乳腺腫瘤中hsa_circ_0005777 表達及其臨床意義

李曉菡， 馬 芳， 張 旭， 納 莉， 田進海， 王立斌

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，生物芯片中心，銀川 750004）

乳腺癌（breast cancer）是一種女性常見的惡性腫瘤，嚴重危害女性健康[1]。目前臨床對乳腺癌的治療主要通過手術、放療、化療等方式，但患者生存率及預后效果難以保證[2]。乳腺癌生物標志物的檢測對輔助臨床診斷和預后判斷具有重要意義，目前臨床常用糖類抗原153（carbohydrate antigen 15-3，CA153）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為乳腺癌診斷、轉移及預后的生物標志物。CEA 對乳腺癌的診斷敏感性為40%，CA153 對早期乳腺癌的敏感性為60%，晚期敏感性為80%。CA153 在乳腺癌術前檢測的總陽性率約為27.5%～65.9%，轉移性乳腺癌的陽性率約為80%[3-4]。雖然CEA 及CA153 檢測對乳腺癌臨床診斷具有指導意義，但因其靈敏度低、特異度不強等原因，限制了它們的診斷價值。篩選乳腺癌的新的分子標志物，對乳腺腫瘤早期篩查及預后治療具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共價鍵形成環(huán)形結構的非編碼RNA 分子[5]。circRNA廣泛存在于不同物種中，不僅在生物體內含量豐富，而且具有組織特異性，在組織、血液和外泌體中都有穩(wěn)定表達。circRNA 能夠通過調節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、血管形成、代謝以及耐藥等功能來參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，這使得circRNA 成為腫瘤診斷、治療和預后追蹤的理想生物標志物[6]。Xuan 等[7]通過對喉鱗狀細胞癌組織芯片分析，發(fā)現(xiàn)有698 個circRNAs 下調，其中hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 與 腫 瘤T3-4 階段和分化不良有關，認為hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 可以作為診斷喉癌的潛在分子標志物。Li 等[8]通過分析術前和術后胃癌患者的36 對血漿樣品，篩選并驗證了hsa_circ_002059 與胃癌發(fā)生的關系，明確hsa_circ_002059 可作為診斷胃癌穩(wěn)定分子標志物。Coscujuela 等[9]發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤細胞MCF-7中有circRNA 的特異表達，并且這些差異表達的circRNA 可以作為區(qū)分Luminal 與其他乳腺腫瘤亞型的依據，表明circRNA 具備成為乳腺癌分子標記物和藥物靶標的潛力。

本研究通過人環(huán)狀RNA 表達譜芯片篩選乳腺癌癌旁組織與乳腺癌組織中差異表達的circRNA，經過顯著性篩選、基因功能注釋、靶基因預測、生物學功能富集和排除，確定了hsa_circ_0005777 作為研究對象，進一步研究其在乳腺癌組織和患者血液中的表達情況，分析和評價hsa_circ_0005777 與乳腺癌臨床特征的相關性，探討其在乳腺癌臨床診斷中的價值，為明確hsa_circ_0005777 作為分子標志物在乳腺癌診療中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016 年10 月—2017 年3 月收住于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤外科的乳腺癌患者的術后癌組織和癌旁組織標本23 對，血液樣本40 例，以40 例健康體檢人群血液樣本作為對照。研究過程獲得寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或其家屬均簽署知情同意書?；颊呒{入標準為：（1）女性；（2）乳腺癌的病理診斷；（3）無既往癌癥病史；（4）無艾滋/艾滋病病毒感染；（5）接受乳房切除術；（6）患者術前均無放療或化療史；（7）無合并其他腫瘤；（8）臨床信息完整。

1.2 樣本及臨床信息采集

收集乳房切除術后乳腺癌病變和離腫瘤邊緣＞5 cm 處正常組織，置于液氮中，立即轉入實驗室提取RNA。收集所有患者基本信息、臨床特征、入院檢驗結果等，包括：（1）基本信息：患者的年齡、性別、住院號、手術時間和方式等，其中患者年齡34～67 歲，平均（50.9±8.1）歲；（2）患者病理診斷和分型；（3）患者的臨床特征：腫瘤大小、是否轉移、腫瘤TNM 分期、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、抗原Ki-67 等臨床指標，依據美國癌癥聯(lián)合委員會對惡性腫瘤分期系統(tǒng)的分類確定患者的腫瘤分期[10]；（4）血清檢驗結果：血常規(guī)、糖類抗原125（CA125）、CA153、糖類抗原199（CA199）、CEA 等腫瘤標志物指標。

1.3 RNA 提取及反轉錄

使用TRIzol 法（美國Thermo Fisher Scientifc 公司）從組織中提取總RNA，然后通過GoScript 反轉錄（RT）系統(tǒng)（美國Promega 公司）將RNA 反轉錄為cDNA。使用外周血液樣品的總RNA 快速提取試劑盒（中國Bioteke 公司）從血液中提取總RNA并通過GoScript 反轉錄（RT）系統(tǒng)將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄體系為：1μL 總RNA（約500 ng），1μL random primer，10 μL ddH2O，2 μL dNTP，4 μL反轉錄buffer，1 μL RNA 酶抑制劑，1 μL 反轉錄酶，總體積20 μL；反應條件為：25℃5 min；42℃60 min，70℃5 min。RNA 及cDNA 置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 circRNA 芯片分析

選取三對乳腺癌和癌旁組織樣品RNA，利用人circRNA 表達譜芯片（Human cirRNA array rersion2.0，北京博奧生物有限公司）檢測樣品中circRNA 表達情況，該芯片覆蓋162351 條已知circRNA 的探針。應用Feature Extraction 軟件（北京博奧生物有限公司）提取芯片數(shù)據，Cluster 3.0 軟件進行聚類分析，GeneSpring13.0（安捷倫科技有限公司）分析差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）、熒光值等。初步過濾和質控去除檢測結果中不達標部分，剩余數(shù)據進行篩選，篩選條件：FC≥4，P＜0.05，熒光值≥100。

1.5 qRT-PCR 檢測hsa_circ_0005777 在乳腺癌組織及癌旁組織的水平表達差異

將提取好的乳腺癌組織和血液樣本的cDNA使用LightCycler480II 定量平臺（美國Roche 公司）以β-actin 為內參進行實時熒光定量PCR 實驗（qRT-PCR）。hsa_circ_0005777 引物：Forward-CA TCTAAAGAAAAGAAGGTTGGTGA，Reverse-GGC TGGTAGTGGCAGTGATT；β-actin 引物： Forward-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC，Reverse-GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA。反應體系為：以2 μL cDNA 作為模板，分別加入上、下游引物各0.8 μL，6.4 μL ddH2O 和10 μL SYBR MIX，總體積20 μL；qRT-PCR 條件為：在95 ℃下初始變性步驟10 min；然后在95 ℃下進行40 個循環(huán)15 s，60℃30 s，95 ℃5s，65 ℃2 min，在0.11 ℃/s 下升溫至97 ℃以測量熒光信號。記錄hsa_circ_0005777 和β-actin 的循環(huán)閾值（Ct）值。通過2-ΔΔCt方法分析計算基因的相對表達量[11]。所有樣品進行3 次重復實驗。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗以及單因素方差分析；計數(shù)資料采用雙變量Spearman 相關性檢驗；對單項及聯(lián)合檢測結果作圖繪制成ROC 曲線，計算曲線下面積（AUC）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中的circRNA 表達譜芯片分析

乳腺癌及癌旁組織間存在大量差異表達的circRNA（圖1A、B）。通過篩選，并進行腫瘤的相關性預測后，選擇在乳腺癌中顯著下調的hsa_circ_0005777 作為研究目標，其序列具有特異性（圖1C）。

2.2 hsa_circ_0005777 在乳腺癌中的表達

通過qRT-PCR 測定hsa_circ_0005777 在23對乳腺癌組織及癌旁組織中的相對表達，驗證篩選結果。結果顯示，與癌旁組織相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌組織中表達下調（P＜0.01），下調倍數(shù)約為4.683 倍（圖2A）。ROC 曲線分析結果顯示，hsa_circ_0005777 在23 對乳腺癌患者組織中的AUC 為0.983（P＜0.01），截斷值為12.07，靈敏度為95.7%，特異度為95.7%（圖2B）。hsa_circ_0005777 與CEA 協(xié)同診斷乳腺癌的AUC 為0.952（P＜0.05），截斷值為12.38，靈敏度為90.5%，特異度為100%（圖2C）。

2.3 hsa_circ_0005777 的表達與乳腺癌患者臨床病理指標的關系

hsa_circ_0005777 乳腺癌組織circRNA 檢測值在CEA、腫瘤是否轉移、PR、Ki-67、TNM 分期、臨床早晚分期等臨床指標中差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），在腫瘤大小、CA153、HER2、ER、AR、病理類型中差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）（表1）。

2.4 hsa_circ_0005777 與乳腺癌中臨床病理指標的相關性分析

hsa_circ_0005777 與CEA 表達呈負相關（r=-0.466，P=0.025）。

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同臨床病理指標中的分布（±s）

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同臨床病理指標中的分布（±s）

注：CA153 陽性的界限值為25 U·mL-1；CEA 陽性的界限值為5.2 ng·mL-1

臨床病理指標 n 癌組織circRNA 檢測值 t/F 值 P 值CA153 1.103 0.282陽性 2 14.21000±1.11723陰性 21 13.40900±0.97378 CEA -2.388 0.026陽性 2 12.03500±1.05359陰性 21 13.61620±0.88625腫瘤大小/cm 0.689 0.499＜2 14 13.32640±0.76085≥2 9 13.71560±1.27620腫瘤是否轉移 2.813 0.010是12 13.96170±0.95665否11 12.95180±0.73924 HER2 -0.898 0.380陽性 13 13.31620±1.05563陰性 10 13.69000±0.89581 ER 0.330 0.745陽性 20 13.50550±1.04627陰性 3 13.30000±0.48754 PR 2.513 0.020陽性 13 13.88540±0.98872陰性 10 12.95000±0.72329 AR 0.433 0.670陽性 21 13.50670±1.01979陰性 2 13.18500±0.62933 Ki-67/% 2.845 0.010＜14 9 12.84440±1.05652≥14 14 13.88640±0.70747 TNM 分期 3.698 0.043 I 8 13.25250±0.67875 II 9 13.12110±0.99462 III 6 14.31670±0.94574臨床分期 -2.281 0.033早期（I-II） 17 13.25220±0.86368中晚期（III-IV） 6 14.29400±1.05555病理類型 1.272 0.302非浸潤性癌 4 12.77750±1.08312浸潤性特殊型癌 2 13.64060±0.92669浸潤性非特殊型癌 17 13.50500±1.30815

2.5 hsa_circ_0005777 作為乳腺癌分期分型的臨床標志物研究

hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌Luminal 分型、HER2、ER、PR、AR 陽性以及乳腺癌早晚分期，AUC 分別為0.518、0.600、0.567、0.568、0.596、0.789（P＞0.05）（圖3A～F）；hsa_circ_0005777 診斷Ki-67 陽性率的靈敏度為85.7%，特異度為77.8%（AUC=0.817，P=0.012，截斷值=13.38）（圖3G）；hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌是否轉移的靈敏度為75.0%，特異度為81.8%（AUC=0.795，P=0.016，截斷值=13.54）（圖3H）。

2.6 hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者血液中的表達

通過qRT-PCR 法測定hsa_circ_0005777 在健康人群血液和乳腺癌患者血液中的表達。結果顯示，與健康人群相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者的外周血中表達下降（圖4A）?；赗OC曲線分析，hsa_circ_0005777 的AUC 為0.835（P＜0.01），截斷值為14.43，靈敏度為80.0%，特異度為72.5%（圖4B）。

3 討論

circRNAs 是一類特殊的非編碼RNA，廣泛存在于生物體內，不易被核酸外切酶降解，與線性RNA 相比能更穩(wěn)定地存在于生物體內[12]。circRNA 不僅含量豐富，而且在不同組織及發(fā)育階段都有特異性表達，這使得circRNA 成為疾病診斷、治療和預后追蹤的理想生物標志物[13]。研究證實，circRNAs 與不同腫瘤的發(fā)生緊密相關，在乳腺腫瘤研究中，Lü 等[14]報道hsa_circ_103110、hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821 在乳腺癌組織中表達水平升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和hsa_circ_406697 在乳腺癌組織中低表達，說明在乳腺腫瘤發(fā)生過程中，存在差異性表達的circRNA。Nair 等[15]通過Circ-Seq 篩查乳腺癌和癌旁組織中circRNA 表達，發(fā)現(xiàn)雌激素受體陽性（ER+）亞型中的circRNA 數(shù)量與增殖基因的復發(fā)風險評分呈負相關，提示circRNA 可能與乳腺細胞增殖復發(fā)有關。Yin 等[16]從5 例乳腺癌和配對的健康志愿者血漿樣本中篩選差異表達的circRNA，通過q-RT-PCR 驗證候選circRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785 與腫瘤患者TNM 分期和遠處轉移密切相關，且比其他circRNA 具有更好的診斷價值，由此確定血液hsa_circ_0001785可作為乳腺腫瘤患者診斷的潛在生物標志物。

hsa_circ_0005777 定位于人類5 號染色體正義鏈73136304-73136585 區(qū)域，全長281bp，由ARHGEF28 基因外顯子（exon）11 區(qū)剪切環(huán)化而成。hsa_circ_0005777 最早由Jeck 等[17]在男性正常龜頭細胞（HS68）中發(fā)現(xiàn)，驗證其為環(huán)狀RNA，并且在體內比相關的線性mRNA 更穩(wěn)定。研究表明，hsa_circ_0005777 的靶基因ARHGEF28（Rgnef）可以通過與黏著斑激酶的相互作用促進結腸腫瘤增殖，推測hsa_circ_0005777 可能與結腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關[18]。但目前尚未見到有關hsa_circ_0005777 與乳腺腫瘤的文獻報道，本研究首次報道hsa_circ_0005777 與乳腺癌的臨床特征相關性及其臨床診斷價值。

本研究中，首先選取乳腺癌和癌旁組織進行circRNA 芯片分析，通過對芯片檢測結果的聚類分析及差異化篩選，并進行腫瘤的相關性預測后，選擇在乳腺癌組織中下調的hsa_circ_0005777作為研究目標。擴大樣本量進行qRT-PCR 驗證結果顯示，與癌旁組織比較，hsa_circ_0005777 在23對乳腺癌組織中表達下調。 hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌早期診斷的靈敏度為95.7%，特異度為95.7%，AUC 為0.983，截斷值為12.07。乳腺癌患者中CEA 與CA153 的聯(lián)用可以增加監(jiān)測乳腺癌診斷的靈敏度[19]，而hsa_circ_0005777 與CEA 水平相關可說明其作為新的腫瘤標志物的可能性，提高臨床檢出率。將hsa_circ_0005777 與CEA 進行協(xié)同ROC 曲線分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷能夠明顯提升診斷的特異度。因此，hsa_circ_0005777 與CEA 的聯(lián)合檢測可為乳腺癌的早期診斷及篩查提供更加可靠的依據，為乳腺癌患者贏得更多的生存機會。

本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005777 與CEA 呈負相關，并且發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌轉移的診斷中具有一定的靈敏度和特異度。說明hsa_circ_0005777 對乳腺癌術后復發(fā)轉移有一定的預測意義，可避免影像學檢查可能出現(xiàn)的漏診情況，從而作為乳腺癌轉移的輔助診斷指標，這與Valenzuela等[20]報道結果一致，表明hsa_circ_0005777 與乳腺癌的擴散有密切關系。ER、PR 的檢測有利于治療方案的選擇，只有受體陽性才適合內分泌治療，而hsa_circ_0005777 與PR 陽性水平相關，提示其可作為乳腺癌分型的輔助診斷。Ki-67 在靜息細胞中的缺失和分裂細胞中的廣泛存在使其成為細胞增殖的標志物，與證實其與乳腺癌的惡性程度呈正相關[21]。本研究通過ROC 曲線分析hsa_circ_0005777 與Ki-67 對乳腺腫瘤轉移診斷的靈敏度和特異度，提示hsa_circ_0005777 可能與乳腺腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力密切相關，對乳腺癌的診斷及預后的判斷有著重要的參考價值。

綜上所述，hsa_circ_0005777 在乳腺腫瘤患者組織和血液中低表達，并與乳腺腫瘤病理分期、分型以及腫瘤增殖和淋巴結轉移相關性較大，可以作為評估乳腺腫瘤發(fā)生的一個潛在的生物標志物。