敲除小鼠Ormdl3 基因可部分緩解降植烷誘導(dǎo)的狼瘡表型

賈 維， 馬占兵， 劉奇跡， 黨 潔

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室，寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室，銀川 750004； 3.山東大學(xué)實驗畸形學(xué)教育部重點實驗室，濟(jì)南 250001）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種臨床常見的累及多系統(tǒng)、多臟器的高異質(zhì)性自身免疫疾病，其有明顯的遺傳傾向，遺傳度為43.6%[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SLE 同胞患病風(fēng)險是正常人的8～29 倍；SLE 同卵雙生子發(fā)病率（24%～65%）遠(yuǎn)高于異卵雙生子（2%～9%）[1]，提示遺傳因素在SLE 發(fā)病過程具有重要作用，因此，探索SLE 發(fā)病潛在遺傳學(xué)機(jī)制，篩選用于治療SLE 的候選靶基因已成為目前研究的熱點。SLE 患者體內(nèi)存在多種免疫調(diào)節(jié)功能的異常，包括T、B 淋巴細(xì)胞異常反應(yīng)、大量病理性自身抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體激活和免疫復(fù)合物沉積等，其中異常的B 細(xì)胞發(fā)育分化打破機(jī)體免疫耐受，導(dǎo)致B細(xì)胞異常活化從而影響SLE 疾病的進(jìn)程與發(fā)展，成為目前有關(guān)SLE 發(fā)生機(jī)制研究的主要方向[2]。通過對SLE 患者進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）顯示，血清類黏蛋白樣3（orosomucoidlike 3，ORMDL3）基因可能是SLE 的易感基因[3-5]。本課題組既往研究顯示，ORMDL3基因在SLE 患者外周血單核細(xì)胞和Faslpr/lpr狼瘡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中的表達(dá)增高，同時通過體內(nèi)及體外實驗發(fā)現(xiàn)ORMDL3 能夠通過ATF6-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-Beclin1 自噬途徑介導(dǎo)B 細(xì)胞自噬，通過促進(jìn)B 細(xì)胞自噬和抑制B 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)脾臟B 淋巴細(xì)胞的過度存活，并借此在SLE 的病理發(fā)生中發(fā)揮作用[6]。

鑒于ORMDL3 對B 細(xì)胞發(fā)育及存活的影響，缺失Ormdl3 后可能會緩解狼瘡小鼠的部分表型。為此，利用之前構(gòu)建得到的Ormdl3 敲除小鼠，通過向野生小鼠和敲除小鼠腹腔注射降植烷（Pristane，2，6，10，14 -petramethylpentadecane，

TMPD），構(gòu)建得到Ormdl3 基因敲除的降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠及其對照小鼠模型，通過對兩類小鼠表型的對照研究，探討ORMDL3 在狼瘡病程發(fā)展的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用TALEN 技術(shù)獲得C57BL/6 品系Ormdl3+/-雜合敲除小鼠，通過雜合小鼠雌雄交配繁殖得到Ormdl3-/-小鼠。采用降植烷腹腔注射法誘導(dǎo)狼瘡小鼠模型[7]。

選取6～8 周齡性別、年齡相匹配的Ormdl3-/-純合敲除小鼠及其同窩Ormdl3+/+野生小鼠為研究對象（Faslpr/1pr小鼠模型在本文中作為陽性對照，由于Faslpr/1pr小鼠模型為自發(fā)狼瘡小鼠，其與Ormdl3 敲除小鼠雜交獲得雙敲除小鼠的時間很長，故本文采取對Ormdl3 敲除小鼠進(jìn)行降植烷誘導(dǎo)后獲得的狼瘡小鼠模型進(jìn)行實驗）。依據(jù)小鼠基因型不同，將Ormdl3-/-敲除小鼠及野生小鼠分為模型組和對照組。模型組小鼠單次腹腔注射0.5 mL 降植烷，對照組小鼠單次腹腔注射0.5 mL PBS 緩沖液。據(jù)此，將實驗小鼠共分為4 組，Ormdl3-/-+降 植 烷 組、Ormdl3-/-+PBS 組、Ormdl3+/++降植烷組和Ormdl3+/++PBS 組，每組10只，共40 只。將全部注射后小鼠再次分為兩組，即一部分在注射3 個月后處死（每組3 只），另一部分在注射6 個月后處死（每組7 只）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 小鼠解剖器械購自上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司；冰凍切片機(jī)購自美國Thermo Scientific 科技公司；小鼠尿液收集代謝籠購自美國Hatteras instruments 公司；實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自瑞士羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司；流式細(xì)胞分析儀購自美國BD 生物公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Protein Simple 公司；NanoDrop 核酸與蛋白質(zhì)定量分析儀購自美國Thermo Scientific 科技公司；200 目細(xì)胞篩購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2.2 試劑 降植烷購自美國Sigma 公司；尿蛋白定量試劑盒（貨號：C035-2）購自南京建成生物科技有限公司；TRIzol 購自日本Takara 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司；Real SYBR Mixture 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；5×dNTP、5×PCR 反應(yīng)緩沖液、Taq 酶均購自Thermo Scientific 公司；蘇木素染液、伊紅染液均購于碧云天生物科技有限公司；Anti-mouse CD4 FITC、Anti-mouse CD8a PE 購自Biolegend生物科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠尿蛋白測定 采用尿蛋白定量試劑盒對待檢小鼠24 h 尿蛋白進(jìn)行定量分析。NanoDrop 核酸與蛋白質(zhì)定量分析儀測定待測樣本595 nm 處吸光度值（OD 值）。計算公式：尿蛋白濃度（mg·L-1）=（樣品管OD 值-空白管OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD 值-空白管OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（563 mg·L-1）。

1.3.2 HE 染色 采用常規(guī)方法制備待檢小鼠脾臟組織，4 ℃沉糖，-30 ℃冰凍包埋切片，厚度為7 μm，-20 ℃保存?zhèn)溆?。切片?jīng)解凍，蘇木素染色，三蒸水終止染色、乙醇脫水（75%和95%乙醇各一次），伊紅染色，三蒸水終止染色，無水乙醇二次脫水，二甲苯透明，晾干，中性樹膠封片等步驟后，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.3 脾臟單細(xì)胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇中消毒片刻，于小鼠腹部左側(cè)肋弓下尋找脾臟并小心鈍性分離。小鼠脾臟組織通過研磨棒碾壓，PBS 緩沖液沖洗，經(jīng)200 目細(xì)胞篩過濾收集至15 mL 離心管中，1500 r·min-1離心10 min，棄上清。向各待測管中加入10 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫下靜置5～10 min，再次1500 r·min-1離心10 min，棄上清。加入適量PBS 緩沖液清洗并終止裂解，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為106～108個/mL 備用。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù) 吸取100 μL 小鼠脾臟單細(xì)胞懸液至無菌1.5 mL EP 管中，根據(jù)流式抗體說明書向樣品管中加入適量FITC anti-mouse CD4抗體、PE anti-mouse CD8a 抗體，于室溫下避光孵育20 min。1500 r·min-1離心10 min，棄上清。再次向每管中加入PBS 緩沖液沖洗2 遍，最后以500 μL PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有圖像處理由GraphPad Prism 5 軟件完成。組內(nèi)比較采用配對t檢驗，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ormdl3 基因敲除小鼠的構(gòu)建

利用TALEN 靶向基因敲除策略，構(gòu)建得到Ormdl3 基因雜合敲除小鼠，隨后通過雌雄交配獲得Ormdl3 基因純合敲除小鼠。由于ORM 家族基因同源性達(dá)92%以上，通過Western blot 法無法有效區(qū)分ORM 家族各個成員（ORMDL1、ORMLD2、ORMDL3），因此，最終采用qPCR 及半定量方法驗證小鼠Ormdl3 基因敲除效率。結(jié)果顯示，小鼠脾臟中Ormdl3 基因表達(dá)降低（t=4.372，P＜0.001）（圖1 左）。同時，與其高度同源的Ormdl1 和Ormdl2 表達(dá)無明顯改變，說明敲除效率良好（圖1 右）。

2.2 小鼠注射降植烷后脾臟腫大程度、脾臟質(zhì)量、體質(zhì)量及其比值的變化

降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠是目前最常用的化學(xué)誘導(dǎo)型狼瘡小鼠，一般在注射2 周后會出現(xiàn)淋巴細(xì)胞異?；罨?，6 個月后會出現(xiàn)尿蛋白、腎小球腎炎等嚴(yán)重表型。本實驗結(jié)果顯示所有實驗小鼠脾臟在注射降植烷3 個月后都可出現(xiàn)不同程度的腫大，這種現(xiàn)象在注射6 個月后更為明顯。然而，Ormdl3-/-敲除小鼠脾臟大小明顯低于Ormdl3+/+野生小鼠，即使在注射降植烷后，脾臟腫大程度也明顯降低，提示Ormdl3 敲除可明顯抵抗脾臟腫大的現(xiàn)象（圖2）。

通過對未注射降植烷的Ormdl3-/-敲除小鼠與Ormdl3+/+野生小鼠脾臟質(zhì)量和體質(zhì)量的比較結(jié)果顯示，相比于Ormdl3+/+野生小鼠，Ormdl3-/-敲除小鼠脾臟質(zhì)量降低（t=2.321，P=0.049），但體質(zhì)量并無明顯變化（t=1.071，P=0.305），因此脾質(zhì)量與體質(zhì)量比值降低（t=2.201，P=0.043）。注射降植烷6 個月后，Ormdl3+/+野生小鼠脾臟質(zhì)量增加（t=3.770，P=0.009），而Ormdl3-/-敲除小鼠脾臟增大程度較野生小鼠變化較小（t=3.361，P=0.015）。Ormdl3-/-敲除小鼠脾臟較注射降植烷的Ormdl3+/+野生小鼠體質(zhì)量改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而脾臟質(zhì)量增幅降低（t=2.731，P=0.018），因此脾質(zhì)量與體質(zhì)量的比值降低（t=2.198，P=0.045）。以上結(jié)果進(jìn)一步提示，Ormdl3 基因缺失可緩解降植烷所致小鼠脾臟免疫亢進(jìn)的現(xiàn)象（圖3）。

2.3 Ormdl3 基因敲除對降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠腎臟的影響

尿蛋白水平增高是快速直觀反應(yīng)SLE 患者腎臟損傷程度的有效指標(biāo)，因此，為了明確Ormdl3基因敲除是否能夠有效緩解降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠尿蛋白水平，利用小鼠代謝籠收集各組實驗小鼠24 h 尿液，并利用考馬斯亮藍(lán)法檢測尿蛋白濃度。結(jié)果顯示，Ormdl3+/+野生小鼠在注射降植烷3 個月后即可檢測到有尿蛋白產(chǎn)生，與注射6 個月后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.464，P=0.663）。與Ormdl3+/+野生小鼠相比，Ormdl3-/-敲除小鼠在注射降植烷3、6 個月后尿蛋白濃度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.170，P=0.307；t=2.239，P=0.066）（圖4）。

HE 染色結(jié)果顯示，Ormdl3+/+野生小鼠在注射降植烷6 個月后出現(xiàn)明顯腎小球腎炎表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、腎小球體積增大致腎小囊腔減小或消失、系膜增生等。Ormdl3-/-敲除小鼠在注射降植烷6 個月后雖然也出現(xiàn)腎小球腎炎表現(xiàn)，但腎小球增大并不顯著（圖5）。以上結(jié)果提示，Ormdl3 基因缺失在一定程度上可以抵抗降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠腎臟損傷水平。

2.4 Ormdl3 基因敲除對降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠脾臟CD4+/CD8+ T 細(xì)胞比例的影響

SLE 患者體內(nèi)往往會出現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞比例升高，而CD8+T 細(xì)胞比例降低，因此SLE 患者體內(nèi)是否出現(xiàn)免疫細(xì)胞失常通常以CD4+/CD8+T細(xì)胞比例進(jìn)行判斷。為了進(jìn)一步證實Ormdl3 基因敲除是否會影響降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞比例，通過流式細(xì)胞術(shù)對四組實驗小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞比例進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Ormdl3+/++PBS 組與Ormdl3+/++降植烷組脾臟CD4+T 細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.548，P=0.148）。與注射PBS 的野生小鼠比較，降植烷誘導(dǎo)的Ormdl3+/+野生小鼠脾臟CD8+T 細(xì)胞比例下降（t=2.250，P=0.044），進(jìn)而導(dǎo)致CD4+/CD8+T 細(xì)胞比例升高（t=2.237，P=0.047），而敲除小鼠能夠明顯抵抗CD4+/CD8+T 細(xì)胞比例上升的趨勢，提示缺失Ormdl3 可能抑制脾臟T 淋巴細(xì)胞的過度活化（圖6）。

3 討論

ORMDL3 作為哮喘的易感基因[8-11]，目前已經(jīng)在國內(nèi)外多個人群研究中得到驗證[12-14]，此外越來越多的研究發(fā)現(xiàn)該基因還與玉型糖尿病[15-16]、炎性腸病[17]、強(qiáng)直性脊柱炎[18]、動脈粥樣硬化[19]、SLE[6]等免疫炎癥性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

ORMDL3 基因定位于染色體17q12-21，編碼一個含有153 個氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)4 次跨膜蛋白，該蛋白是絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶（serine palmitoyltransferase ，SPT）在鞘磷脂生物合成初始階段的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其能夠通過抑制SPT 的活性進(jìn)而抑制鞘磷脂的合成，并可能借此抑制NK 及T 細(xì)胞免疫功能[9]。此外，作為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，ORMDL3 還被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣泵活性而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded-proteinresponse，UPR），從而影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引發(fā)諸多免疫炎癥性疾病的發(fā)生[20]。同時，ORMDL3 能夠上調(diào)IL-17 的分泌水平，提示其可能對T 細(xì)胞的早期發(fā)育發(fā)揮重要作用[21]。

本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[6]，ORMDL3基因高表達(dá)于人免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞系及小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。同時，在Faslpr/1pr小鼠模型脾臟淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因表達(dá)顯著增高，提示ORMDL3可能參與SLE 的病理發(fā)生。在后續(xù)構(gòu)建得到的ORMDL3基因敲除小鼠中，還發(fā)現(xiàn)敲除小鼠脾臟體積及質(zhì)量顯著下降。同時，Ormdl3-/-小鼠脾臟成熟B 細(xì)胞（Mature B，CD19+IgM+IgDhi）、T2型B 細(xì)胞（Transitional 2B，CD19+IgMhiIgDhi）及腹腔B1a（B220loCD5+）細(xì)胞比例與野生小鼠相比顯著下降，此結(jié)果并不受B 細(xì)胞增殖周期及凋亡水平的影響。同時，ORMDL3基因缺失對各亞型T細(xì)胞比例并無顯著影響[6]。進(jìn)一步研究證實，造成以上結(jié)果產(chǎn)生的分子機(jī)制是由于ORMDL3 能夠通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白——轉(zhuǎn)錄活化因子6（activating transcription factor 6，ATF6）的表達(dá)和入核，導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞自噬水平提高，并抑制B 細(xì)胞凋亡，從而從整體水平上導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞過度存活[6]。

目前，B 細(xì)胞功能亢進(jìn)導(dǎo)致自身抗體大量產(chǎn)生被認(rèn)為是SLE 最顯著的病理特征[22]，結(jié)合前期結(jié)果，ORMDL3 基因可能正是憑借其對脾臟B淋巴細(xì)胞發(fā)育及數(shù)量維持的顯著調(diào)控作用，參與了SLE 等免疫炎癥性疾病的病理發(fā)生。為了進(jìn)一步驗證ORMDL3 基因敲除是否能夠抵抗狼瘡病程的進(jìn)展，我們利用降植烷注射構(gòu)建了Ormdl3 敲除的藥物誘導(dǎo)狼瘡小鼠模型[6]。本次研究通過與野生小鼠的對比分析發(fā)現(xiàn)，用降植烷誘導(dǎo)獲得的ORMDL3基因敲除的狼瘡小鼠癥狀有所緩解，主要表現(xiàn)在脾臟腫大現(xiàn)象得到明顯抑制，腎臟病理損傷程度較輕微。此外，ORMDL3基因敲除后可以明顯抵抗降植烷誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+/CD8+T 細(xì)胞比例的上升。以上結(jié)果提示缺失Ormdl3 對狼瘡小鼠疾病程度有所緩解，初步提示ORMDL3可能在導(dǎo)致SLE 發(fā)病過程中具有一定作用。

綜上，本研究通過構(gòu)建得到的降植烷誘導(dǎo)的Ormdl3 敲除狼瘡小鼠表型的部分研究結(jié)果，初步提示ORMDL3 可能作為新的靶點對SLE 起到一定治療作用。然而，本文尚存在很多不足。由于時間所限，對于ORMDL3 對降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠表型是否有緩解作用的實驗結(jié)果并不充分。此外，由于小鼠遺傳背景（C57BL/6）的原因，所致降植烷狼瘡表型與常規(guī)誘導(dǎo)小鼠（BABL/c）所得SLE 表型并不完全一致，所以不能完全說明Ormdl3 對狼瘡表型的影響。因此，有必要構(gòu)建Ormdl3-/-Faslpr/1pr小鼠模型，希望借助自發(fā)狼瘡小鼠模型對ORMDL3 是否影響SLE 發(fā)生進(jìn)行更深入的研究。