3D打印納米纖維/藻酸鹽基水凝膠的制備與表征

魏佳欣，洪永修，王寶秀，陳仕艷*

(1. 東華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620； 2. 上海奕方農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，上海 201607)

三維(3D)打印是一種新興的生物制造方法，可在指定的3D層次組織中精準定位生物制劑，從而創(chuàng)建人造的多細胞組織/器官。現(xiàn)已經(jīng)使用幾種3D打印方法成功地進行了生物打印各種組織構(gòu)建體，以模仿天然組織和器官(如皮膚、軟骨、肝、肺和神經(jīng)等)[1]。

組織修復(fù)用材料需要模仿細胞外基質(zhì)(ECM)，從而發(fā)揮功能并促進新組織的形成，其主要成分是膠原纖維和蛋白多糖[2]。水凝膠是具有親水性交聯(lián)三維聚合物網(wǎng)絡(luò)的材料，因具有類似于天然細胞外基質(zhì)的高水含量和理化特性而具有高度的生物相容性，適合于人造皮膚[3]、組織工程[4]、藥物遞送等生物醫(yī)用領(lǐng)域[2-5]，是一種有前景的生物材料。多糖之一的藻酸鹽，因其生物相容性、低成本以及易實現(xiàn)的交聯(lián)條件，是3D打印油墨中常見的選擇。但存在細胞粘附弱和機械性能差的問題，通常與其他生物聚合物混合進行改善。細菌纖維素(BC)是一種由木醋桿菌合成的結(jié)晶胞外多糖，由于強大的氫鍵作用和高度結(jié)晶性而具有出色的機械性能[6]。鑒于與膠原纖維的形態(tài)相似性，BC與細胞具有正相互作用，促進細胞命運過程[6-7]，并且納米纖維素的增強機理與天然組織相似。在3D打印方面，納米纖維素表現(xiàn)出的優(yōu)異的流變行為，這有助于油墨的擠出并在打印后保持3D結(jié)構(gòu)的自支撐和打印形狀[8]。

本文研究了TOBC對藻酸鹽基水凝膠的微觀形貌、壓縮、溶脹等性能的影響。通過改變TOBC和SA的比例，探索了TOBC對水凝膠油墨流變行為的影響。并以此為理論基礎(chǔ)，研究了水凝膠油墨流變行為與3D打印之間關(guān)系，探討加工參數(shù)對打印線條的分辨率的影響以及打印結(jié)構(gòu)可控的水凝膠通孔支架的可能性，并進一步評估水凝膠的細胞相容性，為生物醫(yī)用材料領(lǐng)域提供新的可3D打印材料與研究基礎(chǔ)。

1 試 驗

1.1 試驗藥品與儀器

海藻酸鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司；乙二胺四乙酸鈣二鈉鹽(EDTA-Ca)，分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司；氯化鈣，分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司；葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，RG,阿達瑪斯試劑公司；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司；胰酶，Life Technologie；(CCK-8) 試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；LIVE/DEAD 試劑盒，上海翔升生物科技公司。TOBC和注射級超純水為實驗室自制。

美國Instron 公司Instron5969電子萬能材料試驗機，日本Hitach公司場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)，美國Harvard Apparatus公司Pump 11 Elite注射泵，天威PrintRite公司CoLiDo DIY 3D打印機，美國Thermo Fisher公司Nicolet 6700紅外光譜(ATR-FTIR)，瑞士Tecan公司Infinite F50酶標儀，德國Leica TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡。

1.2 制備過程

稱取一定量的SA溶于超純水，制備質(zhì)量分數(shù)5%(%為質(zhì)量分數(shù)，下同)的SA溶液?；谡n題組之前的文獻[9]，制備TEMPO氧化細菌纖維素。

水凝膠油墨及樣品的制備：具體配比見表1，將一定量TOBC加入SA溶液中，并加入一定量的EDTA-Ca，進行攪拌均勻。然后加入一定量的GDL使EDTA-Ca釋放鈣離子從而預(yù)交聯(lián)8 h，存放于4℃下備用。后續(xù)在室溫下置于1%氯化鈣溶液中進行，補充交聯(lián)60 min以穩(wěn)定水凝膠。

表1 樣品配方數(shù)據(jù)表

SA+TOBC是總固含量，(SA+TOBC)含量指SA與TOBC在油墨中的含量，TOBC含量是TOBC占總固含量的比例。

1.3 測試與表征

紅外光譜測試：采用ATR-FTIR分析樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將樣品用超純水洗滌后進行冷凍干燥，設(shè)定波長范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為2 cm-1。

微觀結(jié)構(gòu)表征：采用FE-SEM對凍干支架的微觀形貌進行表征。

壓縮性能測試：采用萬能材料試驗機測量水凝膠壓縮性能，設(shè)定為壓縮速率10 mm/min，最大壓縮量為40%。

油墨的流變性能測試：穩(wěn)態(tài)流動測試中剪切速率的測試范圍為0.01～1 000 s-1。觸變測試包括三個步驟：在步驟Ⅰ中，施加0.1 s-1的剪切速率60 s；在步驟Ⅱ中，剪切速率增加到300 s-1并保持10 s；在步驟Ⅲ中，將剪切速率降低至0.1 s-1并保持50 s。在滿足線性粘彈性區(qū)域(LVR)的臨界應(yīng)時，選擇0.01%應(yīng)變振幅，頻率掃描范圍為0.1～100 rad/s，得到儲能模量(G′)、損耗模量(G″)隨頻率的曲線。

3D打印測試：使用改造過的基于擠出的3D打印系統(tǒng)。擠出體積流量通過注射泵調(diào)節(jié)，打印速度和印刷結(jié)構(gòu)等參數(shù)在G代碼中調(diào)整。除非另有說明，印刷過程在室溫下進行，使用22 G(內(nèi)徑0.41 mm)圓柱形鋼尖來印刷。

細胞相容性測試：在37℃、95%濕度和5% CO2的二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)L929成纖維細胞。待細胞傳代至所需數(shù)量時，定量地種植在水凝膠支架材料上。采用CCK-8測定細胞探究其在不同水凝膠支架上的增殖能力。采用Live/Dead染色法，直觀觀察細胞在水凝膠支架上的生長活性。通過SEM觀察細胞在水凝膠支架上的生長形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠油墨的紅外光譜與微觀結(jié)構(gòu)

如圖1所示，純SA水凝膠的多糖結(jié)構(gòu)的特征峰出現(xiàn)在1 306，1 080和1 026 cm-1，對應(yīng)于C-O，C-C和C-O-C伸縮振動吸收峰[10- 12]。當TOBC與SA(4ST50)混合時，大多數(shù)特征峰彼此重疊，其-COO不對稱和對稱的特征吸收峰分別為1 598 cm-1和1 424 cm-1，介于純TOBC(1 605 cm-1，1 427 cm-1)和SA(1 591 cm-1，1 417 cm-1)之間，這可能是由于TOBC的羧基與相鄰的SA分子之間形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。圖2顯示了冷凍干燥的TOBC/SA復(fù)合水凝膠的SEM圖像，可以看出，水凝膠網(wǎng)絡(luò)是多孔的微觀結(jié)構(gòu)，隨著TOBC含量的增加，孔徑越小，這可能是由于TOBC與SA側(cè)鏈的官能團之間的氫鍵相互作用使交聯(lián)密度增加的原因。

圖1 4ST0、4ST50和TOBC的FTIR譜圖

圖2 納米復(fù)合水凝膠截面形貌的FE-SEM圖(a) 4ST0; (b) 4ST30; (c) 4ST50; (d) 4ST70

2.2 水凝膠油墨的流變行為

圖3顯示了不同TOBC含量的油墨的黏度曲線，呈現(xiàn)出油墨的穩(wěn)定以及切力變稀行為。對黏度曲線進行冪律方程的線性擬合以及公式的推導(dǎo)得到的數(shù)據(jù)見表2。從表中可以看出，隨著TOBC含量從0增加至30%、50%、70%，冪律指數(shù)n從0.26下降為0.22、0.17和0.15。這表明隨著TOBC含量的增加，油墨的非牛頓性越突出，對剪切速率越敏感。因此，可通過改變剪切速率來改變黏度進而加工。隨著TOBC含量從0增加至70%，噴嘴內(nèi)壁的最大剪切速率從210.8 s-1依次增加至232.3、273.5和297.6 s-1。這是因為較高TOBC含量的油墨，對剪切力較為敏感，在噴嘴內(nèi)壁顯示較低黏度，所以較快的被擠出，進而在噴嘴內(nèi)壁的剪切速率較大。

圖3 不同TOBC含量的水凝膠油墨的黏度曲線

表2 不同TOBC含量的水凝膠油墨的與流動行為相關(guān)的擬合參數(shù)

圖4 不同TOBC含量的水凝膠油墨的觸變與恢復(fù)曲線

從表2可看出該體系油墨在噴嘴處的最大剪切速率約為200～300 s-1，故設(shè)定300 s-1為觸變實驗中高剪切速率。從圖4可看出，擠出過程中(4ST0)水凝膠油墨的初始黏度為1 050 Pa·s，當剪切速率增加到300 s-1時，黏度急劇下降到2.02 Pa·s，油墨表現(xiàn)得更像液體。在剪切速率突然降低至0.1 s-1后，黏度立即增加至428 Pa·s，這種觸變特性有利于擠出沉積的圖案印刷保持其形狀和結(jié)構(gòu)。選擇恢復(fù)低剪切速率后30 s時的黏度恢復(fù)程度作為對比，如表2所示，隨著TOBC含量的增加至30%、50%和70%，恢復(fù)程度從41%先升高至83%，后下降到63%。由此我們可以看出，TOBC的加入明顯提高油墨的觸變行為，其中4ST50的觸變性最高，具有83%的觸變恢復(fù)率。

油墨的所得G′和G″和頻率的關(guān)系見圖5，從圖中可看出，油墨的G′和G″幾乎與頻率無關(guān)，無溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且G′總是大于G″，表現(xiàn)出類固體行為，有利于非原位打印的構(gòu)建體結(jié)構(gòu)的維持，為打印提供了現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

2.3 水凝膠油墨3D打印

圖6給出了不同TOBC含量的水凝膠油墨的細絲線寬的情況。因為純SA油墨不能連續(xù)擠出，故未進行后續(xù)打印實驗。從圖中可以看出，TOBC含量從30%增加至50%和70%，細絲線寬從(724±34)μm，降低至(622±34)μm和(546±38)μm。這說明細絲線線寬隨著TOBC含量的增加而減少。結(jié)合流變實驗，我們認為可能是TOBC增加了油墨的非牛頓行為，使其在噴嘴處的剪切細化，沉積后由于油墨的高度結(jié)構(gòu)化，能維持打印形狀。隨著TOBC的含量增加，非牛頓行為和結(jié)構(gòu)化程度都有所增加，故70% TOBC含量的油墨具有最小線寬。

圖6 不同TOBC含量對納米復(fù)合水凝膠油墨擠出細絲線寬的影響(比例尺:100 μm)

除了油墨組分的影響，細絲的打印連續(xù)性和線分辨率是構(gòu)造3D結(jié)構(gòu)的一個重要參數(shù)。打印速度即是噴嘴的移動速度Vxy對4ST50細絲線寬影響如圖7所示，隨著Vxy從3 mm/s增加至4 mm/s，細絲線寬從(834±18)μm至(632±18)μm，明顯減小。但當Vxy進一步增加至5和6 mm/s，細絲線寬變化不明顯，超過6 mm/s時，細絲就不能連續(xù)打印。這是由于噴嘴移動帶動的牽引效應(yīng)，細絲將被拉伸并變得更細，細絲線寬隨著Vxy的增加而減小，但是當Vxy太高時，細絲被破壞，出現(xiàn)了非連續(xù)打印。結(jié)合連續(xù)印刷實驗和文獻[13]和實際打印的細絲線寬，本文采用4 mm/s的打印速度。

圖7 打印速度Vxy對細絲線寬的影響

3D生物打印的主要目標之一是打印復(fù)雜的器官或器官系統(tǒng)。然而，目前的生物材料缺乏機械強度以及印刷較大的中尺度結(jié)構(gòu)的可印刷性。為了證明TOBC/SA復(fù)合水凝膠油墨能夠以高形狀保真度印刷復(fù)雜形狀，我們印刷了多種內(nèi)外可控的結(jié)構(gòu)，如高達2 cm的圓柱、耳朵、鼻子等，見圖8。

圖8 4ST50油墨印刷結(jié)構(gòu)的拍攝圖(a) 圓柱；(b) 耳朵；(c) 鼻子

2.4 壓縮強度

圖9給出了不同TOBC含量的納米復(fù)合水凝膠的壓縮強度。從圖中可以看出，隨著TOBC含量從0%依次增加至30%、50%和70%，壓縮強度從(102.2±12.6)kPa增加至(125.4±12.2)kPa、(260.9±16.2)kPa、(243.4±10.6)kPa，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這表明適量的TOBC可提高水凝膠的壓縮強度，50%含量的TOBC使壓縮性能最優(yōu)。TOBC機械增強效果顯著的主要原因在于：TOBC是一種親水性能良好的納米纖維[6]，具有高結(jié)晶度的納米纖維分布在水凝膠孔壁和內(nèi)部，增加能量耗散，賦予了其較高的機械性能。此外豐富的羥基可以形成大量氫鍵，增強水凝膠的力學(xué)性能。

圖9 不同TOBC含量的納米復(fù)合水凝膠的壓縮強度

2.5 細胞增殖與活性分析

圖10給出了L929細胞在4ST0和4ST50水凝膠支架上的增殖情況。隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞都表現(xiàn)出增殖的趨勢，并且生長狀態(tài)良好。在第1天，觀察到4ST50與4ST0增殖沒有顯著差異。在第3天，4ST50上的細胞數(shù)量顯著高于4ST0。圖11(a，b)是水凝膠支架上培養(yǎng)3天的細胞的Live/Dead染色圖，可發(fā)現(xiàn)這些支架上的活細胞緊密相聚，幾乎觀察不到死細胞。與4ST0相比，含有TOBC的4ST50上有更多的細胞并表現(xiàn)出鋪展的形態(tài)。圖11(c，d)給出了細胞在支架上的粘附情況和形態(tài)的SEM圖，與4ST0相比，細胞在4ST50支架上完全伸展，呈現(xiàn)長梭形的形態(tài)。這說明TOBC納米纖維有利于細胞粘附，進而增強細胞與支架的相互作用，促進細胞的伸展。此外，從圖11(d)可明顯看出4ST50水凝膠表面的微納米級粗糙度，有利于細胞相互作用和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，并且這種粗糙的表面有利于營養(yǎng)物供應(yīng)和廢物去除的擴散速率，提高細胞的代謝[14]。

圖10 在不同納米復(fù)合水凝膠上L929細胞的增殖情況

圖11 Live/Dead細胞染色圖和SEM細胞形貌圖(a，b)4ST0；(c，d)4ST50

3 結(jié) 論

本文以TOBC作為增強體，制備了不同比例的TOBC/SA納米復(fù)合水凝膠材料，研究了其流變行為和3D打印的可行性，并利用3D打印的方法打印了不同形狀并具有高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的水凝膠支架。這種能夠通過3D打印控制其內(nèi)外宏觀結(jié)構(gòu)以滿足組織對孔徑和外觀結(jié)構(gòu)，并具有納米纖維模擬天然細胞外基質(zhì)的支架材料，有望作為組織工程修復(fù)的移植物，在組織工程支架領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。