氫分子對高脂飲食C57BL/6小鼠肝臟保護作用及其分子機制的研究

駱瑩瑩，袁點，駱倩倩，吳秀秀，王大新

(1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院 a.心功能檢查科,b.實驗中心，江蘇 揚州 225009；2.濱州醫(yī)學院實驗教學管理中心，山東 煙臺 264003)

21世紀以來，隨著生存環(huán)境及人們生活方式的變化，全球肥胖的發(fā)生率呈上升趨勢，與肥胖相關疾病(動脈粥樣硬化、脂肪肝、2型糖尿病、高血壓、膽石癥等)的患病率也急劇升高，成為嚴重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖主要表現(xiàn)為體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常、體重增加和能量代謝平衡失調(diào)，肝臟是機體調(diào)控糖脂代謝的主要器官，在肥胖癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),大約80%的肥胖癥患者存在非酒精性脂肪肝[3]。肝臟通過多種途徑和多種反應通路調(diào)節(jié)脂代謝，機體脂質(zhì)含量過多時引起肝脂代謝紊亂，脂肪在肝臟堆積，損害肝臟的抗氧化系統(tǒng)，導致脂質(zhì)過氧化，引起氧化應激損傷和炎癥因子的釋放，進一步加重肝臟的損傷和與其相關疾病的發(fā)生，形成惡性循環(huán)，即目前的“二次打擊學說”機制[4-5]。

氫分子被認為是一種新型抗氧化劑，與維生素C或維生素E等其他抗氧化劑相比，氫分子呈電中性，且更小，迅速擴散到組織和細胞，并且能夠選擇性減少氧化應激中具有細胞毒性化學物質(zhì)，如羥基自由基和過氧亞硝基陰離子[6]。研究表明，氫分子作為一種抗氧化劑，不僅可以減少氧化應激，還可通過調(diào)脂、抗炎、抗凋亡等多種途徑發(fā)揮生物效應[7]。本研究主要探討氫分子對高脂飲食C57BL/6小鼠肝臟的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和儀器 清潔級4周齡健康雄性C57BL/6小鼠50只，體重(13.2±0.9)g，由揚州大學農(nóng)學院提供[合格證號scxk(蘇2012-0004)]。富氫水購自北京活力氫源生物科技有限公司，4 ℃保存。Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；電子天平PL-203[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；超聲細胞粉碎機JY92-IIn(寧波新芝生物)；臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R[力康生物醫(yī)療科技控股有限公司力新儀器(上海)有限公司]；純水儀FBZ2001-UP-P(青島富勒姆科技)；渦旋混合器TYXH-II(南京天悅電子技術有限公司)；超低溫冰箱DW-86L626(海爾集團公司)；水浴鍋TL-420D(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司)；微量紫外分光光度計GENE QUANT 100(美國GE公司)；萊卡烤片機RM2145型(德國萊卡設備有限公司)；石蠟切片機RM2145型(德國萊卡設備有限公司)；光學顯微鏡BX51型(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備與實驗分組 4周齡C57BL/6健康雄性小鼠50只，放置23 ℃、通風條件良好、50%濕度及12 h晝夜交替照明時間的動物房內(nèi)，分籠喂養(yǎng)、給予高脂飲食適應喂養(yǎng)1周，剔除體重增長不明顯的小鼠，選取平均體重增長率一致的小鼠20只，依據(jù)隨機數(shù)字法分為富氫水組和對照組，每組10只，并繼續(xù)給予高脂飲食。每日下午17：00 富氫水組腹腔注射富氫水10 mL/(kg·d)，對照組注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/(kg·d)，共計8周，每周更換一次新的玉米芯墊料，固定時間稱量小鼠體重。處死小鼠前12 h禁食，自由飲水，更換新墊料。內(nèi)眥取血，離心后取上清得到小鼠血漿，分裝保存；取小鼠肝臟，應用預冷0.9%氯化鈉溶液清洗雜物，平均取三份放于凍存管內(nèi)迅速置于液氮中速凍，剩余一份用4%多聚甲醛固定。

1.2.2小鼠體重增長率的測定 小鼠體重增長率=(實驗結束時體重-實驗前體重)/實驗前體重。

1.2.3小鼠血脂指標測定 采用酶比色法檢測兩組小鼠血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。操作過程嚴格參照TC、TG、LDL-C和HDL-C試劑盒(南京中生北控生物科技有限公司)說明書進行。

1.2.4小鼠氧化指標測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定兩組超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)的活力；采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平。操作過程嚴格參照MDA和SOD試劑盒(南京建成生物科技有限公司)說明書進行。

1.2.5肝臟細胞學形態(tài)觀察 取小鼠肝組織，行4%多聚甲醛固定,常規(guī)包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE)，各組隨機選取5只小鼠的玻片于100倍和400倍倒置顯微鏡下隨機選取3～5個視野，觀察肝臟細胞學形態(tài)變化。

1.2.6小鼠肝組織炎癥因子蛋白含量測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定兩組小鼠肝組織中白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-10及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的蛋白含量，嚴格參照組織IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司)，IL-6、IL-8、和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(上海豐翔生物科技有限公司)進行操作。

2 結 果

2.1兩組小鼠體重增長率的比較 富氫水組小鼠體重增長率低于對照組[(0.73±0.06)%比(1.06±0.09)%](t=9.638，P<0.001)。

2.2兩組小鼠血脂指標比較 富氫水組TC、TG、LDL-C水平低于對照組(P<0.05)，HDL-C水平高于對照組(P<0.001)，見表1。

組別只數(shù)TCTGLDL-CHDL-C對照組 104.61±0.791.13±0.204.45±0.863.71±0.30富氫水組103.11±0.340.92±0.233.07±0.466.74±0.96t值4.3672.2164.0756.437P值0.0010.0400.001<0.001

TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；對照組：高脂飲食+腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/(kg·d)；富氫水組：高脂飲食+腹腔注射富氫水10 mL/(kg·d)

2.3兩組小鼠氧化指標比較 富氫水組MDA低于對照組，SOD顯著高于對照組(P<0.001)，見表2。

組別只數(shù)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)對照組 101.02±0.10268.78±12.90富氫水組100.71±0.05347.73±12.02t值5.5217.785P值<0.001<0.001

MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；對照組：高脂飲食+腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/(kg·d)；富氫水組：高脂飲食+腹腔注射富氫水10 mL/(kg·d)

2.4肝臟HE染色 HE染色結果顯示，富氫水組小鼠肝組織完整，肝索排列整齊，肝竇正常，肝細胞未有明顯損傷，核結構非常清晰；對照組小鼠肝索排列較為紊亂，一半以上區(qū)域有脂肪浸潤現(xiàn)象，并有明顯的脂肪滴顯現(xiàn)，肝細胞體積增大，細胞核被推向周邊。見圖1。

HE:蘇木精-伊紅染色；a.富氫水組小鼠脂肪組織HE染色圖片(100×)；b.富氫水組小鼠脂肪組織HE染色圖片(400×)；c.對照組小鼠脂肪組織HE染色圖片(100×)；d.對照組小鼠脂肪組織HE染色圖片(400×)

圖1 富氫水組和對照組小鼠脂肪組織HE染色圖片

2.5兩組小鼠炎癥因子蛋白含量的比較 富氫水組IL-6、IL-8、TNF-α低于對照組，IL-10高于對照組(P<0.05)，見表3。

組別只數(shù)IL-6(μg/L)IL-8(ng/L)IL-10(ng/L)TNF-α(μg/L)對照組 10108.7±6.097.3±1.7206.7±15.6368.0±15.0富氫水組1088.4±8.490.4±4.1267.7±22.4337.7±14.0t值6.2363.7514.9973.297P值<0.0010.0080.0010.011

IL:白細胞介素；TNF-α:腫瘤壞死因子-α；對照組：高脂飲食+腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/(kg·d)；富氫水組：高脂飲食+腹腔注射富氫水10 mL/(kg·d)

3 討 論

肥胖是全球最常見的流行病之一，其病理生理機制與氧化應激、脂代謝紊亂及胰島素抵抗和炎癥反應等密切相關[8]。自2007年Ohsawa等[6]發(fā)現(xiàn)吸入2%的氫氣能夠治療大鼠腦缺血再灌注損傷以來，氫分子被證明對多種疾病有很好的治療作用[9]，但其分子機制目前尚未明確。

高脂飲食引起的肥胖尤其是內(nèi)臟型肥胖，是引發(fā)胰島素抵抗的主要因素，胰島素抵抗導致血漿中非酯化脂肪酸增高，線粒體β氧化速度增快，活性氧類物質(zhì)產(chǎn)出增加。當超過肝臟抗氧化物質(zhì)的清除能力時則導致活性氧類物質(zhì)蓄積，過多的活性氧類物質(zhì)可直接損害線粒體膜DNA，也可與膜磷脂不飽和脂肪酸發(fā)生反應，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，生成酮、醛、醚等，通過作用于線粒體 DNA，抑制呼吸鏈的電子傳遞，進一步加速了反應性氧化產(chǎn)物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)[10]。MDA是體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)，衡量脂質(zhì)過氧化的可靠指標[11]。SOD以氧自由基為底物，能有效地清除負氧離子，阻斷細胞毒性更強的羥自由基產(chǎn)生，減輕氧自由基對細胞的損傷[12]。Shingu等[13]通過對MDA、8-輕基脫氧鳥苷、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的水平進行檢測證明了氫氣通過減輕氧化應激水平使得腎臟缺血再灌注損傷得到明顯改善。本研究結果顯示，富氫水組小鼠肝臟MDA水平低于對照組，SOD的活性高于對照組，說明富氫水通過抗氧化作用減輕高脂飲食小鼠肝臟的氧化應激反應。

高脂飲食時，由于攝入能量增加，不僅使血漿中非酯化脂肪酸增多，肝臟攝取的非酯化脂肪酸也增加，進而導致極低密度脂蛋白中TG水平增加和肝臟脂肪沉積，富含TG的極低密度脂蛋白在肝脂肪酶的作用下分解，產(chǎn)生小而致密的LDL，這種脂蛋白較易氧化形成氧化型低密度脂蛋白。高三酰甘油血癥又會引發(fā)其他脂蛋白代謝紊亂。正常生理狀態(tài)下，各種血漿脂蛋白之間由膽固醇脂轉(zhuǎn)運蛋白和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白介導膽固醇脂與TG的平衡。當血清中TG升高，膽固醇脂轉(zhuǎn)運蛋白的水平也升高，膽固醇脂轉(zhuǎn)運蛋白介導的膽固醇脂優(yōu)先從HDL轉(zhuǎn)運到更大的極低密度脂蛋白膽固醇顆粒中，并交換其中的TG，使HDL-C水平下降[14]。HDL-C具有抗動脈粥樣硬化的生物特性，其作用包括抗氧化、抗炎、減少細胞膽固醇流出等活性，其中提高細胞膽固醇流出是HDL-C的重要保護機制之一，同時它還可減輕炎癥、氧化應激等反應對LDL的損害[15]。本研究通過檢測小鼠血脂水平發(fā)現(xiàn)，富氫水組小鼠血漿中TC、TG和LDL-C水平低于對照組，HDL-C高于對照組，說明氫分子能夠調(diào)控高脂飲食誘導的小鼠血漿脂質(zhì)含量。為了進一步觀察肝臟中脂質(zhì)含量，對肝臟組織進行HE染色，結果顯示富氫水組小鼠較對照組肝組織完整，肝索排列整齊，肝竇正常，肝細胞未有明顯損傷，核結構非常清晰，脂滴含量明顯減少，說明氫分子可減輕脂肪在肝臟中的沉積。Zong等[16]證明氫分子能夠顯著降低LDL中載脂蛋白B100、載脂蛋白B48和極低密度脂蛋白中主要載脂蛋白E的水平，并且保護HDL顆粒的功能，包括刺激巨噬泡沫細胞膽固醇流出及防止LDL氧化的能力，可能從分子層面更深入的解釋本研究結果。

高脂飲食引起的單純性脂肪肝是一種以低濃度全身炎癥為特征的炎癥紊亂狀態(tài)[17]。有研究結果顯示，單純性脂肪肝患者外周血中的炎癥因子(IL-6、TNF-α、C反應蛋白等)顯著增加，這些患者常伴有脂肪組織和肝臟的輕度炎癥[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，利用結扎左冠狀動脈前降支血管制作的心肌梗死模型大鼠在腹腔注射富氫鹽水后，可顯著減少缺血再灌注所致的心肌梗死面積，證實了富氫鹽水對心肌的保護作用與降低心臟組織炎癥因子水平、氧化應激損傷相關[19]。為闡明氫分子對高脂飲食引起的小鼠肝臟炎癥反應的影響，本研究檢測炎癥因子IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α發(fā)現(xiàn)，富氫水組肝臟IL-6、IL-8和TNF-α低于對照組，抗炎因子IL-10高于對照組，說明富氫水具有減輕高脂飲食小鼠肝臟炎癥反應的作用。目前尚無氫分子在有效濃度范圍內(nèi)具有毒性的報道，過量的氫分子可通過肺呼出體外[20]。氫分子分子量較小，可快速擴散進入組織并到達如線粒體和細胞核等重要的靶向亞細胞結構，可保護DNA免于氧化損傷[21]。

綜上所述，氫分子作為一個重要的糖脂代謝調(diào)控子，可調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠血脂水平，并且減少肝臟脂質(zhì)沉積，其分子機制可能與抑制氧化應激反應及炎癥反應密切相關。與傳統(tǒng)藥物相比，富氫水制備方便，且花費較低，因此有可觀的應用前景。