七氟烷對心肌缺血再灌注內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1和E-選擇素表達(dá)的影響

李碩鵬 王洪武 王鶴昕

（泰達(dá)國際心血管病醫(yī)院麻醉科，天津 300457）

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)是治療心血管疾病最有效的方法，然而血管再通后的缺血再灌注損傷會(huì)使患者病情惡化，甚至引起患者死亡[1]。缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）早期血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重?fù)p傷是構(gòu)成IRI 的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞是IRI時(shí)氧自由基、黏附分子和其他生物活性物質(zhì)的來源。麻醉藥物七氟烷具有誘導(dǎo)起效快和麻醉深度易調(diào)控等特點(diǎn)[2]，許多研究表明七氟烷對心血管抑制反應(yīng)較輕，且有一定的心肌保護(hù)作用[3-5]，七氟烷預(yù)處理能夠抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分 子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)[6]。在缺血再灌注影響下，內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion，molecule-1，VCAM-1）和E-選 擇素表達(dá)顯著升高，介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞的大量浸潤和對心肌組織的損傷。因此，本研究擬建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探討七氟烷對內(nèi)皮細(xì)胞3 種促炎分子表達(dá)的影響，為心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，購于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)公司（許可證號：SCXK（京）2016-001）；TUNEL染色試劑盒批號：6432344001）購于瑞士羅氏公司；CD68（批號：ab125212）、ICAM-1（批號：ab171123）、VCAM-1（批號：ab134047）和E-選擇素（批號：ab18981）抗體購于美國Abcam 公司；蘇木精（批號：322350）和伊紅（批號：ZLI-9613）染色試劑購于北京中杉金橋公司；七氟烷購于恒瑞醫(yī)藥公司。

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立

大鼠心肌缺血再灌注模型的建立參考文獻(xiàn)[7]。采用1%戊巴比妥鈉麻醉后，切開大鼠氣管，連接呼吸機(jī)，維持大鼠的正常呼吸和體溫，并監(jiān)測動(dòng)脈血壓。沿第5 肋間切開左胸，輕輕剝開心包，根據(jù)部位分為起始段、左心緣段和遠(yuǎn)段。缺血 30 min 后，松開夾閉的血管。實(shí)驗(yàn)共分為3 組，每組10 只：假手術(shù)組（對照組，不夾閉動(dòng)脈）、缺血再灌注損傷組（I/R 組，缺血30 min 后，再灌注4 h）和七氟烷組（缺血27 min 時(shí)，讓大鼠吸入2.5%的七氟烷，持續(xù)吸入5 min；缺血30 min 時(shí)松開血管，再灌注4 h）。通過監(jiān)測儀器，記錄各組大鼠手術(shù)前、缺血15 min 和再灌注4 h 的心率、平均動(dòng)脈壓和心率-收縮壓乘積（RPP ）。在冠狀動(dòng)脈處每隔3～ 4 mm 取材。

1.3 檢測ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)

收集各組大鼠的心肌組織（體積約0.1 cm3）和冠狀動(dòng)脈（長約0.5 cm），10%福爾馬林固定后，進(jìn)行石蠟切片，一部分組織進(jìn)行H-E 顯色，一部分組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，簡述如下：石蠟切片脫蠟，用3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，用PBS 浸泡5 min，采用5%山羊血清室溫封閉10 min，棄去血清，滴加以1：100 比例稀釋的CD68 一抗、ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素多克隆抗體4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗5 次，每次3 min，滴加以 1：1 000 稀釋的二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔IgG）37℃孵育15～20 min。DAB 顯示工作液在光鏡下顯色5 min，自來水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察。美國Diagnostic Instrument Inc spot-Ⅱ數(shù)碼成相系統(tǒng)拍照；每組選取6 例，Univerval Imaging Corporation MetaMorph 圖像分析系統(tǒng)對免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果（光密度值）進(jìn)行定量分析。以其光密度值變化來表示ICAM-1 和VCAM-1 蛋白表達(dá)及E-選擇素的變化。其中心肌組織檢測CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)目，TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞的比例，冠狀動(dòng)脈進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析和Bonferroni 后續(xù)檢驗(yàn)，2 組之間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

手術(shù)前對照組、I/R 組和七氟烷組之間心率、平均動(dòng)脈壓和RPP 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺血15 min 時(shí)，與對照組比較，I/R 組和七氟烷組平均動(dòng)脈壓顯著下降（P＜0.05），同時(shí)RPP 也降低明顯（P＜0.05）；缺血4 h 時(shí)，七氟烷組平均動(dòng)脈壓和RPP 均有所上升，相對于I/R 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.2 七氟烷抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)

與對照組比較，I/R 組內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）。七氟烷則能夠有效抑制I/R 引起的內(nèi)皮細(xì)胞促炎分子的表達(dá)，與I/R 組比較，七氟烷組內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）（圖1）。

2.3 七氟烷抑制心肌組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤

對照組CD68+巨噬細(xì)胞為5.83 個(gè)/高倍視野（HPF），I/R 組數(shù)目為55.67 個(gè)/HPF，2 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；七氟烷組CD68+巨噬細(xì)胞為18.67 個(gè)/HPF，七氟烷能夠顯著減少巨噬細(xì)胞的浸潤，相對于I/R 組，巨噬細(xì)胞占比降低了66.46%（P＜0.01）（圖2）。

表1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況（±s）Tab1 Changes in hemodynamic indicators（±s）

表1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況（±s）Tab1 Changes in hemodynamic indicators（±s）

*P＜0.05 vs control group ；#P＜0.05 vs I/R group

Group Heart rate（times）Preoperation 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Control group 367.3±41.3 364.6±51.3 372.4±54.2 I/R group 374.9±38.4 371.5±46.9 384.3±56.2 Sevoflurane group 366.2±35.9 374.6±46.6 369.5±44.4 Group Mean arterial pressure（mmHg）RPP（mmHg/min×103）Preoperative 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Preoperative 15 min after ischemia 4 h after reperfusion Control group 121.3±13.4 122.4±12.6 121.7±13.1 46.4±5.3 48.6±6.9 43.5±5.6 I/R group 126.6±13.1 109.2±14.1* 68.9±11.2* 47.9±5.7 39.6±8.5* 27.3±4.5*Sevoflurane group 124.6±13.5 107.4±14.9* 94.3±11.9*# 45.9±5.9 40.1±7.4* 38.6±6.2*#

圖1 H-E 染色顯示冠狀動(dòng)脈的基本形態(tài)（A）和免疫組織化學(xué)檢測七氟烷抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1（B）、VCAM-1（C）和E-選擇素（D）的表達(dá)，×200。箭頭顯示陽性表達(dá)的部位；E：各組內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。**P＜0.01 vs 對照組；△△P＜0.01 vs I/R 組.Fig1 H-E staining showed the basic morphology of coronary artery（A）.Sevoflurane inhibited the expression of ICAM-1（B），VCAM-1（C）and E-selectin（D）in endothelial cells detected by immunohistochemisyry，×200.The arrow showed the positive expression site；E：Statistics of expression of ICAM1，VCAM1 and E-selectin in endothelial cells in each group.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs I/R group.

圖2 七氟烷抑制心肌組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤，×100。A1～C1：H-E 染色顯示心肌組織的基本病變；A2～C2：免疫組織化學(xué)檢測CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)目；箭頭示陽性表達(dá)的部位；A：對照組；B：I/R 組；C：七氟烷組.Fig2 Sevoflurane inhibited the infiltration of macrophages in myocardial tissue，×100.A1-C1：H-E staining showed the basic pathological changes of myocardial tissue; A2-C2：Immunohistochemical detection of the number of CD68+ macrophages；The arrow showed the positive expression site；A：Control group；B：I/R group；C：Sevoflurane group.

圖3 七氟烷抑制心肌細(xì)胞的凋亡，×100。TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞的數(shù)目；箭頭示陽性表達(dá)的部位；A：對照組；B：I/R 組；C：七氟烷組.Fig3 TUNEL staining was used to detect the number of apoptotic cells，×100.The arrow showed the positive expression site；A：Control group；B：I/R group；C：Sevoflurane group.

2.4 七氟烷抑制心肌細(xì)胞的凋亡

采用TUNEL 染色檢測了各組心肌細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示對照組心肌細(xì)胞凋亡率為2.20%，I/R 組為28.63%，2 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；七氟烷組心肌細(xì)胞凋亡率為13.81%，七氟烷能夠顯著降低凋亡細(xì)胞的比例，與I/R 組比較，降低了心肌細(xì)胞凋亡率的51.76%（P＜0.01，圖3）。

3 討論

飲食習(xí)慣的改變和生活水平的提高使得我國心血管疾病的發(fā)病率快速升高。通過外科手術(shù)或者介入方式再通堵塞的冠狀動(dòng)脈，恢復(fù)心臟正常供血是目前主要的治療手段[8]。相對于其他實(shí)體器官的手術(shù)，心臟手術(shù)更容易受到外界因素的影響，因此對于麻醉藥物的使用也更加謹(jǐn)慎。麻醉藥物的使用方式或者濃度不當(dāng)會(huì)引起患者出現(xiàn)心率不齊、心動(dòng)過速和心動(dòng)過緩等癥狀，嚴(yán)重者甚至引起患者死亡[9]。七氟烷是一種吸入麻醉藥物，相對于其他麻醉劑，具有誘導(dǎo)迅速、安全和吸入濃度易調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，因此正在心臟外科和小兒外科中迅速推廣[10]。此外，許多研究表明七氟烷還能夠降低心臟手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞抵御缺血缺氧等的損傷[11-13]。本研究結(jié)果顯示七氟烷能夠維持心缺血再灌注損傷后平均動(dòng)脈壓和RPP，這說明七氟烷可作為一種有效的麻醉方式應(yīng)用于心臟手術(shù)，特別是心臟移植等大型心臟手術(shù)的治療。

冠狀動(dòng)脈再通后引起的缺血再灌注損傷是引起心臟損傷的一個(gè)十分重要的機(jī)制[14]。炎癥細(xì)胞大量浸潤心肌組織中，可攻擊受損的心肌細(xì)胞，加劇心肌缺血缺氧后的進(jìn)一步損傷[15]。研究表明在再灌注初期吸入七氟烷可減少中性粒細(xì)胞的聚集并保護(hù)心功能，并且七氟烷預(yù)處理可上調(diào)缺血前NF-кB、TNF-α、IL-1β 的水平，而再灌注后NF-кB、TNF-α上調(diào)的幅度降低，縮小心梗范圍[16-17]，這說明七氟烷可通過改變抗炎因子的平衡而參與心肌的保護(hù)。本研究結(jié)果也顯示缺血再灌注損傷條件下，七氟烷能夠顯著減少巨噬細(xì)胞的浸潤，相對于I/R 組，巨噬細(xì)胞占比降低了66.46%，七氟烷則能夠有效抑制I/R 引起的內(nèi)皮細(xì)胞促炎分子的表達(dá)，與I/R 組比較，七氟烷組內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 和E-選擇素的表達(dá)均顯著下降，從而可誘導(dǎo)單核細(xì)胞結(jié)合和浸潤到心肌組織中，最終引起心肌細(xì)胞凋亡比例升高。心肌細(xì)胞是一種很難再生的終末分化細(xì)胞，損傷后心肌可發(fā)生重塑，引起患者長期出現(xiàn)心率失常等癥狀[18]。因此控制內(nèi)皮細(xì)胞分子的表達(dá)對于治療心缺血再灌注損傷具有十分重要的意義。

七氟烷還能引起活性氧增多，激活 PKC-α，后者移位到線粒體上，繼而上調(diào)磷酸化凋亡蛋白 Bcl-2 的水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡并改善能量代謝[19]。本實(shí)驗(yàn)TUNEL染色結(jié)果說明七氟烷能夠顯著降低凋亡細(xì)胞的比例，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，在明確七氟烷對缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的基礎(chǔ)上，在未來的研究中，應(yīng)側(cè)重于七氟烷對心肌細(xì)胞炎癥和凋亡的影響，并進(jìn)一步加強(qiáng)其作用機(jī)制的相關(guān)研究。