3種藜麥發(fā)芽過程中生物活性物質及其抗氧化活性的變化規(guī)律

陳益勝 - 舒藍萍 - 徐學明 -1, 陳宗振 - 洪婷婷 - 黃彩虹 - 衛(wèi) 曉 陳啟飛 - 金亞美 -

(1.江南大學食品科學國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.連云港麥澤福食品有限公司，江蘇 連云港 251111)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)屬藜科，雙子葉植物。其種子呈扁平圓形狀，直徑約1.5～4.0 mm。根據(jù)藜麥種子天然色素(花青素或原花青素)種類和含量的不同，可分為白色、紅色和黑色3種類型。藜麥的各種營養(yǎng)成分全面且均衡，是目前已知的唯一一種能獨立供給人類正常營養(yǎng)需要的谷物；藜麥不含麩質和類麩質蛋白[1]，不會引起過敏；因其富含皂苷、黃酮、蛻皮激素、γ-氨基丁酸等生物活性物質，常期食用可提高免疫力、降低患慢性疾病(心血管疾病、糖尿病、癌癥等)的風險[2]。為了宣傳藜麥的優(yōu)點和重要性，聯(lián)合國糧農組織將2013年定為“國際藜麥年”[3]。藜麥不僅營養(yǎng)價值高且能在土壤鹽堿、酸性、干旱等各種脅迫條件下生長[4]，特別適宜中國西北高原地區(qū)的農業(yè)環(huán)境。

發(fā)芽處理已成為谷物精深加工的一種重要手段。發(fā)芽是指種子吸水至一定程度，種子內淀粉酶和蛋白酶等內原酶被激活，淀粉、纖維和蛋白質等被水解成小分子，種子的物理和生化特性發(fā)生顯著變化的生理生化過程[5]。發(fā)芽在提高谷物營養(yǎng)價值、改善理化特性的同時，降低了種子的抗營養(yǎng)因子含量[6]。目前，發(fā)芽作為一種加工手段已很好地應用于糙米且取得了一定的成果，如發(fā)芽糙米面包[7]、糙米飯[8]等。此外，課題組[9]前期研究表明，發(fā)芽還可以顯著提高薏米中γ-氨基丁酸、谷維素和VE等重要生物活性物質的含量。馮煥琴等[10]研究了藜麥中的生物活性物質含量，但藜麥發(fā)芽過程中生物活性物質含量的變化尚未見報道。試驗擬以紅、黑、白3種主要藜麥的種子為原料，通過測定不同發(fā)芽時間段藜麥種子中的γ-氨基丁酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、皂苷、總酚含量，以及發(fā)芽期間藜麥種子的抗氧化性，研究其萌發(fā)過程中營養(yǎng)物質和理化性質的動態(tài)變化，旨在促進藜麥產品精深加工發(fā)展，提高其產品的經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秘魯黑藜麥、紅藜麥、白藜麥：市售；

DPPH、γ-氨基丁酸、齊墩果酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯：分析純，美國Sigma公司；

福林酚、沒食子酸：分析純，百靈威試劑公司；

恒溫恒濕箱：LHS-80HC-1型，上海一恒科學儀器有限公司；

凍干機：77530-30L型，照生有限公司；

高速粉碎機：600Y型，永康市鉑歐五金制品有限公司；

氨基酸自動分析儀：835-50型，日本日立公司；

旋蒸儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜：Agilent 1100型，美國安捷倫公司；

紫外—可見分光光度計：TU-1900型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

選擇籽粒飽滿、無霉爛和病蟲害的完整的黑、紅、白藜麥種子，在0.1%的NaClO溶液中浸泡30 min，用去離子水洗滌3次后，于25 ℃遮光條件下浸泡12 h，將浸泡后的藜麥種子置于培養(yǎng)皿上，于溫度25 ℃、濕度90%的恒溫恒濕箱中避光發(fā)芽。分別在發(fā)芽的0，12，24，36，48，60，72 h取樣，樣品凍干、粉碎、過篩后儲存于-20 ℃環(huán)境中備用。

1.3 檢測方法

1.3.1γ-氨基丁酸(GABA)的測定 參照文獻[11]。

1.3.2 表兒茶素的測定 準確稱取2.0 g發(fā)芽藜麥于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，室溫下超聲提取40 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過0.45 μm微孔濾膜，定容于50 mL容量瓶中。采用HPLC系統(tǒng)對表兒茶素含量進行分析，HPLC系統(tǒng)選用C18柱，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流動相為乙腈—0.5%乙酸，進樣量10 μL。

1.3.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的測定 準確稱取2.0 g發(fā)芽藜麥于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，室溫下超聲提取40 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過0.45 μm微孔濾膜，定容于50 mL容量瓶中。采用HPLC系統(tǒng)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量進行分析，HPLC系統(tǒng)選用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流動相為甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2，流速1.0 mL/min，檢測波長276 nm，柱溫24 ℃，進樣量10 μL。

1.3.4 皂苷的測定 參照文獻[12]。

1.3.5 總酚含量的測定 參照文獻[13]。

1.3.6 體外抗氧化性的測定

(1)DPPH自由基清除能力：將200 μL適當稀釋的樣品加入到3.8 mL 60 μmol/L DPPH溶液中，室溫下黑暗處反應60 min，于517 nm處測定吸光值。以甲醇溶液代替樣品作空白對照，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A——樣品與DPPH溶液反應后的吸光值；

B——空白對照(甲醇溶液)與DPPH反應后的吸光值；

(2)鐵離子還原能力(FRAP)：參照文獻[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計方差分析，結果以(均值±SD)表示。采用LSD法對試驗結果進行顯著性分析，P<0.05時表明存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 γ-氨基丁酸含量的變化

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動物和植物中的非蛋白氨基酸，是動物體內不可或缺的抑制性神經遞質[15]。研究[16]表明，GABA在調節(jié)血壓、減輕焦慮、延緩記憶力衰退等方面有一定的促進作用。發(fā)芽是富集GABA的重要手段之一，楊天等[17]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)芽可使花生的GABA含量增加14.99倍；張穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過金屬離子脅迫萌發(fā)富集的小米糙米中的GABA含量可高達24.71 mg/100 g。由圖1可知，當發(fā)芽時間為0～48 h時，黑藜麥和紅藜麥的GABA含量均隨發(fā)芽時間的延長而增加，其中黑藜麥的GABA含量在發(fā)芽第48 h時達最大值，為未發(fā)芽時的7.10倍；當發(fā)芽時間為60 h時，紅藜麥的GABA含量相較于第48 h時有所下降，但在發(fā)芽第72 h時達最大值157.4 mg/100 g，為未發(fā)芽時的6.47倍；當發(fā)芽時間為0～48 h時，白藜麥的GABA含量有所降低，可能是GABA轉氨酶的酶活強于GABA合成的限速酶谷氨酸脫羧酶的酶活，但在發(fā)芽第60 h時大幅度增加，在發(fā)芽第72 h時達最大值，為未發(fā)芽時的6.40倍。發(fā)芽使得3個品種藜麥的GABA含量均有大幅度的增加，可能是由萌芽激活了谷氨酸脫羧酶引起的[19]。

2.2 表兒茶素含量的變化

表兒茶素是存在于植物中的含有多羥基的天然多酚物質，多羥基結構使其具有優(yōu)越的抗氧化能力[20]、抗炎作用[21]和抗腫瘤[22]等功能。由表1可知，未發(fā)芽藜麥中的表兒茶素含量為2.81～6.31 mg/100 g，發(fā)芽處理使藜麥中的表兒茶素含量增加，最高可達26.36 mg/100 g。黑藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先增加后減少，在發(fā)芽第48 h時達最大值(26.36 mg/100 g)，為未發(fā)芽時的7.11倍；紅藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先減少再增加，在發(fā)芽第12 h時達最大值(17.77 mg/100 g)；白藜麥的表兒茶素含量隨發(fā)芽時間的延長先減少后增加，在發(fā)芽第60 h時達最大值(14.68 mg/100 g)，為未發(fā)芽時的1.32倍。表兒茶素含量變化主要由CH4、CHI、PAL等主要代謝酶的酶活在萌芽過程中的變化所引起[23]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 The content ofγ-aminobutyric acid changed during the germination of quinoa

表1 藜麥發(fā)芽過程中表兒茶素含量的變化?

Table 1 The content of epicatechin changed during the germination of quinoa mg/100 g

發(fā)芽時間/h黑藜麥紅藜麥白藜麥03.25±0.35a2.81±0.28a6.31±0.44d1219.11±0.12d17.77±0.38g5.06±0.08c2421.76±0.37f15.37±0.19e3.50±0.14a3620.68±0.46e10.88±0.17c4.25±0.07b4826.36±0.19g9.83±0.24b6.03±0.23d6015.19±0.27c12.80±0.28d14.68±0.03f7213.16±0.23b16.66±0.05f12.94±0.20e

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量的變化

袁悅等[24]發(fā)現(xiàn)沒食子酸脂(EGCG)能延緩肌原纖維蛋白的變性和降解程度，延緩魚糜氧化變質程度，有望成為一種新型的魚糜抗凍劑；李洋等[25]發(fā)現(xiàn)不同濃度EGCG處理對黃瓜種子萌發(fā)、主根伸長及側根的發(fā)生具有一定的濃度效應。由圖2可知，未發(fā)芽的黑、紅、白3種藜麥間EGCG含量差異不大。紅藜麥的EGCG含量隨發(fā)芽時間的延長而不斷升高，在發(fā)芽第72 h時達最大值17.14 mg/100 g。黑藜麥的EGCG含量隨發(fā)芽時間的延長先降低后增加，在發(fā)芽第48 h時達最大值23.81 mg/100 g。白藜麥的EGCG含量變化與黑藜麥的類似，呈先降低后增加的變化趨勢，白藜麥的EGCG含量在發(fā)芽第72 h時達最大值17.61 mg/100 g。植物代謝中，EGCG的上一級代謝產物為表沒食子兒茶素[26]，因此可通過測定藜麥萌發(fā)過程中表沒食子兒茶素含量以及表沒食子兒茶素轉化成EGCG反應中限速酶酶活的變化，探究藜麥發(fā)芽過程中EGCG含量變化的機理。

2.4 皂苷含量的變化

藜麥皂苷主要以三萜皂苷形式存在于種皮中，其含量為0.14%～2.30%。藜麥皂苷主要為齊墩果酸型、常春藤型、商陸酸型等[27]。由圖3可知，3種藜麥的初試皂苷含量為4.3～5.1 mg/g，與黃金等[28]的研究結果(5.56 mg/g)基本一致。黑藜麥與紅藜麥的皂苷含量均隨發(fā)芽時間的延長而增加，白藜麥的皂苷含量變化波動但較不顯著。黑藜麥的皂苷含量隨發(fā)芽時間的延長而增加，在發(fā)芽第72 h時達最大值(13.44 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了204.76%；紅藜麥的皂苷含量除發(fā)芽第24 h與第12 h相比有所降低外整體呈上升趨勢，在發(fā)芽第60 h時達最大值(8.96 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了106.23%；白藜麥的皂苷含量變化整體呈先降低后增加趨勢，在第36 h時達最低值(3.73 mg/g)，在第72 h時達最大值(5.72 mg/g)，比未發(fā)芽時的增加了11.39%。藜麥發(fā)芽過程中皂苷含量的增加，可能是不同酶系統(tǒng)的合成和激活促進了皂苷的生成，也可能是種子結構的弱化增強了溶劑提取過程[29]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 The content of epigallocatechin gallate changed during the germination of quinoa

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Changes of saponins content during germination of quinoa

2.5 總酚含量的變化

由圖4可知，黑藜麥、紅藜麥、白藜麥的總酚含量變化大體一致，均隨發(fā)芽時間的延長而增加。黑藜麥的總酚含量在發(fā)芽過程中增加較均勻；紅藜麥的總酚含量發(fā)芽前60 h增加幅度較小，在發(fā)芽第72 h時迅速增加；白藜麥的總酚含量雖然也呈遞增趨勢但整體變化幅度不大。未發(fā)芽時，藜麥的總酚含量為1.2～1.4 mg GAE/g，三者總酚含量均在發(fā)芽第72 h時達最大值，分別比未發(fā)芽時增加了2.37，2.32，1.06倍。韓雅盟等[30]研究發(fā)現(xiàn)深色藜麥的酚類物質及其抗氧化活性更高，且認為藜麥發(fā)芽過程中總酚含量增加是苯丙氨酸轉氨酶和細胞壁過氧化物酶等酶活性增加所引起的。

2.6 抗氧化活性的變化

2.6.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，3種藜麥的初試DPPH自由基清除能力存在一定差異，其中最低的為白藜麥(33.04%)，黑、紅藜麥的DPPH自由基清除率較高，分別為47.71%，51.40%。黑藜麥的DPPH自由基清除能力隨發(fā)芽時間的延長而遞增，在第72 h時達最大值(88.04%)，比未發(fā)芽時增加了84.53%；紅藜麥發(fā)芽前60 h時的DPPH自由基清除能力變化無明顯差異，在發(fā)芽第72 h時大幅度增加至92.61%；白藜麥的DPPH自由基清除能力在發(fā)芽前36 h隨發(fā)芽時間的延長而降低，在第36 h時達最低值，在第60 h時達最大值(40.48%)，比未發(fā)芽時增加了22.48%。綜上，發(fā)芽處理可提高谷物的DPPH自由基清除能力，不同顏色藜麥的增幅存在一定差異，與發(fā)芽可以增加藜麥的總酚含量有所關聯(lián)。藜麥的皂苷、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等含有羥基物質的含量在發(fā)芽過程中有所增加，因此藜麥清除DPPH自由基的能力有所增加。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Changes in total phenolic content during germination of quinoa

2.6.2 鐵離子還原能力(FRAP) 由圖6可知，3種藜麥的鐵離子還原能力隨發(fā)芽時間的延長有不同程度的提高，表明發(fā)芽能提高藜麥的抗氧化性。紅藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第60 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了3.35倍；白藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第72 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了1.16倍；黑藜麥的鐵離子還原能力在發(fā)芽第72 h時達最大值，比未發(fā)芽時增加了2.62倍。吳鳳鳳等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)芽糙米相比，各階段的發(fā)芽糙米甲醇提取物的還原能力皆有不同程度的提高，與試驗結果類似。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 5 Changes of DPPH clearance rate during the germination of quinoa

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

黑、紅、白3色藜麥經發(fā)芽處理后，生物活性成分(γ-氨基丁酸、皂苷、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和總多酚)含量和體外抗氧化活性(DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力)均有不同程度的提高，其中白藜麥的變化幅度均小于黑藜麥和紅藜麥的。黑藜麥和紅藜麥各指標的變化趨勢較一致，均隨發(fā)芽時間的延長而遞增。白藜麥發(fā)芽過程中各指標含量基本上隨發(fā)芽時間的延長先降低后升高，升高幅度不大。黑、紅、白3種藜麥的最佳發(fā)芽終止時間分別為48，72，72 h。后續(xù)可探索不同溫度與濕度對藜麥發(fā)芽的影響，縮短檢測的間隔時間，以期找到發(fā)芽過程中各種生物活性成分變化的機理。