真菌毒素免疫親和柱的制備與評價

金曉林 張東升

[摘要]免疫親和凈化（IAC）是以免疫結(jié)合反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的純化和富集技術(shù)。IAC在食品安全、農(nóng)業(yè)和生化等中的研究與應(yīng)用已被色譜工作者接受和認(rèn)同，展示了廣闊的發(fā)展前景。本文旨在全面介紹IAC的工作原理、制備方法、評價指標(biāo)，重點(diǎn)綜述了IAC在真菌毒素分析領(lǐng)域的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]免疫親和;真菌毒素;制備;評價

中圖分類號：TS207.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202002

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種真菌毒素，其中污染較嚴(yán)重的主要包括黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素（Ochratoxin A，OTA）及伏馬菌素（Fomonisin，F(xiàn)B）等[1]。2017年百奧明公司的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)[2]，超過75%的樣本被檢出兩種或更多的真菌毒素，其中ZEN、DON及FB的陽性率均超過了50%，DON污染濃度最高。當(dāng)各種真菌毒素在農(nóng)產(chǎn)品中同時出現(xiàn)，存在毒性加和或者疊加效應(yīng)[3]，對健康的威脅系數(shù)增大，因此有必要對多種真菌毒素同時進(jìn)行檢測。

國內(nèi)外真菌毒素常用的儀器分析方法主要為免疫親和層析（Immuno-affinity Column，IAC）結(jié)合液相色譜法（liquid chromatography，LC）及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）檢測[4-5]等。與固相萃取柱（SPE）相比，IAC具有溶劑用量少、操作簡便、特異性高、凈化徹底等優(yōu)點(diǎn)，這對于提高HPLC和LC-MS的檢出限、消除背景干擾是非常必要的。針對生物毒素小分子凈化和富集的IAC柱在國內(nèi)外已經(jīng)得到商品化并廣泛應(yīng)用[6]。本文在介紹IAC的工作原理、載體活化、抗體制備及偶聯(lián)方式的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡述了IAC質(zhì)量評價的必要性及評價要點(diǎn)。

1 免疫親和層析

1.1 原理及優(yōu)勢

IAC是利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合特性的親和層析技術(shù)，將抗體與惰性載體共價結(jié)合物填入柱中制成的凈化色譜小柱。IAC系統(tǒng)存在三個要素：目標(biāo)物、抗體和惰性載體。當(dāng)含目標(biāo)物的樣本提取液通過IAC柱時，固定于惰性載體上的抗體選擇性地結(jié)合目標(biāo)物，雜質(zhì)流出，進(jìn)一步洗滌除雜后將復(fù)合物解離，目標(biāo)物被洗脫，樣本得到凈化。因抗體是其核心試劑，樣品的免疫凈化又稱抗體介導(dǎo)的凈化。其工作原理如圖1所示 。

IAC較常規(guī)的SPE有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）IAC中抗體對目標(biāo)物的高度選擇性使樣本前處理過程簡化，分析質(zhì)量得到改善。避免了反復(fù)萃取和濃縮，回收率高。（2）對目標(biāo)物具有高效保留能力。在IAC柱容量范圍內(nèi)，IAC對于目標(biāo)物的保留能力和凈化能力不受樣本體積和目標(biāo)物濃度的影響。（3）多殘留分析能力。固定有多種抗體或者簇特異性抗體的IAC柱可對多種目標(biāo)物進(jìn)行凈化。（4）水相操作且IAC柱可重復(fù)使用，能夠節(jié)約有機(jī)溶劑，保護(hù)環(huán)境。

1.2 載體分類及活化

IAC柱的絕大部分空間為載體基質(zhì)所占據(jù)，其影響不可忽視。理想的基質(zhì)必須既有優(yōu)良的色譜性能，又能滿足IAC的特殊要求[7]，如高度的親水性但不溶于水，適度的剛性、惰性、無非特異性吸附或者非常低，理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有大量可供偶聯(lián)的活性基團(tuán)，疏松多孔結(jié)構(gòu)，耐受酸、醇等洗脫作用。實(shí)際應(yīng)用中的載體基質(zhì)通常分為耐受低壓的多糖類物質(zhì)及耐受高壓的聚合材料。多糖類物質(zhì)除瓊脂糖還有纖維素[8]等。代表性聚合材料有聚丙烯酰胺[9]、硅膠[10]等。纖維素及玻璃珠因非特異性吸附高使用受到一定的限制。

多糖基質(zhì)的活化在IAC制備中占有重要位置。通常在骨架上引入強(qiáng)親電基團(tuán)，然后與抗體上的親核基團(tuán)如-NH2、-OH、-SH等發(fā)生取代反應(yīng)，使抗體連接于載體上。如果需要使抗體通過間隔臂與基質(zhì)連接，除可以選擇適宜的活化試劑外，也可以首先將間隔臂（如SMCC）[11]與基質(zhì)連接，再將抗體與間隔臂的活性基團(tuán)偶聯(lián)。常用的載體活化方式包括溴化氰活化（CNBr）[12]、碳酰二咪唑法（CDI）[13]等。

1.3 抗體的制備

依據(jù)抗體的來源可分為單克隆抗體（McAbs）和多克隆抗體（PcAbs），通過單克隆抗體生產(chǎn)途徑不同又可以分為體內(nèi)和體外，具體區(qū)別如表1所示?，F(xiàn)階段制備真菌毒素McAbs的主要途徑依然是小鼠腹腔注射細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，受動物福利及抗體質(zhì)量影響，細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)單抗具有極大的發(fā)展空間[14]。

McAbs在建立IAC具有較多的優(yōu)越性。其一，具有高度均一的親和性和選擇性，純化后的單抗易于制備高容量的IAC柱。其二，制備IAC需要消耗大量的純化抗體，如1支典型的DON-IAC柱所需要的抗體近乎1～2mg[15]，雜交瘤技術(shù)的建立，可源源不斷地提供性能均一的McAbs。其三，作為凈化手段的IAC，具有交叉反應(yīng)的單抗適宜制備處理多殘留組分的Multi-IAC。綜合各種因素，一般認(rèn)為McAbs的突出優(yōu)勢是高度均一性，生產(chǎn)成本低，適于商業(yè)生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。

1.4 偶聯(lián)方式

使固定化的抗體維持高密度、高活性是制備一次性、大容量、低成本IAC柱的關(guān)鍵。但是，當(dāng)抗體被固定在載體表面時，其活性通常比溶液中要低，活性降低的主要原因在于：一是高密度造成抗體分子的空間位阻;二是載體表面抗體的隨機(jī)偶聯(lián)。因此，抗體高度定向化的方法被陸續(xù)開發(fā)出來，主要有3種形式，如表2所示，其中通過蛋白結(jié)合單抗固定化應(yīng)用最為廣泛，但因同源交聯(lián)劑無選擇性反應(yīng)而導(dǎo)致抗原結(jié)合域修飾，是其最大缺陷。

2 質(zhì)量評價

IAC作為生化類產(chǎn)品，在分析領(lǐng)域逐步被推廣應(yīng)用，商業(yè)化的步伐加快，市場潛力巨大，至今國內(nèi)外尚無商品化的免疫親和柱質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范。產(chǎn)品生產(chǎn)、使用及評價體制尚不完善，其性能和質(zhì)量控制尚不能滿足檢測需要。為了把好產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)，促進(jìn)我國生化檢測產(chǎn)業(yè)健康、有序地發(fā)展，急需建立一個關(guān)于IAC產(chǎn)品質(zhì)量的指導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 評價的必要性

（1）IAC已作為食品安全相關(guān)國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中的關(guān)鍵生化試劑材料，應(yīng)強(qiáng)化質(zhì)量控制管理。目前已有專門針對抗生素[20-21]、農(nóng)藥[22]和真菌毒素[23-26]等的各類免疫親和柱產(chǎn)品，尤其真菌毒素類親和柱種類最為齊全。經(jīng)檢索采用IAC作為凈化手段的測定方法標(biāo)準(zhǔn)共有20項(xiàng)，其中國家標(biāo)準(zhǔn)18項(xiàng)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)，其質(zhì)量直接影響我國食品安全監(jiān)測和第三方檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

（2）IAC產(chǎn)品技術(shù)性能指標(biāo)不統(tǒng)一、不規(guī)范。目前，IAC生產(chǎn)企業(yè)要為每一種IAC產(chǎn)品制定標(biāo)準(zhǔn)，且各類標(biāo)準(zhǔn)存在如下問題：一是同一企業(yè)、不同品種的標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)容僅是冠名的簡單替換;二是不同企業(yè)IAC的制備方法不一致，在柱容量、非特異性吸附、柱空白等關(guān)鍵指標(biāo)差異大，導(dǎo)致假陰/陽性測定結(jié)果;三是不同企業(yè)對IAC產(chǎn)品的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)要求不一，產(chǎn)品市場混亂，檢測單位無所適從，難以選擇。

2.2 評價內(nèi)容

2.2.1 建立原料質(zhì)量的評價體系

（1）對于單抗的質(zhì)量指標(biāo)主要有親和常數(shù)和交叉反應(yīng)率。①抗體的親和性（affinity）是抗體與半抗原間結(jié)合強(qiáng)度的量度，一般用結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)平衡常數(shù)（Ka），又稱親和常數(shù)、結(jié)合常數(shù)，單位L/moL。Ka值越高，結(jié)合能力越強(qiáng)，一般抗原抗體反應(yīng)的Ka值為106～1 012L/mol。②抗體的選擇性或稱特異性（specificity）是抗體對待測物的識別能力，是評價抗體與待測物間結(jié)合反應(yīng)的專一性和對結(jié)構(gòu)相近或相關(guān)物質(zhì)的區(qū)分能力。在多數(shù)的免疫分析中對抗體的特異性有嚴(yán)格的要求，而單一IAC對于抗體的特異性沒有完全的排他性，多組分IAC抗體及組合抗體對于類似物的交叉反應(yīng)有一定的最低要求[27]。

（2）載體的粒徑直接決定了樣本的流速，載體的非特異性吸附率決定了洗脫率，這兩個指標(biāo)對于IAC的處理時間和回收率至關(guān)重要。同時載體的粒徑也影響蛋白的結(jié)合能力，易建科[28]研究發(fā)現(xiàn)200目的氨基硅膠微球受比表面積大，單位體積內(nèi)的活性基團(tuán)多的原因，結(jié)合蛋白的能力比100目的微球大，對于制備大柱容量的IAC非常有益。①半抗原和抗體的初級結(jié)合反應(yīng)可以在瞬間完成，一般IAC對于加樣流速要求并不嚴(yán)格，0.5～3.0mL/min均有應(yīng)用，一般常用的瓊脂糖載體粒徑為90?m，1mL層析小柱的尺寸徑高比為0.55（同樣凝膠體積為0.25mL時，3mL的層析柱徑高比為1.78），徑高比越大，重力流速越快。②載體非特異性吸附率是除抗體外對IAC質(zhì)量影響最大的因素。多數(shù)活化與偶聯(lián)過程引入的陰離子交換基團(tuán)或陽離子交換基團(tuán)成為非特異性吸附的重要來源。當(dāng)親和柱被過量上樣時，樣品中的待測物除可與特異性抗體結(jié)合外，還可與瓊脂糖基質(zhì)或雜蛋白發(fā)生非特異性吸附作用，通常用非特異性吸附率來表示，因?yàn)闊o法在親和柱上直接測量待測物的非特異性吸附量，所以制備未偶聯(lián)特異性單抗的瓊脂糖凝膠柱（以下簡稱blank柱）對待測物的吸附作用，以非特異性吸附率來表示[29]。一般要求基質(zhì)非特異性吸附率低于5%。

2.2.2 建立技術(shù)性能的評價體系

（1）柱空白，指商品化免疫親和柱含分析物的含量，理應(yīng)為0。董曼佳[30]等在制備DON及其乙?；H和柱時發(fā)現(xiàn)了空白柱含有一定的DON，研究發(fā)現(xiàn)其來自原料單抗，文獻(xiàn)表明通過飼喂含有一定低劑量的真菌毒素飼料，其衍生物及本身會殘留在動物的血液及組織液中，而腹腔中大量的抗體更是結(jié)合抗原最好的場所。

（2）柱體積，因IAC具有高效保留能力，所以IAC均采用較小的柱床體積，節(jié)約成本和減小非特異性吸附，通常不超過0.5mL;通常3～5倍柱體積的純有機(jī)溶劑即可將待測物完全洗脫。

（3）柱容量，每毫升免疫吸附劑對分析物的最大吸附量（ng/mL），也稱動態(tài)柱容量。動態(tài)柱容量與柱內(nèi)免疫吸附劑體積的乘積即為單支柱最大吸附量（ng）。測定方法可通過超過理論容量的待測物使IAC柱飽和，經(jīng)洗滌和洗脫后測定。為避免IAC樣本超載而出現(xiàn)待測物流穿現(xiàn)象，需根據(jù)柱容量進(jìn)行設(shè)計待測物的處理量。

（4）柱回收率，也稱柱效，含分析物的基質(zhì)提取液，被IAC吸附與解吸的過程，通過檢測分析物的回收率來表示親和柱對分析物捕獲能力。該回收率不含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取效率，僅反映的是樣本基質(zhì)對免疫結(jié)合反應(yīng)的抑制效應(yīng)，通過國標(biāo)[31-32]可以推測理想柱效在90%～110%。

（5）柱穩(wěn)定性，是指計量特性隨時間不變化的能力，可以用計量特性隨時間變化的關(guān)系來進(jìn)行定量表征。選取3個不同批次適量的IAC柱，置37℃恒溫加速試驗(yàn)1個月，測定柱容量及柱回收以評價穩(wěn)定性[33]。

2.2.3 操作條件的標(biāo)準(zhǔn)化

（1）抗體抗原的最適反應(yīng)溫度是37℃，從冰箱中取出的IAC需平衡至室溫25℃左右或室溫下的緩沖液快速淋洗IAC，是確保其抗體免疫活性的重要措施。

（2）因不同的抗體耐受有機(jī)溶劑的濃度[34]和耐受酸堿的能力各不相同，所以上樣緩沖液、沖洗液工作時的標(biāo)準(zhǔn)pH值一般使用具有緩沖能力的磷酸鹽緩沖液，pH 值為7.0～7.4。

（3）淋洗液或者上樣的有機(jī)相的濃度如甲醇一般不超過20%，乙腈不超過10%。

（4）過高的離子強(qiáng)度（NaCl>0.5mol/L ）可能促使抗原抗體復(fù)合物的解離。

3 問題與展望

3.1 存在問題

傳統(tǒng)IAC柱應(yīng)用十多年來，問題依然存在，主要表現(xiàn)：（1）成本高。為避免重復(fù)使用和加快分析速度，一次性IAC柱成為趨勢。（2）浪費(fèi)大。國內(nèi)外多采用溴化氰活化的瓊脂糖為載體將抗體分子隨機(jī)的固定在層析介質(zhì)上，抗體的結(jié)合能力下降，造成抗體分子被低效利用。（3）產(chǎn)品不穩(wěn)定、回收率高。國內(nèi)外多通過小鼠腹腔誘導(dǎo)抗體，單位產(chǎn)量低，批間存在較大的差異，存在抗原污染的風(fēng)險。（4）雖然產(chǎn)業(yè)化快，但是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)滯后。國內(nèi)IAC的研發(fā)起步較晚，但發(fā)展迅速，基本改變依賴國外進(jìn)口的局面。已出臺的多項(xiàng)采用IAC凈化的測定方法標(biāo)準(zhǔn)，雖然對IAC已有一些質(zhì)量要求諸如柱容量、回收率，但不系統(tǒng)、不全面。

3.2 展望

標(biāo)準(zhǔn)化單克隆抗體生產(chǎn)和供應(yīng)依然是IAC真正實(shí)現(xiàn)一次性IAC柱的前提;優(yōu)化載體活化方法、定向偶聯(lián)的方式，提高單抗的利用率是降低IAC使用成本的關(guān)鍵;開發(fā)全自動IAC純化儀是避免人為操作不當(dāng)、人為使用低效的有效途徑;加快制定IAC通用技術(shù)評價規(guī)范，是滿足檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的客觀需求。

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收稿日期：2019-12-24

作者簡介：金曉林，男，高級工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩c品控。

通信作者：張東升，男，副研究員，研究方向?yàn)槭称钒踩c營養(yǎng)。