海沙瑞林對慢性心力衰竭大鼠心交感神經(jīng)重構(gòu)的影響*

王藝全 周春雪 李梅秀 田國忠

（佳木斯大學(xué)解剖學(xué)教研室，佳木斯 154007）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）死亡率高達(dá)50%，探索CHF發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療藥物備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[1-3]。與自主神經(jīng)失調(diào)有關(guān)，CHF早期即出現(xiàn)心交感神經(jīng)的激活和交感神經(jīng)重構(gòu)[4-5]，即心臟神經(jīng)纖維發(fā)生形態(tài)、分布及密度的改變[6]。而CHF后期，交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活和交感神經(jīng)重構(gòu)易致惡性心律失常乃至猝死的發(fā)生。因此，通過改善心交感神經(jīng)重構(gòu)已經(jīng)成為治療心衰的又一個(gè)重要靶點(diǎn)。海沙瑞林（hexarelin）是一種高度穩(wěn)定的生長素釋放肽（growth hormone releasing peptide，GHRP）的修飾物[7]。GHRP是一種人工合成的、能促使垂體生長素釋放的促分泌肽類物質(zhì)，對心肌而言，有與生長素類似的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)海沙瑞林對CHF心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[9-10]。本研究應(yīng)用海沙瑞林干預(yù)CHF大鼠，探討其對CHF心交感神經(jīng)改變的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及模型的建立

雄性健康SD 大鼠80 只（由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號211002300041251），體質(zhì)量200 g±20 g，在佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)1 周，溫度22 ℃±2 ℃，12 h 的光暗循環(huán)下自由進(jìn)食水。將大鼠分為正常組（Control 組，n=8）、假手術(shù)組（Sham 組，n=8）、心力衰竭模型組（HF 組，n=22）和海沙瑞林干預(yù)組（HF+Hx組，n=22）。模型制備4 周后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥，HF+Hx 組大鼠尾靜脈注射hexralin 100 μg·kg-1·d-1（購自 Prospec 公司，美國），其他3 組大鼠均使用等量生理鹽水進(jìn)行處理，持續(xù)4 周。Sham 組與HF 組開胸及手術(shù)方法均相同，只穿線不結(jié)扎左前降支。

模型制作采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法，大鼠于手術(shù)前12 h 禁食，6 h 禁水，每只大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛3.0 ml/kg 進(jìn)行麻醉，麻醉后仰臥固定于自制手術(shù)臺上，連心電監(jiān)護(hù)電極。大鼠頸部備皮，沿氣管縱向開口，逐層分離肌肉，暴露氣管，用眼科剪將一節(jié)氣管開一小口，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸比為2∶1，呼吸頻率75 次/分，潮氣量4 mL/kg。大鼠左胸前區(qū)備皮消毒后鋪無菌單，弧形切口切開皮膚，鈍性分離淺筋膜，沿胸大、小肌分離肌腱膜，在心跳最明顯處，也就是第3 肋間小心分離肋間內(nèi)、外肌，輕輕擴(kuò)開肋間隙后，將心表面被膜剝離，輕輕擠出心，用6-0 號無損傷線于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間從左向右進(jìn)針，外科結(jié)結(jié)扎大鼠左前降支。結(jié)扎區(qū)域可見心肌顏色變淺，搏動(dòng)減弱，心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)、胸導(dǎo) V1、V2、V3 導(dǎo)聯(lián)可見ST 段改變，視為制造模型成功，否則棄之。快速還納心，放置負(fù)壓吸引管，負(fù)壓吸引排空胸腔內(nèi)殘余的氣體，肋間隙、肋間肌肉、皮膚逐層縫合，撤掉呼吸機(jī)后縫合氣管，觀察大鼠可緩慢自主呼吸后，快速縫合頸部皮膚，立即給予充分保溫條件，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠，于手術(shù)后30～60 min 蘇醒，給予食水，放回籠養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)，并連續(xù)3 d 給每只手術(shù)大鼠肌肉注射20 000 IU 青霉素預(yù)防感染。

1.2 大鼠心超聲心動(dòng)圖檢測

于術(shù)后8周末測定各組大鼠心功能。使用Vevo 2100 Image System小動(dòng)物超聲機(jī)10 M 小動(dòng)物探頭進(jìn)行測定，探頭于其左胸取得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，從乳頭肌水平將M 型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得超聲心動(dòng)圖，測定左心室的各項(xiàng)指標(biāo)。測量指標(biāo)為左室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左室舒張末期 容 積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shorting，LVFS）及左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）值。

1.3 取材與染色

給藥4 周末進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘除心后置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，將包埋好的組織冷卻2 h，片厚5 μm 連續(xù)切片，爬片后放置，分別進(jìn)行H-E 染色和Masson 染色。

1.4 免疫組織化學(xué)顯色

應(yīng)用免疫組織化學(xué)（SABC）顯色法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和生長相關(guān)蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）表達(dá)水平，胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。兔抗BNP抗體（1∶500）購自美國Abcam公司；兔抗NGF抗體（1∶50）、兔抗TH抗體（1∶50）和兔抗GAP43抗體（1∶50）均購自美國Affinity公司。使用Leica DM4000B型生物顯微鏡、Leica DFC450數(shù)字照相機(jī)和Application Suite圖像采集軟件對免疫組織化學(xué)顯色的組織切片進(jìn)行各組抗體切片圖像采集，然后使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對采集的圖像相對積分光密度值進(jìn)行計(jì)算分析。

1.5 心肌組織免疫印跡檢測

取50 mg 左心室心肌組織，用裂解液提取組織總蛋白，BCA 法定量后行常規(guī)免疫印跡檢測BNP、NGF、TH 和GAP43 表達(dá)。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH（1∶1 000，購自中杉金橋公司）為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比代表蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。其中一抗稀釋倍數(shù)分別為BNP（1∶500），NGF（1∶500）、TH（1∶500）、GAP43（1∶1 000）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活率

海沙瑞林干預(yù)4 周后仍存在大鼠死亡情況，死亡主要原因?yàn)橹囟刃牧λソ摺Ｆ渲蠬F 組存活率為72.72%，而HF+Hx 組存活率為81.81%（表1），提示海沙瑞林的干預(yù)提升了大鼠的存活率。

表1 各組大鼠存活率Tab1 Results of rat survival rates in each group

2.2 大鼠心電圖變化

大鼠術(shù)前心電圖為正常竇性心律，律齊，各波形完整；結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支手術(shù)后5 min 心電圖顯示T 波振幅加大，ST 段弓背向上抬高明顯，作為大鼠心肌梗死手術(shù)成功的標(biāo)志。

2.3 各組大鼠左心室心功能實(shí)驗(yàn)

8 周末超聲心動(dòng)圖可見HF 組大鼠左心室腔擴(kuò)大明顯，左心室運(yùn)動(dòng)減弱，左室運(yùn)動(dòng)波形幾乎消失（圖1）。與對照組和Sham 組比較，HF 組LVEDD、LVESD、LVEDV 和LVESV 均明顯增加（P＜0.05），LVFS 和LVEF 明顯降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HF 組比較，HF+Hx 組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV 均顯著降低（P＜0.05），LVFS 和LVEF明顯升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。結(jié)果表明，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備的心梗后心衰大鼠模型8 周末LVEF 降低，符合心力衰竭模型的要求；HF+Hx 組LVEF 較HF 組升高，表明Hexarelin 干預(yù)對防止心衰早期模型大鼠心功能惡化有積極的作用。

圖1 對照組（A）與心力衰竭組（B）超聲心電圖Fig1 Echocardiogram in control（A）and HF（B）groups

表2 各組大鼠左心室心功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6，±s）Tab2 Results of left ventricular cardiac function in rats of each group（n=6，±s）

表2 各組大鼠左心室心功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6，±s）Tab2 Results of left ventricular cardiac function in rats of each group（n=6，±s）

#P＜0.05 vs control group ；*P＜0.05 vs HF group

Group LVEDV（mm3）LVESV（mm3）LVEF（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）LVFS（%）Control 197.85±12.56 20.97±2.96 89.55±0.91 6.23±0.17 3.85±0.17 42.48±2.21 Sham 198.99±8.18 23.38±1.08 88.12±0.43 6.43±0.21 3.88±0.12 39.54±2.35 HF 460.94±22.20# 267.25±19.12# 42.85±3.03# 8.41±0.48# 6.73±0.48# 20.07±2.8#HF+Hx 327.99±18.66* 158.13±14.62* 53.47±4.27* 7.33±0.24* 5.58±0.28* 23.87±2.54*

2.4 各組大鼠心結(jié)構(gòu)病理變化

2.4.1 H-E 染色 與對照組和Sham 組比較，HF 組心肌細(xì)胞排列紊亂，大小不一，纖維有斷裂現(xiàn)象，部分細(xì)胞核溶解，細(xì)胞間隙大量纖維瘢痕和炎癥細(xì)胞浸潤。與HF 組比較，HF+Hx 組心肌細(xì)胞心肌纖維斷裂情況少，細(xì)胞核較完整，病理結(jié)構(gòu)明顯改善（圖2，見封二）。

2.4.2 Masson 染色 HF 組大片藍(lán)染，膠原纖維沉積明顯（紅色為正常組織，藍(lán)色表示膠原纖維）。與HF 組比較，HF+Hx 組藍(lán)染面積下降，纖維化程度和膠原沉積明顯降低（圖3，見封二）。

2.5 BNP、NGF、TH 和GAP43 的蛋白表達(dá)

大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白陽性染色呈棕黃色，表達(dá)定位于胞質(zhì)內(nèi)（圖4，見封二）。HF 組BNP 陽性表達(dá)量較對照組和Sham組顯著升高，HF+Hx 組BNP 蛋白陽性表達(dá)量較HF 組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HF 組NGF、TH 和GAP43 陽性表達(dá)量較對照組和Sham 組顯著升高，HF+Hx 組NGF、TH 和GAP43蛋白陽性表達(dá)量較HF 組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

與對照組和Sham 組相比，HF 組BNP蛋白水平顯著升高（P＜0.05），NGF、TH 和GAP43的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與HF 組相比，HF+Hx 組BNP 蛋白水平降低（P＜0.05），NGF、TH 和GAP43 蛋白水平升高（P＜0.05）（表4，圖5）。

表3 各組大鼠心肌內(nèi)BNP、NGF、TH 和GAP43 相對積分光密度值（n=6，±s，IOD/area）Tab3 Relative integrated optical density of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group（n=6，±s，IOD/area）

表3 各組大鼠心肌內(nèi)BNP、NGF、TH 和GAP43 相對積分光密度值（n=6，±s，IOD/area）Tab3 Relative integrated optical density of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group（n=6，±s，IOD/area）

*P＜0.05 vs control and sham groups；#P＜0.05 vs HF group

Group BNP NGF TH GAP43 Control 0.025±0.005 0.103±0.005 0.090±0.010 0.107±0.0171 Sham 0.022±0.008 0.113±0.0143 0.079±0.007 0.104±0.0117 HF 0.130±0.007* 0.029±0.0029* 0.021±0.006* 0.037±0.0081*HF+Hx 0.062±0.009# 0.046±0.0104# 0.038±0.005# 0.055±0.0095#

表4 各組大鼠心肌內(nèi)BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白表達(dá)（±s）Tab4 Expression of BNP，NGF，TH and GAP43 proteins in myocardium of each group（±s）

表4 各組大鼠心肌內(nèi)BNP、NGF、TH 和GAP43 蛋白表達(dá)（±s）Tab4 Expression of BNP，NGF，TH and GAP43 proteins in myocardium of each group（±s）

*P＜0.05 vs control and sham groups；#P＜0.05 vs HF group

Group BNP NGF TH GAP43 Control 0.940±0.008 1.414±0.006 1.428±0.003 1.634±0.012 Sham 0.943±0.006 1.431±0.014 1.368±0.006 1.623±0.011 HF 1.554±0.033* 0.673±0.085* 0.728±0.078* 0.835±0.059*HF+Hx 1.352±0.035# 1.031±0.072# 1.079±0.059# 1.037±0.081#

圖5 各組大鼠心肌內(nèi)BNP、TH、NGF 和GAP43 蛋白表達(dá)，免疫印跡Fig5 Expression of BNP，TH，NGF and GAP43 in myocardium of each group Western Blotting

3 討論

在臨床方面，超聲心動(dòng)圖是評估心功能的主要途徑[11]。HF 組超聲心電圖結(jié)果顯示左心室射血分?jǐn)?shù)顯著降低，代表了CHF 大鼠心收縮和舒張能力受損，心力衰竭大鼠模型制作成功。海沙瑞林干預(yù)30 d 后，射血分?jǐn)?shù)有所升高，心收縮功能有明顯改善，起到了心臟正性肌力作用。本研究通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)法檢測了實(shí)驗(yàn)大鼠左心室心肌組織，BNP蛋白表達(dá)水平的增加是病理性左心室肥大的特征，這與H-E染色和Masson染色的病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證實(shí)了海沙瑞林干預(yù)后改善了心肌損傷，對心肌細(xì)胞起到了保護(hù)作用。心交感神經(jīng)系統(tǒng)也在心衰時(shí)期起到了重要作用，心衰的發(fā)生發(fā)展離不開心交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活[12]。心衰時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）釋放增多，血漿中NE濃度顯著升高[13]。交感神經(jīng)的持續(xù)活化和高濃度NE對心肌產(chǎn)生毒性，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡以及心肌交感神經(jīng)密度下降[14-15]。過量的NE還會(huì)導(dǎo)致NE 受體的反應(yīng)性和蛋白表達(dá)下降[16]，心肌對NE 的敏感性隨之下降，而心肌收縮力的增加有限，心舒張功能發(fā)生障礙，心肌進(jìn)一步肥厚。因此，交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活與心功能不全等嚴(yán)重心臟疾病的進(jìn)程和疾病的預(yù)后都有著重要聯(lián)系。NGF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，有促進(jìn)交感神經(jīng)生長和延伸軸突的作用，對心衰后交感神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的調(diào)控作用[17-18]。Poole 等[19]證實(shí)了外源性補(bǔ)充NGF 可以成功誘導(dǎo)交感神經(jīng)軸突的生長。Glebova 等[20]將NGF 和bax 基因缺失的實(shí)驗(yàn)鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，證明了NGF 基因缺失的大鼠心交感神經(jīng)分布明顯減少，也同樣體現(xiàn)了NGF 對交感神經(jīng)的重要調(diào)控作用。本研究也同樣證實(shí)了前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。TH 是NE 合成代謝通路的關(guān)鍵酶，其在心肌組織中的表達(dá)量可表示心交感神經(jīng)的活性，其表達(dá)下調(diào)可引起交感神經(jīng)末梢功能異常。GAP43 是一種軸突膜神經(jīng)特異性蛋白，參與心神經(jīng)生長過程，與神經(jīng)再生與突觸發(fā)育有關(guān)[21]，與NGF 結(jié)果結(jié)合可更準(zhǔn)確反映交感神經(jīng)分布及密度。本研究檢測到心衰大鼠心肌細(xì)胞BNP 蛋白表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞丟失嚴(yán)重，膠原蛋白沉積代替死亡的心肌細(xì)胞發(fā)揮作用，導(dǎo)致間質(zhì)病理性纖維化，交感神經(jīng)纖維斷裂壞死，血漿內(nèi)NE 濃度升高，加重對心肌的損傷，心肌細(xì)胞內(nèi)NGF、TH 和GAP43 蛋白表達(dá)下調(diào)，對心交感神經(jīng)的調(diào)節(jié)作用減弱，心交感神經(jīng)支配失衡，心交感神經(jīng)重構(gòu)。

在海沙瑞林干預(yù)下，NGF、TH 和GAP43 蛋白表達(dá)明顯升高，改變了交感神經(jīng)重構(gòu)，分析海沙瑞林可能是通過增加TH 蛋白表達(dá)來修復(fù)神經(jīng)末梢對NE 的再攝取功能，NGF 和GAP43 蛋白表達(dá)的上調(diào)預(yù)示著交感神經(jīng)的再生能力，可通過修復(fù)受損的神經(jīng)纖維來延緩心衰進(jìn)程。因此交感神經(jīng)重構(gòu)可能是治療心力衰竭的潛在目標(biāo)，而阻斷交感神經(jīng)重構(gòu)是達(dá)到對心力衰竭有效預(yù)防和治療的關(guān)鍵。海沙瑞林顯著改善心衰大鼠左心功能，有效阻止心肌細(xì)胞內(nèi)NGF、TH 和GAP43 蛋白表達(dá)的下降，通過改變心交感神經(jīng)重構(gòu)來改善CHF 的預(yù)后是其實(shí)現(xiàn)心保護(hù)的機(jī)制之一，以期能為開發(fā)海沙瑞林在心保護(hù)方面的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

圖2 各組大鼠心組織結(jié)構(gòu)，H-E 染色，標(biāo)尺=100 μm。A：對照組；B：Sham 組；C：HF 組；D：HF+Hx 組.Fig2 Cardiac histostructure in each group，HE staining，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.

圖3 各組大鼠心組織結(jié)構(gòu)，Masson 染色，標(biāo)尺=100 μm。A：對照組；B：Sham 組；C：HF 組；D：HF+Hx 組.Fig3 Cardiac histostructure in each group，Masson staining，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.

圖4 各組大鼠BNP（A1～D1）、NGF（A2～D2）、TH（A3～D3）和GAP43（A4～D4）蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)顯色，標(biāo)尺=100 μm。A：對照組；B：Sham 組；C：HF 組；D：HF+Hx 組.Fig4 Protein expression of BNP（A1-D1），NGF（A2-D2），TH（A3-D3）and GAP43（A4-D4）in each group，bar=100 μm.A：Control group；B：Sham group；C：HF group；D：HF+Hx group.