變應(yīng)性支氣管肺曲霉病患者中CFTR基因變異種類分析

王澤雙，劉雅萍，田欣倫，支玉香

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 北京協(xié)和醫(yī)院 a.變態(tài)反應(yīng)科，b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系,c.呼吸內(nèi)科，北京 100730)

變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)是機(jī)體對(duì)存在于支氣管內(nèi)的曲霉菌(主要為煙曲霉)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一種疾病，在部分特發(fā)性哮喘和囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)患者中也普遍存在對(duì)煙曲霉敏感的情況，然而僅有2.5%的哮喘患者和9%的CF患者發(fā)展成ABPA[1-2]。ABPA患者在臨床常表現(xiàn)為難以控制的哮喘、肺部浸潤及中央型支氣管擴(kuò)張等，其癥狀和體征與哮喘和CF相似，臨床易引起誤診或漏診[3]。有研究報(bào)道，高達(dá)1/3的ABPA患者被誤診為肺結(jié)核、哮喘等疾病[4]。自1952年首例ABPA報(bào)道以來[5]，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)ABPA的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究。其中，基于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)基因多態(tài)性與ABPA發(fā)病之間的關(guān)系成為近年的研究熱點(diǎn)。正常情況下，CFTR基因編碼一種名為CFTR的跨膜糖蛋白，其主要功能是維持上皮細(xì)胞內(nèi)外的水電解質(zhì)平衡。CFTR的功能異?？蓪?dǎo)致氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，表現(xiàn)為慢性鼻竇炎、咳嗽、喘息等呼吸系統(tǒng)癥狀及汗液咸度異常和精子排除不暢等[6]。CF是一種常染色體隱性遺傳病，常見于高加索人，新生兒中CF的發(fā)病率約為1/3 500[7-8]。有研究表明，我國CF患者中檢測到的CFTR基因變異與高加索人有很大差異[9-15]。國外有文獻(xiàn)報(bào)道，ABPA患者攜帶CFTR基因變異的比例高于哮喘人群[16]。本研究旨在探討我國ABPA患者CFTR基因變異的特殊性，以及CFTR基因變異在改變ABPA患者臨床癥狀及體征中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2018年12月于北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科及變態(tài)反應(yīng)科門診確診的9例漢族ABPA患者作為研究對(duì)象，ABPA診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組編制的《變應(yīng)性支氣管肺曲霉病診治專家共識(shí)》[17]，具體如下。①相關(guān)疾病(至少符合1條)：哮喘、支氣管擴(kuò)張癥、慢性阻塞性肺疾病、非囊性纖維化等。②必需條件(2條均符合)：血清煙曲霉特異性IgE水平升高(>0.35 kUA/L)或煙曲霉皮試速發(fā)反應(yīng)陽性；血清總IgE水平升高(>1 000 U/mL)。③其他條件(至少符合2條)：外周血嗜酸粒細(xì)胞大于0.5×109/L(使用激素者可正常，以往的數(shù)據(jù)可作為診斷條件)；影像學(xué)與ABPA一致的肺部陰影(一過性病變包括實(shí)變、結(jié)節(jié)、牙膏征或指套征、游走性陰影等，持久性病變包括支氣管擴(kuò)張、胸膜肺纖維化等)；血清煙曲霉特異性IgG或沉淀素陽性。所有患者無不孕不育病史，出生后無腸梗阻、直腸脫垂等消化道癥狀，其中4例患者經(jīng)汗液電解質(zhì)檢查氯離子水平正常，排除CF。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2試驗(yàn)方法 所有患者采集外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，使用DNA抽提試劑盒(QIAGEN KIT)提取DNA；使用Nanodrop紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的DNA進(jìn)行濃度和純度檢測，要求濃度達(dá)到30 ng/μL以上，純度在吸光度(A)260/280下為1.8～2.0，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載CFTR基因序列，使用Primer3(Version 0.4.0)軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行驗(yàn)證，并經(jīng)過NCBI-BLAST檢測特異性，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司設(shè)計(jì)引物。聚合酶鏈反應(yīng)試劑包括Taq酶(PrimeSTAR GXL)、脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖液等，購自日本TAKARA公司。聚合酶鏈反應(yīng)條件：變性98 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，×35循環(huán)，16 ℃保溫。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶需清晰無雜帶，濃度>30 ng/μL為合格樣品，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找CFTR基因序列信息，并結(jié)合本研究案例采用Chromas Pro 2.1.3軟件對(duì)CFTR基因序列進(jìn)行讀圖分析。

2 結(jié) 果

2.1一般資料分析 本研究納入9例ABPA患者進(jìn)行基因篩選，其中男4例，女5例，年齡31～67歲，中位年齡為48歲。所有患者均為漢族且無ABPA家族史及血緣關(guān)系。本研究中ABPA患者的臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，其中哮喘6例，咳嗽9例。3例ABPA患者肺功能檢查，第一秒用力呼氣量/用力肺活量比值降低。胸部高分辨CT發(fā)現(xiàn)，肺部條索狀影、管壁增厚等支氣管擴(kuò)張表現(xiàn)患者4例。9例ABPA患者的一般資料及CFTR基因變異類型見表1。

2.2CFTR基因變異結(jié)果分析 本研究9例患者均利用普通聚合酶鏈反應(yīng)及Sanger測序進(jìn)行了CFTR基因區(qū)域的全外顯子測序，其中9例患者均攜帶CFTR基因變異，且所發(fā)現(xiàn)的CFTR基因變異均不是國外常見變異類型。在9例患者中，共發(fā)現(xiàn)c.1408G>A(圖1)、c.2562T>G(圖2)、c.374T>C(圖3)及c.1666A>G(圖4)4種變異類型。

表1 9例ABPA患者的一般資料及CFTR基因變異類型

ABPA：變應(yīng)性支氣管肺曲霉病；CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子

3 討 論

ABPA一般發(fā)生在具有特異性體質(zhì)的人群，其免疫病理為特異性IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和特異性IgG介導(dǎo)的Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，在轉(zhuǎn)診中心和二級(jí)護(hù)理組中，ABPA的患病率分別為13%和0.7%～3.5%[18-19]；而在CF中，ABPA的患病率約為9%[20]。ABPA患者一般均伴有肺功能下降，且與臨床常見的其他呼吸系統(tǒng)疾病較為類似，特別是與哮喘或浸潤性肺結(jié)核容易混淆，其從首次發(fā)病到明確診斷往往需要很多年。本研究中，大多數(shù)患者表現(xiàn)為哮喘和支氣管擴(kuò)張等癥狀，對(duì)臨床診斷容易引起誤導(dǎo)，這與王夢雨等[1]對(duì)26例ABPA患者的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)分析結(jié)果一致，即認(rèn)為ABPA在我國較少見且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易誤診為哮喘。因此，加強(qiáng)對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)，并尋找有效手段早期識(shí)別ABPA具有重要意義。

CFTR基因變異自1989年被發(fā)現(xiàn)與CF有關(guān)以來被西方國家廣泛研究[21]，截至目前2 000余種變異被發(fā)現(xiàn)，其中CF患者是CFTR基因突變的主要檢出人群[22]。ABPA患者表現(xiàn)的肺部癥狀與CF的肺部癥狀相似，且CF患者合并ABPA提示ABPA患者中可能存在CF基因的變異。針對(duì)高加索人的研究也證實(shí)了這種可能性，且在無CF合并癥的ABPA患者中，CFTR基因的雜合變異較常見[2]。

目前，關(guān)于我國ABPA患者中CFTR基因變異的研究較少。Miller等[23]對(duì)11例ABPA患者和53例慢性支氣管炎患者的CFTR基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，所有納入患者中除ABPA患者中有1例為非洲裔人外，其余均為高加索人。結(jié)果顯示，在11例ABPA患者中有6例患者存在CFTR基因多態(tài)性，其中有1例患者合并有△F508和R347H變異，4例患者存在ΔF508變異，1例患者存在R117H變異，而在53例慢性支氣管炎患者中并未發(fā)現(xiàn)CFTR基因變異，故認(rèn)為CFTR基因變異在ABPA的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，且ΔF508變異是ABPA患者CFTR基因多態(tài)性的主要類型。與上述研究類似，Marchand等[24]將21例ABPA患者作為觀察組，43例支氣管哮喘和142例健康受試者作為對(duì)照組，對(duì)兩組受試者的CFTR基因變異情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，觀察組有6例(28.6%)存在CFTR基因變異，而對(duì)照組僅有8例(4.3%)存在CFTR基因變異，其中支氣管哮喘患者中2例，健康受試者中6例。為進(jìn)一步闡明CFTR基因多態(tài)性在ABPA發(fā)病過程中的作用，Agarwal等[16]對(duì)CFTR基因變異與ABPA的關(guān)系進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組的非ABPA患者相比，ABPA患者CFTR基因變異的風(fēng)險(xiǎn)增加10.39倍，表明ABPA的發(fā)生可能與CFTR基因變異有關(guān)，但該研究僅納入4篇文獻(xiàn)，樣本量有限可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚。

本研究結(jié)果顯示，9例患者均存在CFTR基因變異。Marchand等[24]對(duì)21例ABPA患者CFTR基因變異研究發(fā)現(xiàn)，有6例存在CFTR基因變異，包括13種CFTR基因變異類型。Lebecque等[25]在18例ABPA患者中發(fā)現(xiàn)，有12例患者存在CFTR基因變異。本研究中，9例患者CFTR基因變異類型主要有4種，其中1、2、4、5、8、9號(hào)患者均發(fā)現(xiàn)位于11號(hào)外顯子區(qū)域的c.1408G>A變異，1、2、5、8號(hào)患者均發(fā)現(xiàn)有c.2562T>G變異。所有ABPA患者均未檢測到常見于高加索人的CFTR基因變異類型(F508del、G542X、G511D)。因此，ABPA的發(fā)病可能與CFTR基因變異有關(guān)。

有研究證實(shí)，在慢性哮喘和慢性鼻竇炎患者中也存在比較高的CFTR基因變異頻率[26-27]。有學(xué)者認(rèn)為，CFTR基因變異是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的一種重要致病因素[28]；但有研究認(rèn)為，CFTR基因的雜合變異是機(jī)體對(duì)抗哮喘的一種保護(hù)機(jī)制[29-30]。而在ABPA中，其發(fā)病機(jī)制可能與多種固有免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的基因變異有關(guān)。有研究認(rèn)為，CFTR基因多態(tài)性對(duì)ABPA的形成作用有限，可能由于某一個(gè)等位基因變異導(dǎo)致的黏膜病變使機(jī)體屏障功能受損，正常的免疫應(yīng)答不能正常進(jìn)行，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)曲霉菌產(chǎn)生過激免疫應(yīng)答[31]，且患者攜帶的CFTR基因變異類型增多，并不會(huì)引起CFTR功能發(fā)生較大改變[32]。除CFTR基因多態(tài)性外，人類白細(xì)胞抗原(DL2、DR5)、表面活性蛋白A、甘露糖結(jié)合凝集素、Toll樣受體、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-4Rα基因變異引起的ABPA亦有報(bào)道[33-35]。

ABPA已被大量試驗(yàn)證實(shí)與很多種固有免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的基因變異有關(guān)，且CFTR基因變異與ABPA發(fā)病具有較強(qiáng)的相關(guān)性，我國ABPA患者CFTR基因變異類型可能與國外常見變異類型存在差異。今后需要不斷完善我國基因樣本庫，建立一套適用中國人的CFTR基因變異庫，以對(duì)疑似ABPA患者進(jìn)行基因篩查，為臨床醫(yī)師做出正確診斷提供輔助信息。