和果糖，最佳氮源為半胱氨酸、酵母粉、蛋白胨和牛肉浸膏，碳氮比為1 ∶1至1 ∶7，微量元素和維生素顯著提高菌絲生長(zhǎng)量；同時(shí)，代謝組分析結(jié)果顯示，海拔未影響菌絲生長(zhǎng)但顯著調(diào)節(jié)代謝組。

芽生孢子是許多真菌通過(guò)出芽方式產(chǎn)生的無(wú)性孢子，在液體發(fā)酵中主要以這種形式大量繁殖，宋文婧等(2011)分別對(duì)液體發(fā)酵中的粉棒束孢等10種常見(jiàn)蟲(chóng)生真菌芽生孢子的形成過(guò)程進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果表明，芽生孢子的產(chǎn)生方式有兩種類(lèi)型：1)蟬棒束孢在其整個(gè)生活史中以菌絲生長(zhǎng)為主，芽生孢子產(chǎn)生的數(shù)量很少。2)其它各種真菌芽生孢子產(chǎn)生方式相似；芽生孢子的產(chǎn)生分為3個(gè)時(shí)期：初期先由菌絲形成芽生孢子；指數(shù)期芽生孢子大量增殖，菌絲和芽生孢子都可產(chǎn)生芽生孢子；后期以芽生孢子產(chǎn)新芽生孢子為主要方式。

Liu等(2016)測(cè)定了粉棒束孢生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，試圖通過(guò)選擇對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用的化學(xué)物質(zhì)作為添加劑用于蝙蝠蛾昆蟲(chóng)的飼養(yǎng)；檸檬酸顯著抑制真菌生長(zhǎng)，添加天門(mén)冬氨酸和VB1組合有利于降低蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的感病率。

3 活性成分和藥效

粉棒束孢具有豐富的代謝產(chǎn)物活性成分，這些成分的結(jié)構(gòu)和作用已被綜述(魯增輝等，2013；Wengetal.,2019)。這些次生代謝成分使這一真菌對(duì)昆蟲(chóng)、病原菌具有致死或抑制作用，同時(shí)，也涉及到粉棒束孢的安全使用。粉棒束孢的主要次生代謝產(chǎn)物包括非核糖體多肽類(lèi)(non-ribosomal peptides，NRPs)(Cycloaspeptides)、生物堿(militarinones，farinosones)、萜烯化合物(farinosones與militarinones)。

3.1 多肽、酮醌

已知的環(huán)狀五肽cycloaspeptides A，C，以及新發(fā)現(xiàn)的Cycloaspeptides F and G(表2)，加上bisdethiodi (methylthio) hyalodendrin分離自冬蟲(chóng)夏草的I.farinosastrain XJC04-CT-303菌株的米飯發(fā)酵物；Cycloaspeptides F和G抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)，效果類(lèi)似于陽(yáng)性對(duì)照氟尿嘧啶5-fluorouracil，對(duì)人宮頸瘤細(xì)胞具有中毒毒性(Zhangetal.,2009)。Cycloaspeptide A對(duì)人肺纖維細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性(Schmeda-Hirschmannetal.,2008)。Cycloaspeptide C類(lèi)似于cycloaspeptide G生物合成cycloaspeptides的基因簇業(yè)已從Penicilliumsoppii和P.jamesonlandense中鑒定(de Mattos-Shipleyetal.,2018)。環(huán)縮二氨酸衍生物bisdethiodi(methylthio)hyalodendrin(gliovictin)于1973年分離到，它對(duì)KB(人口腔表皮樣癌human epidermoid carcinoma of the mouth)，HepG2(人肝癌細(xì)胞系human hepatocellular liver carcinoma cell line)，A549(人肺癌細(xì)胞系human lung carcinoma cell line)，HCC-S102(肝癌細(xì)胞系hepatocellular carcinoma cell lin)，HuCCA-1(人膽管癌細(xì)胞human cholangiocarcinoma cancer cells)，HeLa(宮頸腺癌細(xì)胞系cervical adenocarcinoma cell line)，MDA-MB231(human breast cell line)，T47D(human mammary adenocarcinoma cell line)，HL-60(人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系human promyelocytic leukemia cell line) and P388(小鼠白血病細(xì)胞系murine leukemia cell line)具有弱毒性(Prachyawarakornetal.,2008)。

3.2 生物堿

萜烯類(lèi)化合物militarinones A、B、E and F(表2)分離自I.farinosastrain XJC04-CT-303(Maetal.,2011)。Militarinones A和E對(duì)A549人癌細(xì)胞系具有明顯毒性，而militarinone B可抑制Staphylococcusaureus,Streptococcuspneumoniae和白色念珠菌Candidaalbicans(Maetal.,2011)。苯腙類(lèi)化合物The phenylhydrazones，farylhydrazones A和B(表3)也分離自這個(gè)菌株(Tsangetal.,2012)。粉棒束孢還產(chǎn)生蒽醌紅色色素(Roberts，1981；Velmuruganetal.,2010；Akilandeswarietal.,2017)提到從I.farinosa中獲得pyridine-2，6-dicarboxylic acid。從菌株RCEF0101中分離到萜烯類(lèi)黃色色素farinosones A，B和C(Chengetal.,2004)。Lang等(2005)分離了paecilosetin，對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis,須癬毛癬菌Trichophytonmentagrophytes和Cladosporiumresinae具有抑制作用。一種新的羥基吡啶堿(+)-N-deoxymilitarinone A，相關(guān)代謝物militarinone D，militarinone B以及甾醇也從I.farinosaRCEF 0097菌株分離到(Chengetal.,2006)。從HF599菌株分離到一種新的順丁烯二酰亞胺導(dǎo)向化合物farinomalein，可有效抑制植物病原菌大豆疫霉菌Phytophthorasojae(Putrietal.,2009)。

3.3 蛋白質(zhì)

Lunkenbein等(2011)和Zelena等(2012)通過(guò)層析柱等從I.farinose中分別獲得新的疏水蛋白PfaH1和PfaH2。楊斌等(2005)發(fā)現(xiàn)粉棒束孢的代謝產(chǎn)物強(qiáng)烈降低煙蚜乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性。

3.4 多糖

多糖是真菌的主要代謝物，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化以及抗腫瘤等活性。這些真菌多糖可開(kāi)發(fā)成免疫調(diào)節(jié)劑或者抗癌藥物(Wangetal.,2008)。Domenech等(2011)從這一真菌的水溶性組分中通過(guò)層析柱分離到兩種多糖F1 S-A和F1 S-B并制備了對(duì)應(yīng)的抗體。Wang等(2011)建立了最適合I.farinosaB05產(chǎn)生多糖的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)。王翎等(2011)從粉草棒束孢發(fā)酵液中分離純化出糖蛋白PG。陳顯好等(2011)從蟲(chóng)草棒束孢菌絲體中分離純化出糖蛋白PCAⅠ，單糖組成為甘露糖和半乳糖。Jiang等(2011)分別從I.farinosaB05發(fā)酵液和菌絲體中分離獲得水溶性的胞內(nèi)外多糖。

3.5 生長(zhǎng)素

柴一秋等(2011)發(fā)現(xiàn)，這一真菌的代謝產(chǎn)物對(duì)小麥胚芽鞘伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用，盡管不同菌株培養(yǎng)液效果差異較大。安建梅等(2003)報(bào)道，粉棒束孢9905菌株的代謝產(chǎn)物具有類(lèi)似生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的生理活性，為開(kāi)發(fā)具有殺蟲(chóng)特性和促進(jìn)植株生長(zhǎng)的制劑提供參考。

李松泰等(2011)發(fā)現(xiàn)，粉棒束孢菌絲體抽提取可減輕熱卒中時(shí)腦血管功能異常。Lee等(2011)報(bào)道，粉棒束孢發(fā)酵濾液在體外能夠抑制人黑色素瘤B16細(xì)胞的遷移、入侵以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，認(rèn)為粉棒束孢可開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物或預(yù)防腫瘤藥物。

4 生物轉(zhuǎn)化

真菌可生物轉(zhuǎn)化類(lèi)固醇。Sampedro等(2019)利用粉棒束孢處理干橄欖磨渣(Dry olive-mill residue)，極大地降低了廢物的植物毒性。粉棒束孢具有甾類(lèi)羥化酶，可以有效轉(zhuǎn)化脫氧表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)，獲得的類(lèi)固醇物質(zhì)可用于治療老人癡呆癥(Kozowskaetal.,2018)。Dymarska等(2008)利用粉棒束孢將羥基黃酮3-Hydroxyflavone，甲氧基黃酮3-Methoxyflavone，槲皮素Quercetin和黃芩素Baicalein糖基化，獲得黃酮類(lèi)物質(zhì)。

5 分子生物學(xué)

粉棒束孢的分子生物學(xué)研究仍很有限?？莶輻U菌素樣絲氨酸蛋白酶(Pr1)和類(lèi)胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(Pr2)在真菌穿透昆蟲(chóng)體壁中發(fā)揮重要作用。Lopez-Llorca等(2002)從這一真菌中分離到可降解昆蟲(chóng)體壁的絲氨酸蛋白酶，推測(cè)蛋白酶參與真菌穿透昆蟲(chóng)體壁。汪章勛(2002)研究了粉棒束孢類(lèi)枯草桿菌蛋白酶酶活，確定了高產(chǎn)菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，對(duì)Pr1蛋白酶進(jìn)行了進(jìn)一步分離、純化，克隆出類(lèi)枯草桿菌蛋白酶基因，為改造昆蟲(chóng)病原真菌奠定基礎(chǔ)。黃勃等(2006)從粉棒束孢中克隆出完整的類(lèi)枯草桿菌蛋白酶cDNA基因。Wang等(2013)從粉棒束孢中分離到Pr1 (Ifa-pr1A)基因，原核表達(dá)這一基因并以昆蟲(chóng)體壁證實(shí)其功能。

表2 粉棒束孢的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性(Weng et al.,2019)Table 2 Secondary metabolites (SMs) from Isaria farinosa and their biological activities

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

為了比較不同真菌DNA的修復(fù)能力，Chelico等(2005)測(cè)定了各種真菌經(jīng)UV照射后的存活率，結(jié)果顯示粉棒束孢的UV耐受能力一般。

黃渤等(2006)首次從粉棒束孢中克隆出完整的幾丁質(zhì)酶基因，成熟蛋白的氨基酸序列與裂蟲(chóng)殼TorrubiellaconfragosaAAV98 691、白色扁絲霉AphanocladiumalbumCAA45 468、菌生輪枝孢VerticilliumfungicolaAAP45 631、萊氏野村菌Nomuraearileyi(現(xiàn)為綠僵菌野村菌M.rileyi) AAP04 616和球孢白僵菌B.bassianaAAN41 261的同源性分別為91%、89%、80%、76%和75%。Singkaravanit等(2010)從粉棒束孢中獲得香葉基二磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase)，推測(cè)其參與菌株的初級(jí)代謝。王凱等(2015)從煙草南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyneincognita卵上分離得到的粉棒束孢中克隆得到一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因IFCHI1，推測(cè)其具有降解南方根結(jié)線蟲(chóng)卵殼及降低卵孵化率作用。

Linke等(2015)首次報(bào)道，來(lái)自絲狀子囊菌粉棒束孢的酚酸脫羧酶(IfPAD)可將阿魏酸(ferulic acid)轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-vinylguaiacol)(一種燒焦木材煙味的成分)。

6 有害生物控制

6.1 防治害蟲(chóng)

粉棒束孢的使用可以追溯到1949和1965年(Steinhaus，1949；Muller-Kogler，1965)，用于防治柑橘粉蚧Rhizoecuskondonis(Homoptera),Dendrolimuspini(Lepidoptera)，Lymantriadispar(Lepidoptera)、Hyloicuspinastri(Lepidoptera) andBupaluspiniarius(Lepidoptera)。粉棒束孢在實(shí)驗(yàn)室和田間對(duì)甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲(chóng)具有明顯效果(Agudeloetal.,1983)。這一真菌也用于控制蔥蠅Deliaantiqua、蘿卜根蠅Deliafloralis、地中海果蠅Ceratitiscapitate和角蠅Haematobiairritans(Poprawskietal.,1985)。在波蘭，粉棒束孢用于防治馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata(Bajan and Kmitowa，1969，1970，1972；Bajanetal.,1978)。Kaaya等(1989)發(fā)現(xiàn)這一真菌可控制舌蠅Glossinamorsitansmorsitans成蟲(chóng)。王素英等(1999)利用粉擬青霉Z26每年施用1～3次，對(duì)楊樹(shù)光肩星天牛Anoplophoraglabripennis幼蟲(chóng)防治效果在92.92%～96.55%。Bello等(2001)報(bào)道了糧倉(cāng)中約20%的米象Sitophilusoryzae致死率。二斑栗實(shí)象Curculiobimaculatus在云南玉溪市紅塔區(qū)峨山縣一年發(fā)生一代，以幼蟲(chóng)在土壤中越冬，10月中旬至11月下旬是防治地下幼蟲(chóng)的最佳時(shí)期。6月中旬成蟲(chóng)羽化高峰期是防治成蟲(chóng)的最佳時(shí)間。以粉擬青霉菌防治地下幼蟲(chóng)死亡率達(dá)86.9%，樹(shù)冠成蟲(chóng)死亡率為64.3%(孫紹芳等，2003)。楊松等(2007)報(bào)道，3個(gè)粉棒束孢株系對(duì)華山松木蠹象Pissodespunctatus的室內(nèi)感染致死率分別為85%、85% 和82.5%。趙麗芳等(2008)施用復(fù)壯后的粉棒束孢，使松縱坑切梢小蠹Tomicuspiniperda成蟲(chóng)受害株率由防治前的32.9%降至4.6%，受害株減退率為86.1%。Yang等(2009)報(bào)道，I.farinosa可有效控制木蠹象Pissodespunctatus幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)，最高致死率達(dá)到88%。Demirci等(2011)于實(shí)驗(yàn)室證明，95% RH和108/mL孢子條件下，粉棒束孢對(duì)柑橘粉蚧Planococcuscitri(Hemiptera:Pseudococcidae)具有良好的控制效果。Blanford等(2012)測(cè)定粉棒束孢對(duì)亞洲瘧疾的媒介昆蟲(chóng)按蚊Anophelesstephensi的取食影響和致死作用，效果一般。覃豐全等(2012)測(cè)定了這一真菌對(duì)美國(guó)白蛾Hyphantriacunea老熟幼蟲(chóng)的侵染效果，接種144 h后白蛾老熟幼蟲(chóng)校正死亡率94.9%，LT50為92.34 h；受感染的老熟幼蟲(chóng)多在預(yù)蛹階段死亡；同時(shí)，小規(guī)模野外防治試驗(yàn)結(jié)果表明，粉擬青霉對(duì)越冬代美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的防治效果為83.5%，對(duì)第2代美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的防治效果分別為87.0%，表明利用真菌防治美國(guó)白蛾是可行的。Johny等(2012)發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)胤蛛x的粉棒束孢品系在實(shí)驗(yàn)室14 d后可致死75%的白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis成蟲(chóng)。Mustua等(2015)于 RH95%和108/mL孢子條件下，以粉棒束孢測(cè)定葡萄園重要害蟲(chóng)葡萄綿粉蚧Planococcusficus,獲得死亡率大于80%的效果。目前為止，粉棒束孢很少存在商業(yè)化的產(chǎn)品。

6.2 防治線蟲(chóng)和蜱螨類(lèi)

粉棒束孢施用于濕潤(rùn)的沙土中2個(gè)月內(nèi)未能感染馬鈴薯金線蟲(chóng)包囊(Muller-Kogleretal.,1967)。粉棒束孢被發(fā)現(xiàn)可抑制蜱螨卵的發(fā)育以及成螨的存活。Polar等(2005)發(fā)現(xiàn)粉棒束孢對(duì)牛蜱Boophilusmicroplus卵具有一定的抑制作用。Lekimme等(2008)認(rèn)為粉棒束孢可以耐受動(dòng)物體的高溫，有利于控制綿羊癢螨Psoroptesovis。Angelo等(2012)首次報(bào)道了粉棒束孢在實(shí)驗(yàn)室對(duì)微小牛蜱Rhipicephalusmicroplus卵的抑制作用。龍艷玲等(2017)室內(nèi)測(cè)定了粉棒束孢菌株nq1-1對(duì)柑橘全爪螨Panonychuscitri雌成螨具有較好的毒殺活性，LC50和LT50分別為1.59×107/mL和7.9 d。

6.3 病原菌

許多真菌可分泌活性成分抑制其它病原。粉棒束孢分離自各種白粉病(Hijwegenetal.,1984；Kavkovaetal.,2005；Szentivanyietal.,2006)，因此也用于防治各種病害。如分離自多葉羽扇豆Erysiphemartii的粉棒束孢對(duì)黃瓜白粉病Sphaerothecafuliginea菌絲具抑制作用(Hijwegenetal.,1984)。粉棒束孢可抑制各種植物白粉病中的白粉病(如Blumeriagraminisfsp.hordei(大麥barley)，Oidiumneolycopersici(番茄tomato)，Golovinomycesorontii(煙草tobacco)andPodosphaerafusca(黃瓜cucumber)，但未能抑制溫室中白粉病的傳播(Szentivanyietal.,2006)。從心黎等(2006)發(fā)現(xiàn)盆栽實(shí)驗(yàn)中4 g/L粉棒束孢發(fā)酵濃縮物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的預(yù)防和治療效果分別為83.35%和35.63%。Putri等(2014)報(bào)道，從粉棒束孢分離的Farinomalein抑制大豆疫霉菌Phytophthorasojae和絲囊霉Aphanomycescochlioides。王永會(huì)等(2019)測(cè)定7個(gè)粉棒束孢菌株固體培養(yǎng)物的提取物對(duì)抗腸道病毒71型(EV71)、黃熱病病毒、日本腦炎病毒和登革病毒的活性，結(jié)果顯示，不同菌株粗提物抗登革病毒活性不同，其中一株具有很強(qiáng)的抗病毒活性。

7 非目標(biāo)和有益生物的影響

不同于廣泛被應(yīng)用的白僵菌和綠僵菌，少有Isaria真菌對(duì)非目標(biāo)和有益生物影響的報(bào)道。Goettel等(1990)列出非目標(biāo)生物清單(表3)。粉棒束孢可感染如下越冬昆蟲(chóng)，如步行蟲(chóng)Harpalussp.，Agonumdorsale成蟲(chóng)，隱翅蟲(chóng)Staphylinusolens(Coleoptera:Staphylinidae) (Steenbergetal.,1995)。I.farinosa也分離于越冬Coccinellaseptempunctata(Ceryngier，2000)。

表3 粉棒束孢的非目標(biāo)寄主Table 3 Non-target hosts of Isaria farinosa according to Goettel et al.(1990)

*易感性:高(75～100%)、中(50～75%)、低(<50%)、罕見(jiàn)(通常只在單一記錄中發(fā)現(xiàn))。Susceptibility:High (75～100%),moderate (50～75%),low (<50%),rare (usually known only from single records)。

8 粉棒束孢的控制

隨著冬蟲(chóng)夏草人工培育產(chǎn)業(yè)的興起，冬蟲(chóng)夏草菌O.sinensis寄主昆蟲(chóng)蝙蝠蛾的飼養(yǎng)呈現(xiàn)大規(guī)模型急劇升級(jí)，粉棒束孢作為蝙蝠蛾幼蟲(chóng)飼養(yǎng)過(guò)程中的一種常見(jiàn)和主要致病菌(張德利等，2011)，具有極強(qiáng)的致病性和流行性，對(duì)粉棒束孢的有效控制成為資源昆蟲(chóng)利用過(guò)程中的重要問(wèn)題(呂延華等，2018；韓日疇等，2019)。

多種措施用于控制粉棒束孢。含2 g/L聚六亞甲基雙胍消毒液對(duì)粉棒束孢孢子懸液或者現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)作用45～60 min，殺菌率均可達(dá)到99.00%以上；含量 ≤ 10g/L聚六亞甲基雙胍消毒液對(duì)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)死亡影響不顯著，無(wú)明顯不良反應(yīng)，可用于蝙蝠蛾幼蟲(chóng)飼料、飼養(yǎng)盒等的消毒(賀元川等，2017)。為了獲得粉棒束孢有效的防治藥物，李全平等(2018)測(cè)定了大蒜素及其他幾種抗真菌藥物對(duì)粉棒束孢的抑制效果以及對(duì)飼養(yǎng)的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)取食的影響，結(jié)果顯示，與化學(xué)藥物相比，大蒜素更加適合于粉棒束孢的控制，大于或等于0.5%的大蒜素溶液可完全殺滅粉棒束孢孢子；小于或等于0.1%的大蒜素可顯著降低粉棒束孢對(duì)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的死亡率，增加蝙蝠蛾幼蟲(chóng)采食量。

9 粉棒束孢的安全性

任何生物制劑使用之前的關(guān)鍵關(guān)注點(diǎn)是安全性。對(duì)真菌制劑的安全性評(píng)估涉及六大目標(biāo)：目標(biāo)生物、非目標(biāo)生物、水、土壤、環(huán)境和人類(lèi)。Austwick(1980)提到，美洲鱷魚(yú)血小板病變的肺中發(fā)現(xiàn)粉棒束孢，盡管真菌種類(lèi)需要正確鑒定。Donovan-Peluso等(1980)報(bào)道，以每只豹蛙Ranapipiens1×109孢子和每頭小鼠2.3×109孢子量，通過(guò)灌胃法將粉棒束孢孢子接入豹蛙和小鼠后，處理與對(duì)照組的體重?zé)o顯著差異，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見(jiàn)死亡。

在斯里蘭卡，有粉棒束孢可能引起角膜炎的報(bào)告(Siroshaetal.,1994)。以這種真菌對(duì)鶴鶉做了急性、亞急性喂食實(shí)驗(yàn)、急性腹腔注射實(shí)驗(yàn)及對(duì)眼和皮膚的刺激性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果未出現(xiàn)死亡；動(dòng)物外觀、行為、體重、產(chǎn)蛋量和血液生化指標(biāo)基本正常；孢子被食入或注入腹腔內(nèi)72～96 h失活未見(jiàn)生長(zhǎng)；認(rèn)為該菌對(duì)鶴鶉基本是安全的(常紹慧等，1989)。以粉棒束孢分生孢子對(duì)金魚(yú)進(jìn)行感染試驗(yàn)，經(jīng)20 d觀察未發(fā)現(xiàn)因該菌感染引起的死亡，發(fā)現(xiàn)體表、腮、腸道和龔便內(nèi)均有活抱子滯留，但未發(fā)現(xiàn)侵染；孢子未能進(jìn)入體腔及血液，在肝臟和脾未分離到活孢子；該菌對(duì)2齡家蠶有感染力，并隨菌液濃度而增加，對(duì)天敵昆蟲(chóng)平腹小蜂和紅頭小繭蜂未發(fā)現(xiàn)感染(常紹慧等，1990)。由于粉棒束孢產(chǎn)品仍未進(jìn)入市場(chǎng)，其安全性報(bào)道甚少。

10 展望

作為生物防治制劑，粉棒束孢被發(fā)現(xiàn)和研究起步較早，但是由于其效能不如業(yè)已產(chǎn)業(yè)化的白僵菌和綠僵菌，因此未能規(guī)?；M(jìn)入市場(chǎng)。展望未來(lái)，粉棒束孢的研發(fā)仍需解決如下主要問(wèn)題：

10.1 高毒力菌株的篩選和應(yīng)用

與其它真菌制劑相比，這一真菌的劣勢(shì)是對(duì)害蟲(chóng)的控制效果不佳，但其對(duì)低溫的適應(yīng)更適合于控制溫帶地區(qū)重要害蟲(chóng)，因此，篩選高毒力的菌株尤其關(guān)鍵。同時(shí)，利用這一真菌控制植物病害和線蟲(chóng)也是未來(lái)之選。

10.2 代謝物的高效和高值利用

粉棒束孢的活性代謝物多樣，效能各異。利用多維組學(xué)和生物發(fā)酵技術(shù)繼續(xù)研發(fā)這些代謝物以及其代謝途徑和藥理活性將開(kāi)辟生物醫(yī)藥和生物殺蟲(chóng)、殺菌化學(xué)制劑的新資源庫(kù)。

10.3 殺蟲(chóng)機(jī)制和有效控制

深入研究粉棒束孢的殺蟲(chóng)機(jī)制不僅有利于研制生物農(nóng)藥，更助力于在冬蟲(chóng)夏草人工培育系統(tǒng)中控制這一真菌。