一種甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法的建立

顏梅新，張小秋，王澤平，雷敬超，李翔，黃冬梅，宋修鵬

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

0 引言

甘蔗黑穗?。⊿ugarcane smut）是對(duì)廣西乃至全國甘蔗安全生產(chǎn)威脅最大的病害［1］，它能夠?qū)е抡崆o產(chǎn)量和蔗糖分的嚴(yán)重降低，一般發(fā)病率為18%，宿根蔗發(fā)病率高達(dá)50%，給我國甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病害于1877年在南非納塔爾首次報(bào)道［2］，之后蔓延至全球所有的甘蔗種植國家。目前，甘蔗黑穗病已成為一種世界重要的甘蔗病害。甘蔗黑穗病最明顯特征是病蔗梢頭具一條向下內(nèi)卷的黑色鞭狀物。該病病原為甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum），屬擔(dān)子菌亞門黑粉菌屬，是兩型真菌，在其生活史中，不同遺傳交配型（“＋”和“-”）的單倍體細(xì)胞通過有性配合形成雙核菌絲體，在活的寄主組織中侵入寄主甘蔗體內(nèi)發(fā)育，使甘蔗發(fā)?。?］。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鞭黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的成功構(gòu)建促進(jìn)了甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究［4-5］。Yan等［6］利用綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記甘蔗鞭黑粉菌（“＋”和“-”）菌株，揭示其有性配合、冬孢子形成、冬孢子萌發(fā)等過程。通過對(duì)甘蔗鞭黑粉菌交配型基因a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因的克隆和功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們的基因結(jié)構(gòu)和功能與玉米黑粉菌（U. maydis）的a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)和功能相似［3，7］。Deng等［8］揭示MAP Kinase SsKpp2參與甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和菌絲形成過程。Chang等［9］驗(yàn)證了cAMP/PKA 信號(hào)在甘蔗鞭黑粉菌中的功能，該基因通過調(diào)高病菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平，促使“＋”“-”兩性單倍體細(xì)胞融合，形成雙核菌絲侵染寄主。最近，Sun等［10］證實(shí)了Farnesyltransferase β-Subunit Ram1可調(diào)控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和致病性。

目前甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究需要大量突變體對(duì)甘蔗種苗進(jìn)行致病性測(cè)定，這就需要準(zhǔn)備大量的甘蔗種苗作為接種材料。致病性測(cè)定主要采取“＋”“-”菌體混合孢子液注射的人工接種方法［3］，但該方法存在缺陷，如前期準(zhǔn)備繁瑣、耗時(shí)、耗人工、致病性測(cè)定周期長(zhǎng)且測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，限制突變體測(cè)試數(shù)量，從而影響甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的篩選效率，導(dǎo)致甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究進(jìn)度緩慢。為了提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的篩選效率，本研究開展了組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種技術(shù)研究，形成了一種甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法，省去繁瑣的前期準(zhǔn)備工作，縮短致病性測(cè)試周期，提高甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定效率，對(duì)甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為桂糖49號(hào)，規(guī)格為移栽后高度20～40cm的組培苗。甘蔗黑穗病菌野生型菌株Ss17和Ss18及突變體（突變體為經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得隨機(jī)插入的突變體）由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘蔗鞭黑粉菌野生型及突變體孢子懸浮液配制

將甘蔗鞭黑粉菌野生型“＋”“-”菌株Ss17和Ss18及突變體從-80℃冰箱中取出，接種至酵母提取物（yeast extraction）1%，蛋白胨（peptone）2%，蔗糖（sugar）2%，瓊脂（agar）2%的YePSA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于28℃培養(yǎng)2天。將活化好的甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株Ss17和Ss18及突變體分別接種至酵母提取物（yeast extraction）1%，蛋白胨（peptone）2%，蔗糖（sugar）2%的YePS液體培養(yǎng)基，于28℃搖床，200rpm，培養(yǎng)2天，所有菌株孢子懸浮液調(diào)至1×107個(gè)/mL，然后“＋”和“-”菌株按1：1混合，具體如：野生型Ss17＋Ss18，來源于Ss17菌株的突變體與菌株Ss18混合，來源于Ss18菌株的突變體與菌株Ss17混合。

1.2.2 甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定

將高度為20～40cm的甘蔗組培苗移栽至長(zhǎng)寬高分別為0.7m、0.45m和0.2m的塑料盆中，30株/盆，見圖1A。采用醫(yī)用1 mL注射器分別吸取上述1.2.1所配好的甘蔗鞭黑粉菌混合孢子懸浮液各1mL，將混合孢子懸浮液注射至甘蔗組培苗植株內(nèi)生長(zhǎng)點(diǎn)處附近，用標(biāo)簽牌做好標(biāo)記，野生型Ss17＋Ss18作陽性對(duì)照，接種蒸餾水（ddH2O）為陰性對(duì)照，每處理接種3株；突變體接種每處理1株作為初篩。致病性測(cè)定復(fù)篩時(shí)，野生型Ss17＋Ss18為陽性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照，對(duì)照和突變體處理均設(shè)5株重復(fù)。

1.3 甘蔗黑穗病調(diào)查

自第一株甘蔗黑穗病發(fā)生開始調(diào)查，每隔1天調(diào)查一次；記錄發(fā)病時(shí)間，收集黑穗病樣本于信封中，放置50℃烘箱烘干后，保存4℃冰箱。

2 結(jié)果

本研究共測(cè)試209個(gè)甘蔗鞭黑粉菌突變體，甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定（初篩）結(jié)果顯示，甘蔗鞭黑粉菌野生型Ss17＋Ss18接種后，48～72天內(nèi)發(fā)病，如圖1B、C所示，發(fā)病率為100%，陰性對(duì)照不發(fā)病。而突變體最早發(fā)病時(shí)間為38天，初步獲得比野生型發(fā)病早10天的突變體7個(gè)，其中4個(gè)來自出發(fā)菌株Ss17，3個(gè)來自出發(fā)菌株Ss18。發(fā)病時(shí)間在41～90天的突變體有176個(gè)，來自出發(fā)菌株Ss17和Ss18的突變體分別為84個(gè)和92個(gè)，這類突變體與野生型對(duì)照（CK）發(fā)病時(shí)間比較接近，屬于發(fā)病正常突變體，如圖1D所示。突變體在91～120天內(nèi)發(fā)病，與野生型對(duì)照（CK）處理相比較，發(fā)病比較晚，屬于發(fā)病晚突變體，該類突變體有17個(gè)，其中來自出發(fā)菌株Ss17的有10個(gè)，來自出發(fā)菌株Ss18的突變體7個(gè)。初步獲得不發(fā)病突變體9個(gè)，其中3個(gè)突變體來自出發(fā)菌株Ss17，而來自出發(fā)菌株Ss18的突變體為6個(gè)，見表1。

本研究將致病性缺陷突變體（包括初篩中發(fā)病早、發(fā)病晚和不發(fā)病的突變體）再進(jìn)行二次接種。甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定（復(fù)篩）結(jié)果證實(shí)，甘蔗鞭黑粉菌野生型Ss17＋Ss18接種組培苗，接種后55～70天內(nèi)發(fā)病，發(fā)病率為100%；陰性對(duì)照不發(fā)病，生長(zhǎng)正常。而突變體最早發(fā)病時(shí)間為40天，比野生型發(fā)病早15天的突變體有4個(gè)，占突變體總數(shù)（209個(gè)）的1.9%，來自出發(fā)菌株Ss17 和Ss18各為2個(gè)。晚發(fā)病的突變體（發(fā)病時(shí)間在91～120天）共有15個(gè)，占突變體總數(shù)的7.2%，其中來自出發(fā)菌株Ss17的有9個(gè)，來自出發(fā)菌株Ss18的突變體6個(gè)。不發(fā)病突變體1個(gè)，來自出發(fā)菌株Ss18，占突變體總數(shù)的0.5%，見表2。而正常發(fā)病的突變體為絕大多數(shù)，占突變體總數(shù)89.9%。

圖1 甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定

表1 甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定（初篩）

表2 甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定（復(fù)篩）

3 討論

甘蔗黑穗病是我國甘蔗發(fā)生最嚴(yán)重的一種病害，給我國甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［1］。該病是由甘蔗鞭黑粉菌引起的，屬兩型真菌，在其生活周期中，不同遺傳交配型（“＋”和“-”）的單倍體細(xì)胞通過有性配合形成雙核菌絲體，侵入寄主，使甘蔗發(fā)?。?］。

近年，甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究獲得進(jìn)展，首先農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鞭黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的成功構(gòu)建，為甘蔗鞭黑粉菌基因功能研究提供了便利［4-5］。另外，甘蔗鞭黑粉菌全基因組序列的測(cè)定為基因功能的鑒定提供了信息［11］。甘蔗鞭黑粉菌交配型基因a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因的克隆和驗(yàn)證，使我們?cè)诜肿铀缴细M(jìn)一步了解與玉米黑粉菌有著相似生活周期的交配型基因結(jié)構(gòu)和功能［3，7］。迄今，已鑒定參與或者調(diào)控甘蔗鞭黑粉有性配合和致病性的基因或者信號(hào)通路有SsKpp2［8］、cAMP/PKA 信號(hào)通路、Ram1［10］、SsAgc1［12］等。

甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是致病性測(cè)定，大量定向敲除突變體或者隨機(jī)插入突變體的致病性測(cè)定需要大量的甘蔗種苗進(jìn)行接種。當(dāng)前的致病性測(cè)定方法［3］，存在前期準(zhǔn)備（如砍甘蔗，盆栽，甘蔗發(fā)株等所需時(shí)間至少2個(gè)月）繁瑣、耗時(shí)、耗人工、致病性測(cè)定周期長(zhǎng)且不穩(wěn)定，限制突變體測(cè)試數(shù)量等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的測(cè)試效率，導(dǎo)致甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究進(jìn)度緩慢。本研究的甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法，對(duì)209個(gè)突變體進(jìn)行一次初篩和一次復(fù)篩的致病性測(cè)定，在初篩測(cè)試中，每處理只需1個(gè)重復(fù)（1株甘蔗組培苗），而在復(fù)篩中每處理僅需設(shè)5個(gè)重復(fù)，甘蔗鞭黑粉菌野生型發(fā)病率為100%，而突變體發(fā)病率也到達(dá)80%以上。發(fā)病早、發(fā)病晚和不發(fā)病的突變體，分別占突變體總數(shù)的1.9%、7.2%和0.5%，而正常發(fā)病的突變體占總突變體總數(shù)的89.9%，該比例符合突變體的分布規(guī)律，達(dá)到了預(yù)期效果。

本研究的接種方法方便，組培苗盆栽即可進(jìn)行接種，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，節(jié)約土地、資金和勞動(dòng)力等成本，省去了繁瑣的前期準(zhǔn)備工作，縮短致病性測(cè)試周期，比當(dāng)前的接種方法縮短了至少2個(gè)月時(shí)間，提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體篩選和驗(yàn)證效率，為甘蔗鞭黑粉菌致病性相關(guān)基因鑒定及機(jī)理研究提供技術(shù)支持。