白細(xì)胞介素8對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制*

蘭 蕙 黃 婷 韓垠超 王琳琳 葉麗平，2

（錦州醫(yī)科大學(xué)，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)生理學(xué)教研室，2 生物人類學(xué)研究所，錦州 121000）

宮頸癌是威脅全世界女性健康及生命的主要惡 性腫瘤之一，目前其發(fā)病率占女性惡性腫瘤第4位[1]，宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因。白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌和血液惡性腫瘤等多種腫瘤的起始和發(fā)展中起著不可忽視的作用[2]。PI3K/AKT 信號通路是目前誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition）的關(guān)鍵因素之一，促進(jìn)EMT 間質(zhì)性標(biāo)記物波形蛋白（vimentin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)增加，上皮性標(biāo)記物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少。IL-8 能否通過PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬從細(xì)胞分子水平探討IL-8 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制，為闡明宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料及分組

宮頸癌細(xì)胞株Caski（購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；LY294002（美國APEXBIO 公司）；Matrigel 基底膠（BD 公司）；Transwell 小室（康寧生物技術(shù)有限公司）；IL-8、抗磷酸化和非磷酸化 AKT 抗體、兔抗人 E-cadherin、兔抗人β-catenin 抗體、鼠抗人vimentin 抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司）；MTT 液（Solarbio 公司）；胎牛血清（美國CLARK Bioscience 公司）BCA 蛋白定量試劑盒（美國SAB 生物科技有限公司）；二甲基亞砜（美國Sigma 公司）。根據(jù)IL-8 不同濃度分為對照組 、IL-8 組（20、40、60、80、100 ng/mL）、IL-8+LY294002 組（80 ng/mL IL-8 +20 μmol/L LY294002）和LY294002 組（20 μmol/L）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力

對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，接種于96 孔平底板且每孔加入100 μL，邊緣孔用無菌PBS 填充。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底后按照不同的濃度梯度加藥，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。放置CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后每孔加入20 μL MTT 溶液，4h 后終止培養(yǎng)。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm 處測量各孔的吸光值。

細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力

用記號筆在6 孔板背后約每間隔1 cm 均勻劃橫線，每孔穿過5 條線。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每孔加入1×106個(gè)濃度的細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%，用槍頭劃線（盡量垂直于背后的橫線）。PBS 清洗3 遍，以便去除漂浮的細(xì)胞。拍照記錄0、24 h 劃痕寬度的變化，用Image J 軟件計(jì)算愈合率。劃痕愈合率=（原始寬度-24 h 后寬度）×100%/原始寬度

1.4 Transwell 檢測細(xì)胞的遷移能力

Matrigel 膠與1640培養(yǎng)液按1：9稀釋后，50 μL 加入各上室，孵育3 h。將對數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105/mL，接種于上室，12 h 后按照實(shí)驗(yàn)分組加藥，孵育箱培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入含4%福爾馬林的下室固定15 min，蘇木精染色20 min 后，顯微鏡下對5 個(gè)不同視野中穿過膜的細(xì)胞計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 免疫印跡檢測

待細(xì)胞融合至80%后，于冰上刮下細(xì)胞，離心棄上清。加入蛋白裂解液冰上裂解30 min 后于4℃、12 000 r/min，離心20 min，取上清。BSA 法測定蛋白濃度。制備10%分離膠和5%濃縮膠。300 伏恒定電壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠底部時(shí)終止電泳，15 伏恒定電壓轉(zhuǎn)膜20 min。取出PVDF 膜放入5%的脫脂奶粉中封閉2 h 后，TBST 清洗2 次，分別加入兔抗人E-cadherin 抗體（濃度為1∶1000）、兔抗人β-catenin 抗體（濃度為1∶1000）、鼠抗人vimentin 抗體（濃度為1∶1000），4℃搖床過夜。用TBST 清洗3 次，每次10 min，加入相應(yīng)的稀釋二抗，室溫?fù)u床1.5 h?；瘜W(xué)凝膠成像發(fā)光儀掃描。

2 結(jié)果

2.1 IL-8 對細(xì)胞增殖的影響

IL-8 對宮頸癌細(xì)胞的增殖呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但80 ng/mL 和100 ng/mL 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。IL-8+LY294002 組及LY294002 組細(xì)胞的增殖率低于IL-8 組（80ng/mL）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）（表1）。

表1 IL-8 對Caski 細(xì)胞增殖的影響（n=6，±s）Tab1 Effect of IL-8 on proliferation of Caski cells（n=6，±s）

表1 IL-8 對Caski 細(xì)胞增殖的影響（n=6，±s）Tab1 Effect of IL-8 on proliferation of Caski cells（n=6，±s）

**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs IL-8 group

Group Cell proliferation rate（%）Absorbency value Control 0 0.182±0.008 IL-8（20 ng/mL）138.52 0.252±0.180**IL-8（40 ng/mL）194.09 0.352±0.012**IL-8（60 ng/mL）226.87 0.412±0.230**IL-8（80 ng/mL）283.79 0.516±0.024**IL-8（100 ng/mL）271.35 0.492±0.017 IL-8+LY294002 207.84 0.378±0.062△△LY29400 63.53 0.120±0.010△△

2.2 IL-8 對細(xì)胞侵襲能力的影響

與對照組（12.84%±2.16%）相比，加入IL-8（80 ng/mL），侵襲能力明顯增強(qiáng)（67.33%± 3.27%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。IL-8+LY294002 組（44.54%±2.04%）及LY294002組（9.07%±1.32%）侵襲能力低于IL-8（80 ng/mL）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）

2.3 IL-8 對細(xì)胞遷移的影響

IL-8（80 ng/mL）組穿透的細(xì)胞數(shù)高于對照組。而IL-8+LY294002 組穿透細(xì)胞的數(shù)低于IL-8 組（80 ng/mL），LY294002 組穿透細(xì)胞的數(shù)低于對照組（圖2）。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)0 h（A1～D1）、24 h（A2～D2）細(xì)胞侵襲情況，普通顯微鏡，×200 Fig1 Cell invasion in the scratch test at 0 h（A1-D1）and 24 h（A2-D2），normal microscopy，×200

2.4 IL-8 對AKT、vimentin、β-catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

IL-8 組（80 ng/mL）與對照組相比，β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表達(dá)量增加，E-cadherin 蛋白表達(dá)量減少（P＜0.01）。與IL-8 組（80 ng/mL）相比，IL-8+LY294002 后β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表達(dá)量明顯降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)量增加（P＜0.01）。與對照組相比，LY294002 組β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表達(dá)量明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）（圖3）

圖3 IL-8 和LY294002 對細(xì)胞t-AKT 、p-AKT、vimentin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響Fig3 Effect of IL-8 and LY294002 on the expression of t-AKT，p-AKT，vimentin，β-catenin，E-cadherin protein in cells

3 討論

IL-8與2個(gè)特異性7跨膜G蛋白偶聯(lián)受體即CXCR-1和CXCR-2結(jié)合后通過JAK2/STAT3/Snail[3]途徑和PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[4-5]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在組織水平上，IL-8在宮頸癌組織的表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織[6]。目前，IL-8促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是否與PI3K/AKT信號通路有關(guān)并不十分清楚。

上皮細(xì)胞中AKT 水平激活能夠減少細(xì)胞間黏附力，減少細(xì)胞極性并且誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，改變上皮 細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布，參與腫瘤細(xì)胞的EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[7]。而vimentin 作為EMT 的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白在發(fā)生EMT 時(shí)表達(dá)量增加，其表達(dá)還與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，患者5年生存率顯示，vimentin 蛋白高表達(dá)的宮頸癌患者預(yù)后最差，陰性表達(dá)的患者預(yù)后較好[8]。在正常細(xì)胞中[9]，β-catenin大部分位于細(xì)胞膜上，參與E-cadherin/β-catenin 復(fù)合體的形成，維持細(xì)胞間的黏附作用。在發(fā)生腫瘤的情況下[10]，Wnt 信號通路被激活，切斷β-catenin的降解途徑，使β-catenin 在細(xì)胞內(nèi)蓄積并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，與細(xì)胞核內(nèi)的T 細(xì)胞因子淋巴樣增強(qiáng)因子相互作用，結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)控下游基因cyclinD1、C-myc、Snail 等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[11]，使vimentin 表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)減少。

本研究結(jié)果顯示與對照組相比，在IL-8 作用下宮頸癌細(xì)胞的增殖速度和遷移速度均加快，侵襲能力增強(qiáng)。IL-8 作用下P-AKT、vimentin、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 蛋白表達(dá)下降，但AKT總蛋白表達(dá)量不變，使用PI3K/AKT 信號通路抑制劑LY294002 后IL-8 的上述作用被阻斷。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)中外源性IL-8 可能通過促進(jìn)AKT 磷酸化，激活了PI3K/AKT 通路，從而使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生遷移及侵襲。當(dāng)應(yīng)用抑制劑LY294002 后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白的表達(dá)增加而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin 和β-catenin 蛋白的表達(dá)減少，進(jìn)一步說明PI3K/AKT 信號通路在IL-8 促進(jìn)宮頸癌遷移及侵襲中發(fā)揮著重要作用。本研究初步探討了IL-8 對宮頸癌細(xì)胞致癌潛能的影響及部分作用機(jī)制，為臨床診斷治療宮頸癌提供新的靶點(diǎn)，以期更深入探討IL-8在宮頸癌中的作用機(jī)制。