慢性阻塞性肺疾病模型大鼠核因子κB及腫瘤壞死因子α、白細胞介素8的表達水平及其意義▲

王會娟 王昌明 唐 靈 易玉芳

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，廣西桂林市 541001，電子郵箱：wanghuij2004@163.com)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，可以預防和治療。慢性缺氧、高碳酸血癥和酸中毒可引起COPD患者出現(xiàn)肺血管重塑及廣泛收縮而導致肺動脈高壓。慢性炎癥刺激還可導致血管內(nèi)皮和平滑肌增生以及肺血管結(jié)構(gòu)變化，例如狹窄、閉塞和纖維化，進一步導致肺血管重塑。吸煙、遺傳因素、呼吸道感染和蛋白酶失衡與COPD的發(fā)病密切相關(guān)，但COPD的發(fā)病機制目前仍不清楚[1]。參與COPD發(fā)病機制的炎性細胞包括單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞。當受到吸煙和感染等因素的刺激時，炎癥細胞被激活并迅速釋放細胞因子，而細胞因子進一步加劇炎癥反應，誘導血管內(nèi)皮細胞黏附分子的合成，進而損傷肺組織結(jié)構(gòu)[1-2]。有研究表明，核因子κB (nuclear factor kappaB，NF-κB)參與機體的慢性炎癥反應，白細胞介素(interleukin，IL)-8是促炎趨化因子[2]，參與氣道炎癥的過程。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是一種多效性細胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)以及促進細胞分化增殖、組織發(fā)育、血管生成炎癥等作用[3]，其可以增加肺血管反應性,并降低肺動脈平滑肌細胞前列腺素的產(chǎn)生，促使血小板活性因子誘導肺血管收縮[4]。本研究通過建立COPD大鼠模型及COPD并低氧大鼠模型，檢測NF-κB、IL-8、TNF-α的表達水平，探討上述指標在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 無特定病原體級SD雄性大鼠 48只購自桂林醫(yī)學院動物實驗中心(動物許可證號：SYXK桂2013-0001)，體重180～220g。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為A組(正常對照組)、B組(COPD組)、C組(COPD并低氧組)、A1組(空白對照組)、B1組(COPD干預組)、C1組(COPD并低氧干預組)，每組8只。

1.2 藥物及試劑 脂多糖，吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)均購自美國Sigma公司(批號：Sigma-L2880、Sigma P8765 Ammonium)，烤煙型香煙(甲天下牌)由廣西卷煙廠出品(焦油量為14 mg煙氣煙堿量:1.2 mg)，鈉石灰(批號：20160814)、無水氯化鈣(批號：20160302)購自國藥集團，醫(yī)用氮氣、醫(yī)用氧氣均由桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院統(tǒng)一提供。鼠抗NF-κB p65購自美國 Santa Cruz公司(批號：sc-514451)，β-肌動蛋白一抗(批號：AA132)、細胞裂解液(批號：P0013)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(批號：ST505)、辣根過氧化物酶體標記山羊抗小鼠IgG(批號：A0216)均購自江蘇碧云天公司,大鼠IL-8酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司(批號：F15880),大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司(批號：MTA00B)。PDTC溶液的配置：用生理鹽水將PDTC稀釋成濃度為100 mg/mL溶液后備用。

1.3 主要儀器及設備 BP-221S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；自制有機玻璃艙規(guī)格為0.91 m ×0.42 m×0.62 m；OX-100A數(shù)字測氧儀(上海隆拓儀器設備有限責任公司)。蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司),SensiCapture凝膠成像采集系統(tǒng)及 SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)均購自美國Media Cybernetics公司。

1.4 動物模型的構(gòu)建及干預 (1)B組及B1組分別在實驗第1、14天經(jīng)氣道注入脂多糖溶液，200 μg/次，之后將大鼠置于自制有機玻璃艙內(nèi)熏煙1 h/d，5只煙/次，共6周，制作COPD大鼠模型；建模期間艙內(nèi)小孔與外界相通，保證空氣流通及壓力與外界相同，艙內(nèi)放置無水氯化鈣及鈉石灰，大鼠在艙內(nèi)可自由進食；B1組在實驗第15天開始直至處死每天予以PDTC溶液腹腔注射，劑量為100 mg/(kg·d)；B組不做處理。(2)C組及C1組按照B組及B1組方法建立COPD模型，在實驗的最后2周給予熏煙的同時，使用氮氣調(diào)節(jié)氧濃度，使氧濃度穩(wěn)定于18%，使用測氧儀監(jiān)測氧濃度，低氧干預時間為8 h/d；C1組在實驗第15天開始予以PDTC腹腔注射，用法同B1組；C組不做處理。(3)A組及A1組正常飼養(yǎng)。Al組于實驗的第15天開始直至處死每天予腹腔注射與PDTC等體積的生理鹽水；A組不做處理。

1.5 觀察指標

1.5.1 病理組織學：實驗6周后，大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40～55 mg/kg)腹腔麻醉后，行右心室采血后，用組織剪分離肺臟。取大鼠右肺中葉，于肺內(nèi)注射 10%中性福爾馬林至肺膨脹后結(jié)扎肺門，標本浸泡于福爾馬林中固定24 h，于右中葉距肺門2～3 mm處取材，取材后常規(guī)石蠟包埋、切片；行蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin，HE)染色及維多利亞藍+Van-Gieson染色，觀察大鼠病理組織學情況。(1)氣道重構(gòu)：在200倍鏡視野下任選5個直徑≤1 100μm(管腔最短徑/最長徑≥0.7)的細支氣管，測量其管壁面積、氣管總面積、細支氣管外徑、管壁厚度；然后計算管壁面積和氣管總面積比值即氣管中膜面積(用MA%表示)，以及管壁厚度與氣管外徑比值即氣管中膜厚度(用MT%表示)。(2)肺血管重塑：在200倍鏡下測定直徑<100 μm的肺腺泡內(nèi)的肺動脈總數(shù)，將其分類，分別計算肌性動脈、部分肌性動脈、非肌性動脈構(gòu)成比。在400倍鏡下對50～100 μm的肌性動脈進行圖像分析，計算血管管壁面積與血管總面積比即肺動脈WA%，以及血管管壁厚度與血管外徑比即肺動脈WT%。

1.5.2 NF-κB p65蛋白表達水平：取右肺前葉及后葉組織，液氮中碾磨，按總蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司，批號：310003)操作步驟提取組織總蛋白，即碾磨后肺組織粉末加入蛋白提取液、PMSF、蛋白酶抑制劑，充分混勻后冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清(即組織總蛋白)。將上清液移入另一離心管中保存置于-80℃待檢。待檢蛋白樣品用二喹啉甲酸法進行蛋白定量，操作步驟按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(碧云天生物科技有限公司，批號：P0012S)說明書進行。經(jīng)12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h，用TBST充分洗滌，加入抗NF-κB p65單克隆抗體(稀釋度1 ∶800)，于室溫孵育2 h；充分洗膜后加入二抗山羊抗鼠IgG(稀釋度為1 ∶1 000)，于室溫孵育1 h；TBST充分洗滌后，進行顯影和定影，于凝膠成像分析系統(tǒng)分析膠片，以β-肌動蛋白為內(nèi)參(一抗稀釋度1 ∶500，二抗稀釋度1 ∶1 000)，以NF-κB p65與β-肌動蛋白比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.5.3 肺泡灌洗液及血清中TNF-α、IL-8水平：從心臟取血約5 mL，放入離心管，3 000 r/min離心15 min,取上層血清于-70℃保存。大鼠肺臟用組織剪離體后以絲線結(jié)扎右肺支氣管，采用0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液灌洗左肺3次,每次2 mL，獲得肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后，1 500 r/min離心10 min,取上清液置于-80℃保存。采用ELISA法檢測TNF-α、IL-8的表達水平，按試劑盒說明書進行操作，于酶標儀的450 nm波長處讀取各孔A值。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理學 A組與A1組鏡下未見炎癥細胞浸潤，管壁完整，為正常氣道結(jié)構(gòu)。B組鏡下可見典型的COPD病變表現(xiàn)，包括氣道管壁有炎癥細胞浸潤，氣道上皮細胞增生，肺氣腫明顯，并可見肺大皰形成，與B組比較，Bl組炎癥細胞浸潤減少，肺氣腫、肺大皰有改善。C組鏡下觀察可見典型的COPD并低氧的病理表現(xiàn)，包括氣道管壁大量炎癥細胞浸潤，局部可見肌層斷裂及肺泡壁斷裂，平滑肌增生明顯，與C組比較，C1組炎癥浸潤、肌層斷裂、肺泡壁斷裂現(xiàn)象均減少。

2.2 6組大鼠氣道及肺血管重構(gòu)指標比較 除部分肌性動脈率外，6組大鼠其他氣道及肺血管重構(gòu)指標差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與A組比較，B、C組肌性動脈率以及肺動脈MA%、肺動脈MT%均增高，而非肌性動脈率降低(均P<0.05)，但B組和C組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；B1組、C1組的肌性動脈率、肺動脈MA%、肺動脈MT%分別低于B組及C組，而非肌性動脈率分別高于B組及C組(均P<0.05)。C組的氣管WA%、氣管WT%均高于A組(均P<0.05)，但B組與A組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C1組氣管WA%、氣管WT%均低于C組(均P<0.05)，但B1與B組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組肺血管及氣道重構(gòu)指標比較(x±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.3 6組肺組織NF-κB p65蛋白表達水平比較 與A組比較,B、C組NF-κB p65蛋白相對表達水平增高，且C組高于B組(均P<0.05)；B1組、C1組的NF-κB p65蛋白相對表達水平分別低于B組、C組(均P<0.05)。見表2。

2.4 6組大鼠BALF及血清中IL-8，TNF-α表達水平比較 與A組比較,B組、C組血清及BALF中IL-8、TNF-α水平增高，且C組均高于B組(均P<0.05)；B1、C1組血清及BALF中IL-8、TNF-α水平分別低于B組、C組(均P<0.05)。 見表2。

表2 6組肺組織NF-κB p65蛋白、BALF及血清中IL-8和TNF-α蛋白表達水平比較(x±s)

注：與A組比較*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3 討 論

COPD 的病理特征是累及氣道、肺實質(zhì)以及肺血管的慢性炎癥和氣道重構(gòu)[5]。隨著COPD的進展，可能會出現(xiàn)肺血管重建和肺動脈高壓，進一步引起肺心病。細胞因子在COPD的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，以TNF-α、IL-8為主要細胞因子導致的氣道炎癥被認為是COPD發(fā)病的重要機制之一。

本實驗通過疊加吸煙、感染、低氧三大致病因素成功制備COPD及COPD并低氧動物模型，分別模擬COPD大鼠模型合并不同程度的肺血管重構(gòu)狀態(tài)。結(jié)果顯示，B組COPD大鼠氣道阻力增高，管腔內(nèi)炎細胞聚集及黏液蓄積，管壁內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，柱狀上皮杯狀細胞增生明顯，平滑肌層增厚，黏膜下及外膜膠原纖維增生，部分肌層斷裂，肺氣腫形成，部分肺泡壁斷裂形成肺大皰，肌性動脈百分比增高；C組COPD并低氧大鼠病理改變與COPD組相似，但平滑肌層增厚更明顯。上述模型代表COPD肺血管重構(gòu)的不同階段，其中COPD模型代表早期階段，表現(xiàn)為肌性動脈百分比增多；COPD并低氧模型代表肺血管重構(gòu)進展階段，此時不僅腺泡內(nèi)肌性動脈百分比增高，且肺動脈中膜厚度增加，WA%、WT%比值增高。相關(guān)病理學改變均與人類COPD的病理特征吻合。

NK-κB通常以p50/p65異源二聚體的形式存在,該二聚體也是其主要活性形式。其中，p50含核定位信號，與DNA直接結(jié)合，p65含轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，具有轉(zhuǎn)錄激活功能。在正常情況下，由p50/p65二異聚體與抑制性蛋白結(jié)合的成三聚體，處于無活性狀態(tài)。但多種刺激誘導可活化NF-κB，NF-κB的活化會引起一系列基因表達，包括炎癥刺激相關(guān)的細胞因子和生長因子，經(jīng)過NF-κB誘導產(chǎn)生的蛋白，如TNF-α、IL-8等，又可活化NF-κB，最終使炎癥發(fā)生級聯(lián)化反應。多項臨床研究結(jié)果均表明COPD患者的血清TNF-α和IL-8水平高于正常健康人[6-7]。本研究結(jié)果顯示，COPD大鼠及COPD并低氧大鼠NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-8表達水平升高，且COPD并低氧的大鼠更明顯。這提示TNF-α、IL-8參與COPD發(fā)生和發(fā)展過程，隨著疾病的發(fā)展，相關(guān)炎癥因子水平也升高，而NF-κB可能起到上游調(diào)控的作用[8]。

還有研究表明，NF-κB不僅在炎癥因子網(wǎng)絡中起重要的調(diào)節(jié)作用，還參與肺血管重構(gòu)、肺動脈對刺激因子的收縮反應、肺動脈平滑肌細胞的增殖及凋亡等過程。NF-κB還可通過炎癥介質(zhì)來干預一氧化氮、內(nèi)皮素1、血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β等的調(diào)節(jié)，進而影響肺血管重構(gòu)[9]。本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B、C組肺動脈MA%、MT%、肌性動脈率均增高，且肺組織NF-κB p65蛋白的表達水平亦升高(P<0.05)，提示隨著氣道、肺血管重構(gòu)的發(fā)展，炎癥因子的表達也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。說明炎癥反應與COPD的氣道、肺血管重構(gòu)密切相關(guān)。

PDTC是NF-κB特異性抑制劑，其可抑制NF-κB的激活，進而抑制炎癥因子的表達[10]。本研究結(jié)果顯示，與對應模型組比較，B1組、C1組NF-κB p65蛋白表達、TNF-α和IL-8水平均降低，且氣管及血管重塑指標(肺動脈MA%及肺動脈MT%、肌性動脈率)均下降(P<0.05)，提示抑制NF-κB p65蛋白的表達，可直接下調(diào)TNF-α及IL-8的表達水平，并改善氣管及肺血管重構(gòu)。因此，PDTC對改善肺部炎癥及肺血管重構(gòu)，延緩COPD病程進展，或有一定療效。

綜上所述，COPD大鼠的NF-κB及TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達均上調(diào)，NF-κB可能是通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-8等早期炎癥介質(zhì)的表達從而參與COPD大鼠肺血管重塑、肺動脈高壓的形成過程。