間歇性低壓低氧預(yù)處理對(duì)SD大鼠肝臟照射后缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響

袁芳，美麗姑·買買提，徐麗，李文軍，鄒蘊(yùn)，李文哲

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院放療科，烏魯木齊 830000)

間歇性低壓低氧預(yù)處理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)是指將人或動(dòng)物通過間斷或連續(xù)地暴露于低壓低氧環(huán)境中，從而模擬高原適應(yīng)，適度的低壓低氧刺激可有效調(diào)動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以對(duì)抗隨后嚴(yán)重的外界傷害刺激。IHHP對(duì)機(jī)體有多種有益作用，如對(duì)抗心臟缺血再灌注損傷、抗心律失常、改善冠心病患者的血脂異常等,并且可以產(chǎn)生神經(jīng)、肝臟保護(hù)作用，而缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)在其中發(fā)揮重要作用。

HIF-1是1992年Semenza和Wang[1]在低氧環(huán)境飼養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，其能與紅細(xì)胞生成素基因增強(qiáng)子的核苷酸序列特異性結(jié)合。低氧時(shí)，HIF-1是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子[2]。HIF-1由α與β兩個(gè)亞單位構(gòu)成，與多種疾病密切相關(guān)[3]。HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，而HIF-1α表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)氧水平密切相關(guān)，非缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，而低氧狀態(tài)下HIF-1α表達(dá)增高、降解減少[4]。本研究主要分析IHHP對(duì)SD大鼠肝臟照射后HIF-1α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來源及分組 50只健康全雄SD大鼠[SCXK(新)2011-0004]購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無特定病原體級(jí)，體重180～220 g，平均(197.3±1.2)g，采用隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、單純照射組、間歇性低壓低氧(3 000 m)預(yù)處理+照射組、間歇性低壓低氧(4 000 m)預(yù)處理+照射組、間歇性低壓低氧(5 000 m)預(yù)處理+照射組，每組10只。分組后各組大鼠標(biāo)記編號(hào)。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。大鼠開始實(shí)驗(yàn)前在新疆軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科動(dòng)物飼養(yǎng)中心[SYXK(新)2011-0003]常規(guī)飼養(yǎng) 1周。

1.2預(yù)處理方法 低壓低氧環(huán)境均在西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)中進(jìn)行。通過實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔高度分別為3 000 m、4 000 m、5 000 m的高原環(huán)境，每次進(jìn)艙前更換墊料，準(zhǔn)備足夠的水和食物，每組進(jìn)艙時(shí)間為6 h，每日1次，每周5次，進(jìn)艙后觀察記錄大鼠的飲食、活動(dòng)情況，每次出艙后對(duì)大鼠行右半肝照射。

1.3照射方法 3%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1 mL/100 g)將大鼠麻醉后固定在自制的木質(zhì)固定板，四肢和頭部均固定，確定照射野并在體表標(biāo)記，照射野大小為3 cm×2 cm×1.5 cm，照射方法：6 V X線，源皮距100 cm，照射深度(d)1.5 cm，劑量率600 cGy/min，照射劑量60 Gy，2 Gy/(f·d)，每周5次。

1.4取材 每組照射結(jié)束后6 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定后打開大鼠腹腔，觀察肝臟的大小、形狀、質(zhì)地、顏色。切取1 cm×1 cm×1 cm大小的受照肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.5免疫組織化學(xué)染色檢測HIF-1α 免疫組織化學(xué)染色按Abcam試劑盒說明書進(jìn)行：組織蠟塊 5 μm 連續(xù)切片后標(biāo)記，烤片20 min，脫蠟及再水化：二甲苯5 min，100%乙醇5 min，95%、90%、85%、80%乙醇各2 min；切片進(jìn)入過氧化氫溶液孵育10 min；滴加蛋白修復(fù)液室溫放置10 min；滴加一抗，37 ℃放置1 h；滴加二抗，室溫放置10 min；滴加過氧化物酶室溫放置10 min；配制二氨基聯(lián)苯胺顯色劑搖勻，滴加顯色劑；蘇木精染液浸泡40 s，鹽酸溶液脫色，蒸餾水沖洗，80%、90%、95%乙醇各2 min，100%乙醇4 min，二甲苯4 min；樹膠封片，鏡檢。

1.6免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用半定量分級(jí)方法對(duì)鏡下的陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分[4]。陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張片子觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分比，0分：<5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%；陽性著色的強(qiáng)度，0分：無色，1分：淡黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。兩者分?jǐn)?shù)的乘積為陽性等級(jí)，陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～4分，陽性(++)：5～8分，強(qiáng)陽性(+++)：9～12分。

1.7實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測HIF-1α 根據(jù)Geneban中HIF-1α、GAPDH基因序列用引物設(shè)計(jì)軟件premier 5.0設(shè)計(jì)引物：HIF-1α:正向 5′-CGGCGAAGCAAAGAGTCTGAAG-3′,反向5′-GATGGTGAGCCTCATAACAGAAGC-3；GAPDH：正向 5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3′,反向 5′-TTCACACCCATCACAAACATG -3′。從液氮中取出保存的肝臟組織，用RNA提取試劑盒RNAprep pure Tissue Kit提取RNA后，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒TAKARA PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：取5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL與8 μL RNA混合，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。取cDNA以及待測基因Forword primer、Reverse primer及內(nèi)參GAPDH和β-actin Forword primer、Reverse primer為引物，依照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線分析結(jié)果，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。每個(gè)基因重復(fù)操作3次，運(yùn)用2-ΔΔCt分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 肝臟組織切片行免疫組織化學(xué)染色，HIF-1α主要在細(xì)胞核表達(dá)，對(duì)照組和單純照射組HIF-1α呈低表達(dá)，免疫組織化學(xué)結(jié)果為陰性，幾乎沒有核深染(圖1a)，經(jīng)過低壓低氧處理的大鼠肝臟經(jīng)過免疫組織化學(xué)后可見大片細(xì)胞核深染(圖1b、1c、1d)。各組切片HIF-1α表達(dá)的情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.793，P<0.001)，與對(duì)照組相比，3 000 m、4 000 m、5 000 m預(yù)處理+照射組HIF-1α表達(dá)均增高(P<0.01)，與單純照射組相比，3 000 m、4 000 m、5 000 m預(yù)處理+照射組HIF-1α表達(dá)均增高(P<0.01)，見表1。

2.2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果 各組HIF-1α mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與對(duì)照組相比，單純照射組HIF-1α mRNA表達(dá)降低，3 000 m、4 000 m、5 000 m預(yù)處理+照射組HIF-1α mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，3 000 m、4 000 m、5 000 m預(yù)處理+照射組高于單純照射組，4 000 m、5 000 m預(yù)處理+照射組高于3 000 m預(yù)處理+照射組，5 000 m預(yù)處理+照射組高于4 000 m預(yù)處理+照射組(P<0.05)，見表2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HIF-1α mRNA的表達(dá)與海拔高度呈正相關(guān)(r=0.977，P<0.001)。

a：HIF-1α的表達(dá)(-)；b：HIF-1α的表達(dá)(+)；c：HIF-1α的表達(dá)(++)；d：HIF-1α的表達(dá)(+++)

表1 各大鼠肝臟HIF-1α表達(dá)情況的比較 (只)

HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α

組別只數(shù)HIF-1αmRNA對(duì)照組101.00單純照射組100.91±0.58a3000m預(yù)處理+照射組104.46±0.29ab4000m預(yù)處理+照射組105.80±0.88abc5000m預(yù)處理+照射組108.31±1.60abcdF值17.306P值<0.001

HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α；a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與單純照射組比較，P<0.05；c與3 000 m預(yù)處理組+照射組比較，P<0.05；d與4 000 m預(yù)處理組+照射組比較，P<0.05

3 討 論

HIF與胚胎發(fā)育、組織生長、新陳代謝及凋亡等過程有關(guān)[5]，在細(xì)胞和組織適應(yīng)缺氧中扮演重要角色[6]。HIF-1包括HIF-1α和HIF-1β，HIF-1α強(qiáng)烈依賴于氧，缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)增加，主要表現(xiàn)為蛋白水平增加[7]。HIF-1α和HIF-2α是機(jī)體在低氧條件下應(yīng)對(duì)氧氣濃度變化的轉(zhuǎn)錄因子，低氧時(shí)HIF-1α和HIF-2α可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮素1、促紅細(xì)胞生成素和一氧化氮合酶等基因表達(dá)[8]。HIF-1α對(duì)腦缺血后血管再生以及促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立、挽救半暗區(qū)腦組織發(fā)揮重要作用，而以血管內(nèi)皮生長因子的作用最具有代表性[9-10]。Nakayama等[11]研究表明，巨噬細(xì)胞中的HIF-1α在促進(jìn)血管炎癥和血管重塑過程中起關(guān)鍵作用，如果巨噬細(xì)胞內(nèi)HIF-1α活性降低可能阻止血管重構(gòu)的進(jìn)程，HIF-1α可能是血管疾病治療的靶點(diǎn)。HIF-1α在受傷的神經(jīng)元中表達(dá)并有助于促進(jìn)軸突再生，低氧誘導(dǎo)HIF-1α可促進(jìn)感覺神經(jīng)元體內(nèi)外軸突再生，低氧也可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生，加速神經(jīng)肌肉接頭再支配，是神經(jīng)元再生過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[12]。Mochizuki等[13]研究證實(shí)，肝星形細(xì)胞和HIF-1α一起作用能清除肝臟壞死的肝細(xì)胞，且肝星形細(xì)胞還能調(diào)節(jié)急性肝損傷巨噬細(xì)胞的表型。在哺乳動(dòng)物機(jī)體功能缺氧條件下，高表達(dá)的HIF-1對(duì)腎臟發(fā)揮雙重作用：一方面通過調(diào)節(jié)重組人結(jié)締組織生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等損害腎功能；另一方面通過促進(jìn)腎臟組織細(xì)胞代謝、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)、增強(qiáng)腎臟對(duì)缺氧的適應(yīng)能力、減輕腎臟損傷發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用[14]。

低氧適應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗損傷重要的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制之一[15]。HIF-1α可調(diào)控多種缺氧相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而減輕機(jī)體對(duì)缺氧造成的損傷[16]。HIF-1α通路被認(rèn)為是多種應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)通路，包括缺血、缺氧和氧化應(yīng)激[17]，能促進(jìn)糖酵解，提高氧利用率，促進(jìn)紅細(xì)胞增殖，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)缺血組織和細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[18]。本研究免疫組織化學(xué)法可見經(jīng)過IHHP處理后的大鼠肝臟HIF-1α高表達(dá)，細(xì)胞核深染，處理的海拔高度越高，HIF-1α的表達(dá)越高，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果顯示，HIF-1α的表達(dá)隨著海拔高度的增高而增加，說明氧濃度越低，缺氧的程度越重，HIF-1α表達(dá)越高。細(xì)胞對(duì)氧水平降低的反應(yīng)是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HIF-1來調(diào)控的。HIF-1α具有氧依賴性，常氧條件下，細(xì)胞質(zhì)合成的HIF-1α通過26S蛋白酶體降解，低氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定，同時(shí)HIF-1α降解過程受到抑制，HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯增加[19]，低氧可增加HIF-1α蛋白的活性和穩(wěn)定性，復(fù)氧后HIF-1α蛋白迅速降解[20]。氧依賴降解結(jié)構(gòu)域的脯氨酸容易發(fā)生羥化，并與希佩爾林道蛋白結(jié)合而被蛋白酶體降解。低氧或缺氧時(shí)，HIF-1α聚積并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成聚合體，激活對(duì)其敏感的靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起組織細(xì)胞一系列的耐氧適應(yīng)性反應(yīng)[21]。HIF-1α在正常氧含量狀態(tài)下不易檢測，在缺氧誘導(dǎo)下表達(dá)增強(qiáng)，因此HIF-1α在組織局部的表達(dá)可作為評(píng)價(jià)組織缺氧情況的指標(biāo)[22]。然而，HIF-1α的過表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致氧自由基生成增加、細(xì)胞凋亡和器官損傷[23]。

綜上所述，HIF-1α的表達(dá)與氧濃度密切相關(guān)，氧濃度越低，HIF-1α的表達(dá)越高，HIF-1α可以調(diào)控多種缺氧靶基因，如何掌握好缺氧濃度、缺氧時(shí)間，使HIF-1α更好地發(fā)揮低氧處理的保護(hù)作用是今后研究的重點(diǎn)。