木聚糖—鐵復(fù)合物的制備工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

李 霞 孫鶴飛 - 陶揚(yáng)妃 - 陳 清 周玉恒 - 單 楊 關(guān) 媛 an

(1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.廣西植物研究所，廣西 桂林 541006; 3.湖南省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125)

木聚糖(Xyl)是自然界中含量豐富的多糖，具有甜度低、熱量少、可發(fā)酵、潤腸通便等特性；對雙歧桿菌有顯著增殖作用，可促進(jìn)機(jī)體對鈣和鐵的吸收[1]。Xyl常作為促進(jìn)人體鈣、鐵吸收，增強(qiáng)人體免疫等的功能性保健品[2]。此外，Xyl主鏈木糖重復(fù)單元上的糖基側(cè)鏈的多變性及羥基的存在為其化學(xué)修飾提供了可能[3]。鐵是人體中最重要的微量礦物質(zhì)之一，對有機(jī)體的正常功能，尤其是作為新陳代謝和免疫功能的輔助因子的活性至關(guān)重要[4]。人體內(nèi)缺乏鐵時會出現(xiàn)乏力、免疫力下降及貧血等癥狀[5]，而缺鐵性貧血已成為一種世界上常見的營養(yǎng)性疾病。目前，補(bǔ)鐵劑主要有無機(jī)和有機(jī)兩種形式，無機(jī)鐵會導(dǎo)致腸胃不適及口腔異味等[6-7]，因此多糖鐵復(fù)合物作為一種有機(jī)鐵補(bǔ)充劑已成為研究熱點。

多糖鐵復(fù)合物具有較理想的穩(wěn)定性和水溶性，具有免疫保護(hù)作用等優(yōu)點，生物利用度高于無機(jī)補(bǔ)鐵劑[8]。肖雄等[9]研究發(fā)現(xiàn)土黨參多糖鐵配合物在pH 3～12時可溶且能穩(wěn)定存在；張喜峰等[10]研究表明螺旋藻多糖鐵配合物具有較高免疫作用與較好的生物活性；Tang等[4]研究發(fā)現(xiàn)茶多糖鐵配合物具有增加鐵的吸收和生物利用度的能力。此外，多糖鐵復(fù)合物具有良好的臨床效果，且鮮有不良反應(yīng)，可作為優(yōu)良的補(bǔ)鐵劑治療缺鐵性貧血癥[11]。但關(guān)于Xyl修飾成多糖鐵復(fù)合物及生物活性方面的研究鮮有報道。

試驗擬以Xyl和FeCl3為底物，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化木聚糖—鐵復(fù)合物(XPC)的制備工藝，通過紅外光譜及X-射線衍射對Xyl和XPC結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征和分析，并對Xyl和XPC的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為治療缺鐵性貧血及Xyl的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Xyl：廣西植物研究所；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：生物試劑，東京化成工業(yè)株式會社；

氯化鐵、抗壞血酸、氫氧化鈉等：國產(chǎn)分析純；

傅里葉紅外光譜儀：IS10型，美國Thermo Fisher公司；

X-射線衍射儀：Xpert3Power型，荷蘭帕納公司；

紫外—可見分光光度計：UV760CRT型，上海傲譜分析儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1B-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

離心機(jī)：DL-5-B型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 XPC的制備 稱取60 mg Xyl及20 mg檸檬酸鈉，用30 mL蒸餾水溶解，70 ℃水浴并不斷攪拌。先逐滴加入20% NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH為8.0，之后緩慢滴加2.0 mol/L FeCl3溶液并攪拌，重復(fù)上述過程，保持反應(yīng)體系pH為8.0。當(dāng)反應(yīng)體系中出現(xiàn)紅棕色不溶沉淀時，停止滴加。70 ℃水浴1 h，4 000 r/min離心15 min，收集上層深紅棕色離心液，流水透析24 h，濃縮冷凍干燥，得XPC。

1.2.2 單因素試驗

(1)Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比：制備溫度70 ℃，pH 8.0，考察Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對XPC得率的影響。

(2)制備溫度：Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比3∶1，pH 8.0，考察制備溫度(60，70，80，90，100 ℃)對XPC得率的影響。

(3)pH：Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比3∶1，制備溫度70 ℃，考察pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)對XPC得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 基于單因素試驗，以Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比、制備溫度、pH為自變量[12]，XPC得率為響應(yīng)量，設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化試驗[13]。

1.2.4 XPC得率的測定 按照鄰菲羅啉法[14]測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.204 9x+0.003 1，R2=0.999 9，其中y為吸光度值，x為Fe2+濃度)計算鐵的含量，并按式(1)、(2)分別計算XPC中含鐵量及XPC得率。

(1)

式中：

S——XPC中含鐵量，%；

C——Fe2+的質(zhì)量濃度，mg/mL；

0.08——XPC的濃度，mg/mL。

(2)

式中：

Y——XPC得率，%；

C0——螯合前溶液中鐵質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——為螯合后溶液中鐵質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.5 XPC的結(jié)構(gòu)特征

(1)紅外光譜分析：根據(jù)文獻(xiàn)[15]。

(2)X射線衍射分析：根據(jù)文獻(xiàn)[16]略作修改，采用X'Pert3Powder型多功能X-射線衍射儀(Cu靶，λ=1.540 56 ?)分析Xyl和XPC的晶體結(jié)構(gòu)，測試掃描步長為0.026 26°，掃描范圍5°～ 90°，掃描速度0.656 5°/s。

1.2.6 XPC的抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[17]的方法并略有改動，量取不同濃度的樣品液2.0 mL，加入0.04 mg/mL DPPH溶液2.0 mL(乙醇作為溶劑)，室溫下混勻后避光反應(yīng)30 min，517 nm處測定吸光值。按式(3)計算DPPH自由基清除率。

(3)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2.0 mL樣品液和2.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；

Aj——2.0 mL乙醇和2.0 mL樣品液的混合液的吸光度；

Ac——2.0 mL乙醇和2.0 mL DPPH溶液混合液的吸光度。

(2)超氧陰離子清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[18]。

(3)羥基自由基清除率能力：參考文獻(xiàn)[19]的方法并略作改動，取9.0 mmol/L FeSO4和9.0 mmol/L水楊酸—乙醇溶液各1.0 mL，加入不同濃度的樣品溶液1.0 mL，混均后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL啟動反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光度，每組測3次，取平均值。在其他條件不變下改動3種試劑進(jìn)行相應(yīng)試驗：蒸餾水代替多糖做空白對照，蒸餾水替換H2O2溶液測定多糖本底液吸光度，以抗壞血酸替換XPC為陽性對照。按式(4)計算羥基自由基清除率。

(4)

式中：

E——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

Ax——樣品液的吸光度；

Ax0——多糖本底溶液的吸光度。

(4)還原性能力：參考楊柳等[20]的方法并略作修改，量取0.5 mL不同濃度的樣品液于試管，依次加入0.5 mL的1% K3Fe(CN)6溶液與0.5 mL的PBS溶液(0.2 mol/L，pH 6.7)，50 ℃水浴20 min，冷卻，依次加入0.5 mL的10% TCA溶液，0.5 mL的0.1% FeCl3溶液及2.0 mL蒸餾水，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定其吸光度值，以抗壞血酸為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件和Design-Expert 8.0.6軟件中的多元線性回歸分析程序?qū)︱灲Y(jié)果進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗的平均值。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，當(dāng)Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比為3∶1時，產(chǎn)物得率最高(62.9%)；螯合的最適溫度為70 ℃，溫度過低不利于Xyl與鐵離子的螯合，溫度過高可能會破壞Xyl的自身結(jié)構(gòu)；當(dāng)pH為8.0時，XPC得率最大，說明pH的增大有利于Xyl的溶解和擴(kuò)散，但pH過高會使OH-與Xyl分子的活性基團(tuán)競爭，與Fe3+結(jié)合形成沉淀，導(dǎo)致Fe3+不能與Xyl螯合[21]。

圖1 單因素對XPC得率的影響

2.2 制備工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗分析 綜合單因素試驗結(jié)果，以Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比、制備溫度和pH為影響因素，以XPC得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理進(jìn)行試驗設(shè)計，因素與水平表見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

如表2可知，XPC得率為46.44%～65.91%，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得回歸方程：

Y=59.68+3.50A+5.95B+3.25C+2.70AB-1.60AC-1.30BC-2.54A2-3.69B2+0.31C2。

(6)

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型分析 由表3可知，模型P<0.01，說明回歸模型具有高度顯著性；失擬項P=0.238 1>0.05，說明失擬項不顯著；模型R2=0.983 3，表明可用該模型解釋98.33%的關(guān)于各因素與得率之間的關(guān)系變化；RAdj2=0.961 7，表明回歸方程的擬合程度較好，試驗誤差較小，可信度較高[22]，能很好地對XPC得率進(jìn)行分析和預(yù)測?；貧w模型中一次項A、B、C及交互項AC影響極顯著(P<0.01)，二次項(A2、B2)具有高度顯著性(P<0.01)；各因素對XPC的影響大小依次為pH>制備溫度>Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比。

由圖2可知，制備溫度對XPC得率的影響最大，其次是Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比和pH；Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比和制備溫度的等高線為橢圓形，說明這兩個因素交互作用顯著，而Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比和pH的等高線以及制備溫度和pH的等高線皆為圓形，說明Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比和pH、制備溫度和pH間的交互作用不明顯，與方差分析結(jié)果一致。

表1 因素與水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 2 Experiments design and results of response surface analysis

試驗號ABCY多糖得率/%11-1048.53200060.91301163.344-10-148.525-10159.9160-1-146.71700058.83810163.2190-1154.131000058.7111-10053.031211065.911300060.511410-158.221501-161.131600059.5117-1-1046.44

表3 回歸模型方差分析?

Table 3 Regression model variance analysis results

來源平方和自由度均方和F值P值顯著性模型600.98966.7545.69<0.0001??A98.00198.0067.07<0.0001??B283.221283.22193.83<0.0001??C84.50184.5057.830.0001??AB29.16129.1619.960.0029??AC10.24110.247.010.0331?BC6.7616.764.630.0685?A227.16127.1618.590.0035??B257.33157.3339.240.0004??C20.4010.400.280.6150殘差10.2371.46 失擬項6.3032.102.140.2381不顯著誤差3.9340.98總和611.0116

? *表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；R2=0.983 3；RAdj2=0.961 7。

2.2.3 模型驗證實驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳制備條件為Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比為3.2∶1、制備溫度70 ℃、pH 8.09，此條件下XPC得率為66.59%。為驗證模型的可靠性與方便實際操作，將工藝參數(shù)修正為Xyl與檸檬酸鈉質(zhì)量比3∶1、制備溫度70 ℃、pH 8.0，此條件下制備的XPC得率為66.35%，與預(yù)測值接近，說明基于響應(yīng)面法優(yōu)化工藝可靠。

圖2 因素間的交互作用對XPC得率的影響

Figure 2 Response surface of yield of XPC affected by different variables

2.2.4 鐵含量的測定 由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得XPC中鐵含量為22.57%。王花等[21]研究的大棗多糖鐵復(fù)合物中鐵含量為20.26%；李玉賢等[23]制備的百合多糖鐵中鐵(Ⅲ)含量為20.81%；王峰等[24]研究的絞股藍(lán)多糖鐵中鐵含量為29.14%。結(jié)果表明，最佳制備條件下的XPC不僅得率可觀，鐵含量也較高。

2.3 XPC結(jié)構(gòu)特征

2.3.1 紅外光譜分析 由圖3可知，Xyl和XPC在3 000 cm-1處有一強(qiáng)烈的吸收峰，為XPC中-OH的伸縮振動吸收，峰的強(qiáng)度和形狀的差異表明XPC的結(jié)構(gòu)中有更多的羥基，與金屬離子結(jié)合后，該吸收峰趨勢較陡，說明多糖中的—OH參與了絡(luò)合反應(yīng)[25]；3 000～2 900 cm-1處存在小的吸收峰，為XPC中C—H的伸縮振動；1 200～1 000 cm-1處的吸收峰是由C—O伸縮振動引起的；但在XPC光譜中有兩個峰值顯示一些遷移(1 633，1 045 cm-1)，表明鐵(Ⅲ)和Xyl有被羥基結(jié)合的可能[4]；碳水化合物指紋區(qū)1 000～400 cm-1處的吸收帶對XPC的變化敏感；862 cm-1處有一特殊吸收峰，與文獻(xiàn)[26]報道的β-FeOOH的特征吸收一致，表明XPC中的鐵都是以聚合的β-FeOOH鐵核結(jié)構(gòu)存在的。

圖3 XPC和Xyl的紅外圖譜

Figure 3 The infrared spectroscopy spectrum of XPC and Xyl

2.3.2 X-射線衍射分析 由圖4可知，Xyl和XPC未出現(xiàn)尖銳的吸收峰，修飾前后粉末衍射圖譜趨勢基本一致，說明形成復(fù)合物后，未破壞多糖結(jié)構(gòu)的基本骨架。XPC未呈現(xiàn)晶體的趨勢，結(jié)構(gòu)基本上是無定形的，與文獻(xiàn)[27]基本一致。此外，XPC的X-射線衍射圖譜不含F(xiàn)eCl3中的特征衍射峰，表明鐵(Ⅲ)可以與Xyl螯合并廣泛分散在糖鏈中。

2.4 抗氧化活性分析

由圖5可知，XPC對DPPH自由基的清除活性較顯著，當(dāng)樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，XPC對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)，隨樣品濃度的增高而增大；當(dāng)樣品濃度為2.0 mg/mL時，XPC對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值73.44%，比Xyl的高64.48%。當(dāng)樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，XPC對超氧陰離子的清除率隨樣品濃度的增高而增大；當(dāng)樣品濃度為2.0 mg/mL時，XPC對超氧陰離子的清除率高達(dá)30.95%，比Xyl的高37.20%。XPC對清除羥基自由基的能力隨樣品濃度的增高而增大，當(dāng)樣品濃度為2.0 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率為22.72%，比Xyl的高26.36%。當(dāng)樣品濃度為0.1～2.0 mg/mL時，Xyl和XPC均具有一定的還原能力，隨著樣品濃度的增高其還原能力不斷增強(qiáng)，但變化不明顯，與文獻(xiàn)[28]中大分子量的水溶性大豆多糖鐵還原能力相似。研究[28]表明，Xyl自身具有一定的抗氧化活性，與三價鐵離子螯合后，其抗氧化活性顯著增加，可能與三價鐵與Xyl共軛引起的結(jié)構(gòu)和分子量的變化有關(guān)。據(jù)報道[27]，相較于多糖自身，合成的平貝母多糖鐵配合物抗氧化活性顯著增加，與試驗結(jié)果相似，可能是Xyl結(jié)構(gòu)中的羥基與三價鐵離子螯合形成復(fù)合物，使其抗氧化活性增強(qiáng)[29]。

圖4 FeCl3、Xyl及XPC的X-射線衍射圖譜

Figure 4 The X-ray diffraction patterns of FeCl3, Xyl and XPC

圖5 XPC的抗氧化活性

3 結(jié)論

以木聚糖為原料，與FeCl3螯合形成木聚糖—鐵復(fù)合物，通過響應(yīng)面法優(yōu)化以確定木聚糖—鐵復(fù)合物的制備工藝。結(jié)果表明，最佳制備木聚糖—鐵復(fù)合物的工藝條件為木聚糖與檸檬酸鈉質(zhì)量比3∶1，制備溫度70 ℃，pH 8.0，木聚糖—鐵復(fù)合物得率為66.35%，含鐵量為22.57%。紅外光譜和X-射線衍射分析表明Fe3+成功與木聚糖螯合，形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，結(jié)構(gòu)呈無定形狀態(tài)。木聚糖分子中存在大量的羥基，由于與鐵離子螯合，木聚糖—鐵復(fù)合物的抗氧化活性明顯高于木聚糖。后續(xù)可采用動物試驗進(jìn)一步研究木聚糖—鐵復(fù)合物的毒性和生理功能特性，對木聚糖—鐵復(fù)合物能否開發(fā)為一種新型補(bǔ)鐵劑具有重要意義。