胍丁胺對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的治療效果

孫惠萍 徐惠娟 戴加樂(lè)

（浙江省榮軍醫(yī)院藥劑科，嘉興 314000）

各種原因?qū)е碌姆尾棵?xì)血管通透性增加及肺泡上皮細(xì)胞受損可導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）發(fā)生，若不及時(shí)處理可導(dǎo)致死亡[1]。由于發(fā)生機(jī)制不明，急性肺損傷死亡率一直居高不下。在急性肺損傷的發(fā)生過(guò)程中，嚴(yán)重的氧化應(yīng)激及炎癥損傷是導(dǎo)致肺組織發(fā)生過(guò)度炎癥重要因素之一[2]。因此，開(kāi)發(fā)可控制肺組織氧化應(yīng)激及炎癥損傷的藥物是治療急性肺損傷的研發(fā)方向。胍丁胺是一種具有抗炎及抗氧化作用的內(nèi)源性生物酶類物質(zhì)，主要分布于腦、肺等器官中[3]。新近研究表明，胍丁胺可通過(guò)抑制大腦中膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)；同時(shí)，也可通過(guò)降低炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等物質(zhì)的表達(dá)，對(duì)酵母多糖誘導(dǎo)的大鼠全身炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療作用[4-5]。胍丁胺作為一種潛在的抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的藥物，尚不清楚其是否也可應(yīng)用于急性肺損傷的治療過(guò)程中。因此，本研究構(gòu)建大鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷模型并予以不同劑量胍丁胺治療，評(píng)估其治療效果并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

6 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究中心；LPS（L2800）、胍丁胺硫酸鹽（A7127）購(gòu)自美國(guó)Sigma；大鼠IL-6 試劑盒（PI328）、大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（PT516）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（S0101）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（S0131）購(gòu)自碧云天上海有限公司。

1.2 急性肺損傷模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將60 只大鼠隨機(jī)分為4 組，每組15 只：對(duì)照組（Control 組）、單純模型組（LPS 組）、低劑量胍丁胺治療組（低劑量胍丁胺組）和高劑量胍丁胺治療組（高劑量胍丁胺組）。LPS 組、低劑量胍丁胺組和高劑量胍丁胺組大鼠采用腹腔注射 100 μL 的LPS（3 mg/kg），建立急性肺損傷模型，對(duì)照組注射等量PBS；低劑量胍丁胺組和高劑量胍丁胺組于LPS 注射前40 min，分別腹腔注射 6 mg/kg 胍丁胺和12 mg/kg 胍丁胺。

注射后每組隨機(jī)抽取10 只大鼠飼養(yǎng)7 d，用于觀察生存情況。在注射24 h 后，采集每組剩余5 只大鼠的肺組織標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.3 藥物治療大鼠生存率評(píng)估、肺部組織病理學(xué)觀察及濕重、干重測(cè)定

1.3.1 濕重/干重比測(cè)定及肺部組織病理學(xué)觀察 收集大鼠肺部右上葉組織用于濕重/干重比值：用PBS 沖洗肺組織2 次以去除表面殘血，用濾紙吸干水分后稱重，作為濕重（W）；隨后，將其置于70 ℃烤箱中蒸發(fā)水分至恒定重量，記為干重（D），計(jì)算W/D 比值并記錄。收集肺部右中葉于4 %多聚甲醛中進(jìn)行固定，隨后行H-E 染色，評(píng)估肺組織炎癥情況。

1.3.2 肺組織中 SOD 活性和MDA 含量測(cè)定 稱取100 mg 大鼠右下肺組織，使用PBS 沖洗后，加入預(yù)冷的1 mL RIPA 裂解液。使用Auto HG-24 plus 全自動(dòng)勻漿機(jī)研磨成組織勻漿。4 ℃，10 000 r/min 離心收集上清液用于SOD、MDA 試劑盒檢測(cè)，操作步驟依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 水平 在大鼠左肺支氣管插入灌洗針并結(jié)扎固定，分3 次將4.5 mL PBS 注入氣管中，停留2 min 后，回抽3.5 mL 作為肺泡灌洗液。4 ℃，3 000 r/min 離心收集上清液，分裝后用于檢測(cè)細(xì)胞因子。稱取100 mg 大鼠右下肺組織100 mg，研磨為組織勻漿，操作同1.3.2。勻漿后4 ℃，10 000 r/min 離心收集上清。使用商業(yè)試劑盒檢測(cè)組織液及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 含量，依照說(shuō)明書(shū)流程處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示；繪制Kaplan-Meier 生存曲線，并采用Log Rank 分析各組生存率；組間比較采用oneway ANOVA 進(jìn)行分析，組間兩兩比較采用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存率、肺部組織病理學(xué)觀察及W/D

LPS組大鼠的生存率明顯低于低劑量及高劑量胍丁胺組（P＜0.05），而低劑量和高劑量胍丁胺組之間的成活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。H-E染色顯示，與對(duì)照組比較，LPS組有肺泡間隔增厚，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)過(guò)低劑量及高劑量胍丁胺治療后，炎癥有所緩解（圖2）。與對(duì)照組比較，LPS組肺組織W/D明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與LPS組比較，低劑量及高劑量胍丁胺組的W/D下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.2 肺組織中SOD 活性和MDA 含量

與對(duì)照組比較，LPS 組的肺組織存在MDA 含量上升、SOD 活性下降的現(xiàn)象，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。經(jīng)不同劑量胍丁胺治療后，可顯著抑制MDA 含量上升、SOD 活性下降的現(xiàn)象，與LPS 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 肺組織中SOD 活性和MDA 含量（±s）Tab1 The activities of SOD and the contents of MDA in lung tissue（±s）

表1 肺組織中SOD 活性和MDA 含量（±s）Tab1 The activities of SOD and the contents of MDA in lung tissue（±s）

*P＜0.05 vs control group ；△P＜0.05 vs LPS group

SOD（U/mgprot）Control group 9.53±0.79 429.78±40.24 LPS group 20.14±1.02* 300.23±43.08*Low-dose agmatine group 15.53±2.09*△ 389.46±51.92*△High-dose agmatine group 14.86±1.36*△ 396.36±35.21*△Group MDA（nmol/mgprot）

2.3 肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 水平測(cè)定

肺組織結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS 組TNF-α、IL-6 水平明顯升高；而與LPS組比較，低、高劑量胍丁胺治療組的TNF-α、IL-6 水平下降，且具有劑量依賴效應(yīng)，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。肺泡灌洗液結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組的TNF-α、IL-6 水平明顯升高；而與LPS 組相比，低及高劑量胍丁胺治療組的TNF-α、IL-6 水平下降，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖1 各組生存率比較Fig1 Survival rate of each group

圖2 各組肺組織H-E 染色，標(biāo)尺=100 μmFig2 HE staining in lung tissues of each group，bar=100 μm

圖3 各組肺組織濕干比Fig3 Wet-dry ratio of lung tissues in each group

圖4 肺組織炎癥因子表達(dá)水平Fig4 Expression level of inflammatory factor in lung tissues

圖5 肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)水平Fig5 Expression levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid

3 討論

過(guò)度的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)可加重并導(dǎo)致急性肺損傷，故而采用相應(yīng)治療藥物控制此類患者體內(nèi)失衡的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是治療的關(guān)鍵。常規(guī)的激素類藥物雖可較好緩解患者病情，但存在較大的副作用，因此需開(kāi)發(fā)其他潛在藥物對(duì)其進(jìn)行治療。本研究探討胍丁胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷的治療效果，并評(píng)估肺組織中的反應(yīng)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)水平，旨在為胍丁胺的應(yīng)用奠定前期研究基礎(chǔ)。

生理?xiàng)l件下，左旋精氨酸在體內(nèi)相關(guān)酶的催化下脫羧基形成胍丁胺，廣泛分布于腦部及肺部等重要組織器官中[6]。胍丁胺不僅可通過(guò)與不同受體及離子通道結(jié)合來(lái)發(fā)揮抗焦慮作用，同時(shí)它也可通過(guò)抑制腦部的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)功能[7]。進(jìn)一步研究表明，在酵母多糖建立的全身炎癥模型中，胍丁胺可通過(guò)抑制小鼠體內(nèi)NO水平的升高，來(lái)發(fā)揮治療作用[5]。因此，胍丁胺是一種潛在的抗炎及抗氧化藥物，有希望用于急性肺損傷的治療過(guò)程中。本研究證實(shí)，在予以胍丁胺治療后，LPS 誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型的死亡率明顯降低，具有治療效果。肺組織H-E 染色等結(jié)果也顯示胍丁胺可抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)改善肺部炎癥。急性肺損傷導(dǎo)致肺水腫也是加重病情的重要因素，本研究結(jié)果顯示胍丁胺治療后肺組織W/D 減少，這表明胍丁胺可降低肺部血管通透性，減輕病理?yè)p傷?？紤]到常規(guī)急性肺損傷模型中的治療藥物以激素為主，過(guò)量使用時(shí)，具有較大副作用，而胍丁胺作為一種生理?xiàng)l件下的正常產(chǎn)物，其在安全性上具有更多優(yōu)勢(shì)，更具臨床推廣優(yōu)勢(shì)。

過(guò)度的氧化應(yīng)激損傷會(huì)影響包括肺組織在內(nèi)的多種器官的正常功能，并加重炎癥反應(yīng)[8-9]。存在于細(xì)胞內(nèi)的SOD 酶是細(xì)胞內(nèi)氧化劑清除劑，可反映體內(nèi)清除氧自由基的能力；而MDA 是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，可反映患者體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生水平，并間接反映細(xì)胞受到氧化損傷的程度[10-11]。結(jié)果顯示急性肺損傷大鼠模型經(jīng)過(guò)胍丁胺治療后，會(huì)出現(xiàn)MDA 含量下調(diào)、SOD 酶活性上升的表現(xiàn)，提示其可通過(guò)促進(jìn)抗氧化物（如SOD 酶等）的生成來(lái)減輕肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致MDA 生成減少，從而發(fā)揮治療效果。同時(shí)，檢測(cè)肺組織及肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6 水平顯示，經(jīng)過(guò)治療后的肺組織中的細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，同樣表明胍丁胺具有抑制炎癥作用，與既往研究相符。以上研究均表明，肺部局部給藥后，會(huì)提高肺組織抗氧化水平，那么在臨床應(yīng)用中可通過(guò)藥物霧化吸入方式來(lái)輔助急性肺損傷的治療，來(lái)改善患者病情。

本研究同樣存在不足，如未深入探究胍丁胺抑制肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制，同時(shí)，其對(duì)于肺部包括巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的影響也尚待評(píng)估。本研究設(shè)置的劑量梯度僅僅在肺組織的細(xì)胞因子中，而沒(méi)有在W/D 及肺泡灌洗液細(xì)胞因子中產(chǎn)生差異，這有可能是檢測(cè)對(duì)象存在差異而產(chǎn)生的結(jié)果。但是與LPS 組比較，低及高劑量胍丁胺組的肺損傷指標(biāo)均有改善。尚需要后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)大濃度梯度，來(lái)篩選最適合的用藥劑量。

綜上，胍丁胺可抑制肺部過(guò)度氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用。