Morris 水迷宮在篩選急性CO 中毒遲發(fā)性腦病模型中的應(yīng)用

胡小東， 關(guān) 浩， 楊立山

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診科，銀川 750004）

急性CO中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是急性CO 中毒最嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，約3%～30%的嚴(yán)重CO 中毒患者經(jīng)過2～60 d 的假愈期后出現(xiàn)遲發(fā)性腦病[1]，其確切發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明，無特效的治療手段，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。篩選合格DEACMP 模型是驗(yàn)證造模成功與否的基礎(chǔ)，是探索其發(fā)病機(jī)制的前提，對(duì)預(yù)判DEACMP 易發(fā)時(shí)間段提供一定的依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)下一步治療有重要應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)腹腔注射CO 染毒的方式造模，在造模前后6 個(gè)時(shí)間篩選點(diǎn)，先通過Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的平均潛伏期檢測(cè)DEACMP 大鼠認(rèn)知功能，初步篩選出DEACMP 大鼠模型，再通過組織形態(tài)學(xué)技術(shù)觀察海馬神經(jīng)元變性壞死情況，將變性壞死的神經(jīng)元計(jì)為“陽性細(xì)胞”，對(duì)平均潛伏期和陽性細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，探索Morris 水迷宮在連續(xù)篩選DEACMP 模型方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇健康成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量在280～330 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（寧）2015-0001］。SD 大鼠先經(jīng)過Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練5 d，第6 天篩選出60 s 以內(nèi)能找到平臺(tái)的合格SD 大鼠108 只，編號(hào)后按隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為：DEACMP 組，給予CO 純品氣體腹腔注射[2]；空氣組，給予空氣腹腔注射；空白組，不進(jìn)行任何預(yù)處理。每組36 只大鼠。根據(jù)造模前后6 個(gè)時(shí)間篩選點(diǎn)（造模前、造模后第1 天、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天），將DEACMP組、空氣組、空白組分別分成6 個(gè)亞組，每個(gè)亞組6 只，造模過程中死亡的大鼠繼續(xù)訓(xùn)練補(bǔ)充。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

CO 純品氣體（99.99%）購自佛山市科的氣體化工有限公司；血?dú)夥治鰞x（Cobasb221）購自Roche公司；Morris 水迷宮分析跟蹤系統(tǒng)購自成都泰盟公司；石蠟切片機(jī)（Leica Rm2235）購自Leica 公司。

1.3 大鼠模型制備

DEACMP 組采用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP 大鼠模型[3]（首次注射99.99% CO 純品氣體120 mL·kg-1，后連續(xù)注射3 次，每次按照首次劑量的2/3，間隔4 h）。DEACMP 組遵循先造模后抽血的原則，與空氣組、空白組從首次造模后2 h 開始檢測(cè)動(dòng)脈血碳氧血紅蛋白（HbCO）濃度，然后在造模后4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 檢測(cè)。每組隨機(jī)抽取6 只，取股動(dòng)脈抽血，進(jìn)行血?dú)夥治鰷y(cè)HbCO 的濃度。

1.4 大鼠Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)

將大鼠頭面向池壁依次從四個(gè)象限放入池中，每次航行總時(shí)間為60 s，記錄大鼠上平臺(tái)時(shí)間，此時(shí)間為潛伏期，把大鼠四個(gè)象限逃避潛伏期的平均值記為平均逃避潛伏期。在5 d 訓(xùn)練后，若大鼠在60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，剔除，隨機(jī)補(bǔ)充大鼠訓(xùn)練，選出合格大鼠108 只，隨機(jī)分為DEACMP組、空氣組、空白組，每組36 只，根據(jù)造模前后檢測(cè)時(shí)間每組又分為造模前、造模后第1 天、第7天、第14 天、第21 天和第28 天共6 個(gè)亞組，分別記錄各組大鼠的潛伏期，若在60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)則記錄其潛伏期記為60 s。

1.5 大鼠腦組織蘇木素-伊紅染（HE）染色

根據(jù)造模前、造模后第1 天、第7 天、第14天、第21 天和第28 天不同時(shí)間點(diǎn)完成Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)后，每組6 只大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后仰臥位固定于操作臺(tái)上，先以0.9%生理鹽水（約200 mL）灌注，待右心耳流出清亮液體并且肝臟變?yōu)辄S白色后用4%多聚甲醛（約150 mL/只）灌注，直至大鼠四肢及尾巴蒼白僵硬，斷頭取腦，制備石蠟切片HE 染色，通過HE 染色觀察DEACMP 的神經(jīng)元的變性壞死[4]情況，在40 倍鏡下觀察，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成紅色，將被蘇木素藍(lán)色深染、變形的細(xì)胞核計(jì)為“陽性細(xì)胞”。采用Image Pro Plus 圖像處理軟件，對(duì)海馬CA3 區(qū)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，DEACMP 組的平均潛伏期與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性CO 中毒表現(xiàn)

大鼠每次中毒數(shù)分鐘后出現(xiàn)口唇、鼻黏膜、耳朵和四肢末端皮膚呈現(xiàn)櫻桃紅色改變，持續(xù)約2～3 h。部分大鼠在每次中毒后1 h 出現(xiàn)呼吸急促，全是皮毛聳立，行動(dòng)遲緩，步態(tài)不穩(wěn)，四肢軟癱，小便失禁，持續(xù)約1～2 h。少部分大鼠中毒后1 h 出現(xiàn)全身痙攣強(qiáng)直性抽搐、昏迷、呼吸心跳驟停。

2.2 大鼠動(dòng)脈血HbCO 濃度測(cè)定結(jié)果

DEACMP 組的HbCO 濃度在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h時(shí)維持在50%以上，20 h、24 h 逐漸下降，各時(shí)點(diǎn)HbCO 濃度均高于空白組、空氣組（P均＜0.05），空白組和空氣組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.3 大鼠Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)結(jié)果

DEACMP 組的平均潛伏期與空白組、空氣組比較，在造模前、造模后第1 天、第7 天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而在第14 天、第21 天、第28 天均長(zhǎng)于空白組、空氣組（P均＜0.05）。空白組和空氣組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表1 DEACMP 大鼠造模后不同時(shí)間動(dòng)脈血HbCO 濃度（±s，%）

表1 DEACMP 大鼠造模后不同時(shí)間動(dòng)脈血HbCO 濃度（±s，%）

與空白組比較*P＜0.05；與空氣組比較#P＜0.05

組別 n 2 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h空白組 6 1.62±0.10 1.46±0.49 1.46±0.36 1.58±0.13 1.57±0.05 1.66±0.09 1.65±0.07空氣組 6 1.57±0.32 1.58±0.41 1.52±0.24 1.76±0.18 1.76±0.18 1.57±0.39 1.52±0.27 DEACMP 組 6 70.43±3.63*# 66.80±1.69*# 65.28±2.70*# 65.35±3.24*# 56.35±1.69*# 6.85±0.94*# 2.70±0.61*#F 值 1426.93 5240.96 2182.42 1542.27 4127.38 104.47 11.21 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 DEACMP 大鼠造模前后不同時(shí)間點(diǎn)平均潛伏期（±s，s）

表2 DEACMP 大鼠造模前后不同時(shí)間點(diǎn)平均潛伏期（±s，s）

與空白組比較*P＜0.05；與空氣組比較#P＜0.05；

組別 n 造模前 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天空白組 6 20.59±2.56 20.38±2.73 20.45±3.85 18.90±1.96 16.28±2.02 14.02±3.49空氣組 6 20.32±1.69 19.41±2.32 21.46±6.01 19.80±1.31 17.37±1.36 14.79±3.53 DEACMP 組 6 19.88±2.41 19.34±1.31 21.45±4.58 33.68±6.78*# 25.23±4.00*# 24.68±11.46*#F 值 0.15 0.42 0.08 24.00 19.53 4.08 P 值 0.86 0.66 0.92 ＜0.001 ＜0.001 0.04

2.4 大鼠腦組織HE 染色結(jié)果

造模后第14 天、第21 天、第28 天，HE 染色結(jié)果可見DEACMP 組海馬CA3 區(qū)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)消失，胞核出現(xiàn)固縮變形、溶解、碎裂，取而代之是被蘇木精藍(lán)色深染、變形的陽性細(xì)胞。DEACMP 組的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與空白組、空氣組比較，在造模前、造模后第1 天、第7天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而在造模后第14 天、第21 天、第28 天均多于空白組、空氣組（P均＜0.05），空白組和空氣組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3、圖2。

表3 DEACMP 大鼠造模前后不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA3 區(qū)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，個(gè)）

表3 DEACMP 大鼠造模前后不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA3 區(qū)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，個(gè)）

與空白組比較*P＜0.05；與空氣組比較#P＜0.05；

組別 n 造模前 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天空白組 6 25.57±2.98 25.36±1.77 25.82±1.53 26.64±1.41 26.91±1.76 27.07±1.44空氣組 6 26.27±2.55 26.91±1.86 25.82±1.49 27.33±1.14 25.60±2.83 26.78±1.32 DEACMP 組 6 26.82±2.25 26.22±1.45 25.82±2.46 83.41±14.20*# 70.25±16.50*# 63.88±7.48*#F 值 0.35 1.25 0.88 92.13 40.61 137.17 P 值 0.71 0.31 0.44 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 相關(guān)性分析

對(duì)DEACMP 組染毒前后不同時(shí)間點(diǎn)的平均潛伏期與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.915，

P＜0.001）。

3 討論

目前制備DEACMP 模型的常用方法有腹腔注射法和吸入法兩種方法，雖然有大量研究在比較兩種造模方式優(yōu)缺點(diǎn)[5]，但是DEACMP 造模的成功率不高[6]，怎么能篩選出可靠的DEACMP 模型是實(shí)驗(yàn)中常見的問題，目前關(guān)于此方面的研究少，Morris 水迷宮是評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)和記憶功能的常規(guī)工具[7]，并被廣泛用于評(píng)估嚙齒動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶[8]。本實(shí)驗(yàn)通過定位航行實(shí)驗(yàn)來探討CO 中毒后對(duì)大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

Morris 水迷宮檢驗(yàn)常用方法是干預(yù)后先進(jìn)行5 d 水迷宮訓(xùn)練，第6 天測(cè)試[9]，收集平均潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)等經(jīng)典指標(biāo)分析。李勇軍等[3]用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP 大鼠模型，選取造模后3 周的這一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行Morris 的訓(xùn)練測(cè)試。對(duì)于遲發(fā)性腦病單獨(dú)取某個(gè)時(shí)間段行水迷宮實(shí)驗(yàn)，只能評(píng)價(jià)這一時(shí)間段CO 中毒后是否發(fā)生DEACMP，不能反應(yīng)中毒后28 d 內(nèi)DEACMP 發(fā)生情況。本實(shí)驗(yàn)在中毒后28 d 內(nèi)，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選模型是可以連續(xù)動(dòng)態(tài)測(cè)定實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，同時(shí)可以預(yù)判DEACMP 易出現(xiàn)的時(shí)間段，為探討其治療時(shí)機(jī)和療程提供一定的依據(jù)。但是Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)屬于檢測(cè)認(rèn)知功能的行為學(xué)方法，初步篩選的模型存在假陽性和假陰性的可能，所以需要在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證模型[10]。DEACMP 的腦損傷廣泛，典型表現(xiàn)是在大腦白質(zhì)的廣泛脫髓鞘改變[11]，而在基底節(jié)區(qū)、海馬區(qū)錐體細(xì)胞及小腦神經(jīng)元出現(xiàn)變性壞死等是最常見的病理改變[12]。海馬是參與空間學(xué)習(xí)和記憶的主要解剖結(jié)構(gòu)[13-14]。Wagatsuma 等[15]研究顯示海馬CA3 區(qū)在海馬中形成持久性記憶至關(guān)重要。De Bruyckere 等[16]研究表明海馬苔蘚纖維突觸將齒狀顆粒細(xì)胞連接到CA3 區(qū)神經(jīng)元，并且對(duì)于空間記憶形成和鞏固是重要的。所以統(tǒng)計(jì)海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元變性壞死的計(jì)數(shù)，可進(jìn)一步驗(yàn)證模型。Lin 等[17]和Tabrizian 等[18]用Morris 水迷宮測(cè)試海馬在空間學(xué)習(xí)和記憶方面的作用。觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的變性壞死可以直接反應(yīng)急性CO 中毒后的腦損傷情況，我們采用HE 染色，觀察干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元變性壞死，來證明CO 中毒對(duì)大鼠腦神經(jīng)的損傷。

本實(shí)驗(yàn)從采用腹腔注射染毒，按照劉勇林等[19]研究，使HbCO 濃度大于50%，持續(xù)16 h 以上，從而達(dá)到中-重度CO 中毒的標(biāo)準(zhǔn)，提高造模的成功率。本實(shí)驗(yàn)觀察從造模后第14 天開始，DEACMP 組的平均潛伏期、陽性細(xì)胞數(shù)與空白組、空氣組對(duì)比升高，說明從急性CO 中毒后第14天開始，大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶開始出現(xiàn)有損傷表現(xiàn)，海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元開始出現(xiàn)變性壞死，提示大鼠急性CO 中毒后14 天可能為DEACMP 的好發(fā)時(shí)間段，與張曉莉等[2]在急性DEACMP 大鼠模型的建立及其表型評(píng)價(jià)中的結(jié)論基本相符，為探討DEACMP 發(fā)病機(jī)制及治療時(shí)機(jī)提供依據(jù)。Tabrizian 等[20]和彭璇等[21]通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)海馬在空間記憶獲取的行為能力。對(duì)DEACMP 組的平均潛伏期與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行直線相關(guān)分析顯示，平均潛伏期和陽性細(xì)胞數(shù)之間存在正相關(guān)，提示在急性CO 中毒后觀察的28 d 內(nèi)，Morris 水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)DEACMP 大鼠認(rèn)知功能的可靠方法。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行和空間探索兩部分，單用定位航行實(shí)驗(yàn)可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)又可以準(zhǔn)確反應(yīng)DEACMP大鼠認(rèn)知功能的改變。

在本實(shí)驗(yàn)過程中Morris 水迷宮結(jié)果也受到多方面的影響，要注意Morris 水迷宮的操作規(guī)范[22]，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠，總結(jié)本實(shí)驗(yàn)操作過程中的注意事項(xiàng)及解決方法：（1）泳池內(nèi)水溫，溫度計(jì)測(cè)量泳池內(nèi)的水溫保證在（20±1）℃[23]。（2）每次訓(xùn)練測(cè)試前，通過視頻軟件固定平臺(tái)的坐標(biāo)位置，保證平臺(tái)的位置固定，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)視頻監(jiān)控下平臺(tái)位置不能顯現(xiàn)，避免影響老鼠的空間記憶，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本研究表明在造模前后不同時(shí)間段，Morris 水迷宮的定位航行試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)易的檢測(cè)DEACMP 大鼠認(rèn)知功能的可靠方法；通過篩選DEACMP 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)在染毒后7～14 d開始有行為學(xué)和病理學(xué)改變，尤其以急性CO 中毒后第14 天最明顯，可能是DEACMP 的顱腦損傷最嚴(yán)重的時(shí)間段，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。篩選出成功的DEACMP 模型是探討其發(fā)病機(jī)制及治療方法的基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)一步采用多種行為學(xué)檢測(cè)方法和大腦白質(zhì)的廣泛脫髓鞘等指標(biāo)來檢測(cè)大鼠腦神經(jīng)的損傷程度。