微波輻射預(yù)處理提取細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷工藝及生物活性研究

項振鋒，許清遙，程 宏，王小芳，汪亮亮，陳 睿，陳旭波

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水323000）

細(xì)風(fēng)輪菜Clinopodium gracile（Benth.）Matsum.為唇形科風(fēng)輪菜屬植物，畬族人民用其治療毒蛇咬傷，稱為野仙草[1]。研究表明風(fēng)輪菜屬植物均含有皂苷、黃酮苷、氨基酸、多糖、酚性成分和揮發(fā)油等[2-3]。細(xì)風(fēng)輪菜揮發(fā)油中含34種成分，其中倍半萜類化合物占70.49%[4]，其植株中含有豐富的黃酮類化合物、萜類化合物、甾類化合物和皂苷類化合物[5-7]。

風(fēng)輪菜屬植物具備較好的抑菌和抗腫瘤細(xì)胞活性。如：C.vulgare體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇提取物及體積分?jǐn)?shù)為5%的丙二醇提取物對金葡菌具有較強的活性[8]；C.ascendens精油對多種細(xì)菌，如大腸桿菌、農(nóng)桿菌、金黃色葡萄球菌有顯著活性[9]；C.vulgare的乙醇、乙酸乙酯和丙酮提取物與慶大霉素、頭孢氨芐在抗菌活性方面具有協(xié)同效應(yīng)。微量稀釋法顯示其提取物的MIC活性范圍為0.625～20 mg/mL[10]。中藥植物風(fēng)輪菜（斷血流）水浸液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，其次是大腸桿菌、銅綠假單胞菌和白色念球菌[11]。研究指出小鼠灌胃蔭風(fēng)輪浸膏1.2 g/kg，可明顯提高鈷60照射后的存活率[7]；C.vulgareL.具有較強的抗A2058、HEp-2和L5178Y等腫瘤細(xì)胞活性，其IC50分別為20、10、17.8 μg/mL[12]。因此，細(xì)風(fēng)輪菜活性成分的抑菌和細(xì)胞活性值得研究。

綜上所述，同屬植物提取物的生物活性顯著，三萜皂苷類是風(fēng)輪菜屬植物的主要活性成分之一[7]。但是，缺乏針對該活性成分的研究，特別是針對畬藥細(xì)風(fēng)輪菜活性成分的研究鮮有報道。近年來，微波提取極大地提高了三萜皂苷類等成分的提取效率，微波功率在提取因素中占據(jù)著重要的位置[13-15]。因此，有必要研究其活性成分提取的工藝條件，并在此基礎(chǔ)上，研究三萜皂苷類等主要活性成分的抑菌、抗腫瘤細(xì)胞等活性[5,7]，為后續(xù)的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野外采集細(xì)風(fēng)輪菜全草，陰干，用打粉機打成粉，過40目篩，備用。菌種來自麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，不同種類細(xì)胞來自麗水學(xué)院生態(tài)實驗中心。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）、高氯酸（天津政成化學(xué)制品有限公司）、香草醛（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）、冰乙酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、正丁醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

Grant SUB Aqua 12 Plus 水浴鍋（Grant Instruments（Cambridge）Ltd）、Galanz P70F20CN3P-SR（WO）型微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）、SHZ-95B真空泵（上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司）、721型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 三萜皂苷類化合物提取液獲得

控制微波時間、功率、汽化劑用量、浸潤時間對樣品進(jìn)行預(yù)處理。加入70%乙醇溶液（1:25 g/mL），60～65℃恒溫水浴提取90 min，抽濾除渣，得三萜皂苷類提取液，待測[16]。濃縮提取液，用水飽和的正丁醇萃取，回收正丁醇，得到三萜皂苷類提取物[17]。

1.3.2 三萜皂苷類化合物提取率的測定

三萜皂苷類含量的測定采用5%香草醛-冰醋酸顯色法[16]。通過實驗確定最佳掃描波長為550 nm，最佳5%香草醛-冰醋酸用量為0.3 mL，最佳高氯酸用量為0.8 mL。以齊墩果酸含量μg為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計算三萜皂苷類含量。三萜皂苷類得率（mg/g）計算公式：

其中：a為三萜皂苷類含量（μg）；V為提取液體積（mL）；v為顯色反應(yīng)提取液體積0.5 mL；w為樣品粉末質(zhì)量5 g。

1.3.3 單因素實驗

以細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類化合物得率為指標(biāo)，選擇浸潤時間、汽化劑用量、微波功率和微波時間進(jìn)行單因素實驗，實驗設(shè)計見表1。

表1 單因素實驗

1.3.4 響應(yīng)面實驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面實驗水平設(shè)計，以三萜皂苷類得率為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平設(shè)計，響應(yīng)面水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼

1.3.5 抑菌活性測定

抑菌活性參考CLSI推薦的瓊脂稀釋法[18]。以銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)、耐藥）、金黃色葡萄球菌（標(biāo)準(zhǔn)、耐藥）、大腸桿菌（標(biāo)準(zhǔn)）等5種菌為試驗菌進(jìn)行抑菌活性研究。三萜皂苷類提取液的母液濃度為10 mg/mL，等比稀釋。

1.3.6 抗腫瘤細(xì)胞活性測定

以人結(jié)腸癌細(xì)胞（RKO）、人回盲腸癌細(xì)胞（HCT-8）、人肺癌細(xì)胞（A549）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）等5種癌細(xì)胞為對象進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞活性研究。測定方法參考王濤等人的研究及大連美倫生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒法[19]。母液濃度為400 μg/mL，等比稀釋成5個梯度，實驗重復(fù)5次，取其中3次分析其活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 三萜皂苷類標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

由圖1可知，三萜皂苷類標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.006 6x-0.007 4，R2=0.999 6，線性關(guān)系均較好。

圖1 三萜皂苷類標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 三萜皂苷類提取工藝單因素實驗

由圖2可知，三萜皂苷類提取率最佳浸潤時間為10 min，由圖3、圖4可知，三萜皂苷類提取的最佳微波輻射時間為60 s，最佳微波功率為280 W，提取率較最低點分別提高了11.404%和18.826%。由圖5可知，汽化劑用量對三萜皂苷的提取率也產(chǎn)生了一定的影響，最佳汽化劑用量為5 mL。

圖2 浸潤時間對三萜皂苷類得率的影響

圖3 微波功率對三萜皂苷類得率的影響

圖4 微波時間對三萜皂苷類得率的影響

圖5 汽化劑用量對三萜皂苷類得率的影響

2.3 響應(yīng)曲面結(jié)果與分析

2.3.1 三萜皂苷類提取率二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到三萜皂苷類得率與四因素的回歸模型：

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

由表 4可知，回歸模型差異極其顯著（P＜0.000 1），失擬項（Lack of Fit）差異不顯著（P＞0.05），說明方程對試驗有較好的擬合性，試驗誤差較小；R2=0.952 2，R2Adj=0.904 3，也表明模型擬合程度較好；變異系數(shù)（CV）=1.33%，說明模型的重現(xiàn)性很好，該模型可以對細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類得率進(jìn)行分析和預(yù)測。由F值可知，各因素對細(xì)風(fēng)輪菜總?cè)圃碥疹惖寐实挠绊懼鞔螢椋浩瘎┯昧浚窘檿r間＞微波功率＞微波輻射時間。

由于各個因素的交互作用并不顯著，因此，文中不列出響應(yīng)曲面圖。

表4 回歸模型方差分析

2.3.2 三萜皂苷類提取工藝的確定與驗證

根據(jù)回歸模型及軟件分析得出，微波輻射處理細(xì)風(fēng)輪菜總?cè)圃碥疹惖淖顑?yōu)條件為：浸潤時間12.244 min、微波輻射時間59.910 s、微波功率277.315 W、汽化劑用量6.656 mL。將最佳工藝參數(shù)修正為浸潤時間12 min、微波輻射時間60s、微波功率280 W、汽化劑用量5 mL。該條件下三萜皂苷類得率的預(yù)測值為24.157 mg/g（提取率為2.416%）。在此條件下進(jìn)行3次平行實驗，總?cè)圃碥疹惖牡寐蕿?4.321 mg/g（提取率為2.432%），提取率實際值與預(yù)測值相差0.016%。說明該模型能很好地反映細(xì)風(fēng)輪菜總?cè)圃碥疹惖奶崛l件。傳統(tǒng)水?。ㄈノ⒉ǎ┑牡寐蕿?1.530 mg/g。優(yōu)化后的得率較傳統(tǒng)水浴提高了12.963%，詳見表5。

表5 細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷提取工藝的驗證及方法比較

2.4 細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物的抑菌活性

由表6可知，三萜皂苷類提取物對3種細(xì)菌均有抑制作用，特別對金黃色葡萄球菌（耐藥）表現(xiàn)出了較好的活性，其MIC為5 mg/mL。

表6 細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物的最低抑菌濃度（MIC,mg/mL）

2.5 細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物的抗腫瘤細(xì)胞活性

方差分析顯示，細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物對細(xì)胞增殖的抑制率在不同癌細(xì)胞及濃度之間均存在極顯著差異（P＜0.01）。由表7可知，活性成分對A549和HT29細(xì)胞的抑制率高于其它癌細(xì)胞。高濃度活性成分對HepG2具有一定保護(hù)作用。

表7 細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物對5種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率（%）

3 討論與結(jié)論

目前的微波輔助提取是將微波直接引入提取設(shè)備中，由于溶劑的吸收作用，會降低提取率。本實驗采用的是對材料進(jìn)行微波輻射預(yù)處理，破壞植物細(xì)胞壁，提高提取效率。實驗表明，高功率的微波和較長的輻射時間均能造成材料的活性成分破壞，大量的汽化劑用量和較長的浸潤時間均能阻止微波的吸收，前者結(jié)論與王亞紅等人的研究結(jié)論一致[15]。因此，優(yōu)化微波輻射預(yù)處理的提取條件是整個工藝的關(guān)鍵所在。

實驗表明，細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物對金葡菌及其耐藥菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用。其對革蘭氏陽性菌和陰性菌（標(biāo)準(zhǔn)菌）的抑制效果相當(dāng)，這與孟慶然的研究結(jié)果（皂苷類對革蘭氏陰性菌的抑菌能力強于陽性菌）[20]和廖建良的研究結(jié)果（皂苷類對革蘭氏的陽性菌抑菌能力強于陰性菌）[21]不一致，這與不同來源的皂苷類化合物的復(fù)雜性以及提取物中其它化合物與皂苷相互作用導(dǎo)致了結(jié)果的差異有關(guān)[20]。細(xì)風(fēng)輪菜三萜皂苷類提取物表現(xiàn)出對金葡菌耐藥菌較強的抑菌活性，值得進(jìn)一步深入研究。

研究結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為400 μg/mL時，活性成分對HepG2增殖均有促進(jìn)作用，支持了朱俊杰等人關(guān)于大青葉提取物對HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用的研究結(jié)果[22]。