清胃瀉心湯對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠免疫球蛋白、炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響?

宋秀菊 韓 兵 劉春曉 王 莉

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200；3.山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266033）

胃潰瘍?yōu)槌Ｒ姷南兰膊?，病因十分?fù)雜，與營(yíng)養(yǎng)不良、應(yīng)激、創(chuàng)傷、吸煙酗酒、過量服用非甾體消炎藥、幽門螺桿菌感染等多種因素有關(guān)。發(fā)病機(jī)制有炎癥學(xué)說、無酸無潰瘍學(xué)說、因子失衡學(xué)說等［1］。急性胃潰瘍易反復(fù)發(fā)作，引起胃部出血、潰瘍穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，隨著人們生活節(jié)奏加快，不良生活習(xí)慣增多，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，目前治療以外科手術(shù)和非甾體抗炎藥治療為主，但易導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，療效欠佳［2］。胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”范疇，其病位在胃，涉及肝脾、外邪、飲食、情志等因素，胃氣阻滯，胃失和降而發(fā)病，胃火上沖動(dòng)血，治宜健脾益氣、清熱燥濕、疏肝和胃［3-4］。清胃瀉心湯由黃連、藿香等16味中藥組成，為本院治療胃潰瘍的臨床協(xié)定方，具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過腹腔注射吲味美辛和水浸拘束法建立急性胃潰瘍大鼠模型，旨在觀察清胃瀉心湯對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠免疫球蛋白、炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，8周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK-（京）2012-0001。合格證號(hào)：110011191100312。室溫飼養(yǎng)，自由飲水，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清胃瀉心湯，藥物組成：黃連15 g，藿香10 g，半夏10 g，茯苓15 g，茵陳10 g，白及10 g，黃芪15 g，生地黃15 g，牡丹皮10 g，黃芩10 g，大黃10 g，延胡索10 g，木香10 g，薏苡仁15 g，蒼術(shù)10 g，陳皮10 g。上述中藥飲片由青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮成1 mL含0.5 g、1 g和1.5 g原藥材的藥液。吲哚美辛（上海北諾生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180917）；奧美拉唑膠囊（20 mg/粒，海南通用三洋藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021955）。

1.3 試劑與儀器 蘇木精-伊紅染色液（武漢華美生物工程有限公司）；免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）試劑盒購(gòu)于美國(guó)B&D公司；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）購(gòu)于南京建成生物工程研究所。RM2235型病理切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；LDZ-2型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；OLYMPUSAU5400全自動(dòng)生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；ELx800酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.4 分組與造模 將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組采用腹腔注射吲哚美辛和水浸拘束法建立急性胃潰瘍大鼠模型。具體為腹腔注射吲哚美辛，劑量為20 mg/kg，6 h后將各組大鼠拘束于長(zhǎng)×寬×高分別為16 cm×4 cm×4 cm的籠中，浸泡于16～18℃的恒溫水中，水面與劍突部齊平，浸泡6 h后，取出松綁。按照Guth標(biāo)準(zhǔn)采用潰瘍數(shù)評(píng)價(jià)［5］，麻醉后取完整胃組織，結(jié)扎賁門幽門制成胃袋并注入10 mL氯化鈉溶液，2%的甲醛溶液中固定10 min，沿胃大彎剪開并平展，淤血點(diǎn)為1分，線狀淤血長(zhǎng)度＜1 mm為2分，1～2 mm為3分，3～4 mm為4分，＞5 mm為5分，全胃分?jǐn)?shù)的綜合得分為該鼠的潰瘍數(shù)，潰瘍數(shù)大于20分為造模成功［6］。

1.5 給藥方法 于造模后第2日進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，劑量為5 mL/kg，清胃瀉心湯低（0.5 g/mL）、中（1 g/mL）、高劑量（1.5 g/mL）組給予清胃瀉心湯灌胃，劑量為5 mL/kg，陽性組給予奧美拉唑灌胃（0.3 mg/mL），劑量為5 mL/kg。連續(xù)7 d，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率：給藥7 d后，將大鼠處死并立即開腹，結(jié)扎幽門、賁門，取出胃，無菌生理鹽水將胃內(nèi)容物沖洗干凈，2%的甲醛溶液中固定10 min，觀察胃組織的損傷情況，游標(biāo)卡尺精確測(cè)量胃黏膜上每一個(gè)損傷的長(zhǎng)度，按照Guth標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)潰瘍指數(shù)，計(jì)算潰瘍抑制率［7］，潰瘍抑制率（%）=（1-給藥組潰瘍指數(shù)/模型組潰瘍指數(shù)）×100%。2）胃組織病理學(xué)觀察：給藥后第7日，處死各組大鼠，分離實(shí)驗(yàn)所需胃組織，4%多聚甲醛固定24 h，自來水沖洗，不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明固定，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，烤片，二甲苯脫蠟，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水沖洗返藍(lán)，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。3）免疫球蛋白檢測(cè)：給藥后7 d，處死各組大鼠，心臟取血，不抗凝，3 000 r/min離心10 min，采用全自動(dòng)生化分析儀免疫比濁法分析血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）水平。4）炎癥因子測(cè)定：給藥后第7日，處死各組大鼠，心臟取血，離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定各組大鼠血清炎癥因子IL-2、IL-6和TNF-α水平。5）氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：分別于造模后第7日，處死各組大鼠，心臟取血，離心，取上清，采用ELISA測(cè)定各組大鼠血清應(yīng)激指標(biāo)MPO、MDA、SOD水平，按照試劑盒說明操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間或組內(nèi)治療前后采用t檢驗(yàn)，（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠潰瘍面積、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組潰瘍面積和潰瘍指數(shù)顯著升高（P＜0.05），清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組的潰瘍面積、潰瘍指數(shù)顯著低于模型組，清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組潰瘍抑制率顯著高于清胃瀉心湯低劑量組（P＜0.05）。清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組潰瘍面積、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠潰瘍面積、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較（±s）

表1 各組大鼠潰瘍面積、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較（±s）

與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與清胃瀉心湯低劑量組比較，◇P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組清胃瀉心湯低劑量組清胃瀉心湯中劑量組清胃瀉心湯高劑量組陽性組n 潰瘍抑制率（%）10 10 10 10 10 10潰瘍面積（mm2）0.71±0.16 9.67±1.25*7.03±1.12*△4.81±0.86*△◇3.51±0.79*△◇4.12±0.81*△◇潰瘍指數(shù)（分）-24.21±1.53 17.91±1.47△13.04±1.31△◇7.59±0.97△◇8.76±0.83△◇- -31.57±1.26△45.21±1.19△◇51.24±1.32△◇49.67±1.08△◇

2.2 各組大鼠病理形態(tài)學(xué)比較 見圖1。對(duì)照組未見明顯的胃組織形態(tài)學(xué)變化；模型組胃黏膜變薄，上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落缺損，黏膜固有腺體排列稀疏紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層出血，黏膜下層水腫；清胃瀉心湯低劑量組胃黏膜變薄，上皮細(xì)胞脫落，黏膜固有腺體少量增生，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組胃黏膜變薄，上皮少量缺損、脫落，腺體增生較多，排列較整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠胃組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠免疫球蛋白水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組血清IgA、IgG、IgM水平顯著升高（P＜0.05），清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組血清IgA、IgG、IgM水平均低于模型組，且清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組顯著低于清胃瀉心湯低劑量組（均P＜0.05）。清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組血清IgA、IgG、IgM水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠免疫球蛋白水平比較（g/L，±s）

表2 各組大鼠免疫球蛋白水平比較（g/L，±s）

組別對(duì)照組模型組清胃瀉心湯低劑量組清胃瀉心湯中劑量組清胃瀉心湯高劑量組陽性組n 10 10 10 10 10 10 IgA 0.11±0.05 0.42±0.08*0.34±0.06*△0.25±0.04*△◇0.21±0.05*△◇0.23±0.06*△◇IgG 0.46±0.07 1.02±0.13*0.87±0.12*△0.62±0.10*△◇0.57±0.11*△◇0.61±0.12*△◇IgM 0.31±0.11 0.62±0.09*0.51±0.08*△0.43±0.07*△◇0.36±0.08*△◇0.39±0.09*△◇

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組血清IL-2、IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組血清IL-2、IL-6和TNF-α水平均低于模型組，且清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組顯著低于清胃瀉心湯低劑量組（均P＜0.05）。清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組血清IL-2、IL-6和TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（μg/L，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（μg/L，±s）

組別對(duì)照組模型組清胃瀉心湯低劑量組清胃瀉心湯中劑量組清胃瀉心湯高劑量組陽性組n 10 10 10 10 10 10 IL-2 10.32±1.23 72.14±1.98*50.04±2.03*△31.41±1.62*△◇28.31±1.62*△◇30.12±1.72*△◇IL-6 2.63±0.21 8.16±0.41*6.11±0.32*△4.26±0.29*△◇3.57±0.25*△◇3.62±0.28△◇TNF-α 5.25±0.39 17.26±3.11*14.17±2.58*△10.37±2.61*△◇8.47±2.35*△◇8.13±2.47*△◇

2.5 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 見表4。與對(duì)照組比較，模型組血清MPO和SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）；清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組MPO和SOD顯著高于模型組，而MDA顯著低于模型組，且清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組與清胃瀉心湯低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組血清MPO、MDA和SOD水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組清胃瀉心湯低劑量組清胃瀉心湯中劑量組清胃瀉心湯高劑量組陽性組n 10 10 10 10 10 10 MPO（g/L）0.58±0.07 0.21±0.05*0.34±0.08*△0.46±0.07*△◇0.49±0.08*△◇0.51±0.06*△◇MDA（μmol/L）3.17±0.48 23.45±1.76*17.24±1.54*△11.27±1.37*△◇10.03±1.41*△◇9.67±1.52*△◇SOD（U/L）63.04±4.23 20.37±1.89*31.47±2.34*△45.12±2.89*△◇47.92±3.12*△◇49.52±2.76*△◇

3 討論

胃潰瘍病情較為復(fù)雜，主要是因胃黏膜侵襲因素增強(qiáng)引起，多種因素均參與了胃潰瘍的胃黏膜損傷過程，導(dǎo)致胃黏膜防御能力下降，病程延長(zhǎng)，易引起胃部出血、潰瘍穿孔、幽門阻塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［8］。胃潰瘍的發(fā)生與胃黏膜侵襲因素和防御機(jī)制之間平衡失調(diào)有關(guān)，胃酸分泌在胃潰瘍的發(fā)病中具有關(guān)鍵性的作用，胃黏膜損傷修復(fù)過程涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子等，抑制損傷因子和提升保護(hù)因子具有重要的意義［9］。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是胃潰瘍發(fā)生的重要基質(zhì)。程曉華等研究發(fā)現(xiàn)［10］，活動(dòng)性胃潰瘍患者血清PG呈異常升高狀態(tài)，與炎癥活動(dòng)性評(píng)分具有正相關(guān)關(guān)系；血清EGF呈異常下降狀態(tài)，與炎癥活動(dòng)性評(píng)分具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活動(dòng)性胃潰瘍患者血清PG、EGF水平有助于評(píng)估病情及預(yù)后。體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致胃黏膜受損，羅炎杰等發(fā)現(xiàn)［11］，蘭索拉唑治療活動(dòng)期胃潰瘍的臨床效果明顯優(yōu)于奧美拉唑，可能與其顯著提高患者血清SOD、NO水平及降低血清MDA、ET-1水平有關(guān)。此外，費(fèi)林立等發(fā)現(xiàn)［12］，奧美拉唑聯(lián)合抗生素治療有助于提高胃潰瘍患者的臨床療效，降低復(fù)發(fā)率，這可能與改善患者免疫功能、調(diào)節(jié)胃腸激素等因素有關(guān)。因此，從免疫球蛋白、炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)探討急性胃潰瘍的治療作用具有重要意義。

西醫(yī)治療胃潰瘍具有給藥方便、起效快的優(yōu)點(diǎn)，但存在藥物順應(yīng)性和耐藥性的缺點(diǎn)，且遠(yuǎn)期潰瘍復(fù)發(fā)率高。胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“胃癰”“吐酸”“反胃”等范疇，脾胃氣機(jī)和暢，升降協(xié)調(diào)，運(yùn)納相宜，邪氣侵襲，氣機(jī)升降失司，脾胃運(yùn)納失職，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因中醫(yī)藥具有改善全身狀況、穩(wěn)定病情及減少副作用等優(yōu)勢(shì)，在治療胃潰瘍方面越來越受到人們的關(guān)注［13］。清胃瀉心湯依據(jù)胃潰瘍病因理論創(chuàng)立，重點(diǎn)是清熱解毒，去腐生肌，其次護(hù)脾和胃。方中黃連和黃芩清熱瀉火、補(bǔ)脾益胃、斂瘡生肌，清熱祛腐而不傷正，藿香化濕醒脾，半夏燥濕化痰、消痞降氣，茯苓利水滲濕、健脾，茵陳清熱利濕，白及收斂止血，黃芪補(bǔ)氣升陽、益氣攝血、生肌長(zhǎng)肉，生地黃滋陰補(bǔ)血、生津止渴，牡丹皮清熱涼血、活血化瘀，大黃攻積滯、清濕熱、瀉火涼血、祛瘀解毒，延胡索、木香可理氣止痛，木香還具有溫胃化濕、醒脾消滯的作用，薏苡仁可益氣除濕，蒼術(shù)是運(yùn)脾藥，可燥濕化濁止痛，陳皮是輕升理氣藥，可使和胃健脾各得其宜，增加療效。全方諸藥合用可開可降、可清可補(bǔ)、和降胃氣，使得脾升胃降。

本研究發(fā)現(xiàn)，清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組的潰瘍面積、潰瘍指數(shù)顯著低于模型組；清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組胃黏膜變薄，上皮少量缺損、脫落，腺體增生較多，排列較整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；清胃瀉心湯低、中、高劑量組和陽性組血清IgA、IgG、IgM水平均低于模型組，血清IL-2、IL-6和TNF-α水平均低于模型組，MPO和SOD顯著高于模型組，而MDA顯著低于模型組；且清胃瀉心湯中、高劑量組和陽性組明顯優(yōu)于清胃瀉心湯低劑量組。

綜上所述，清胃瀉心湯可顯著減少潰瘍面積和潰瘍指數(shù)，提高潰瘍抑制率，改善胃組織形態(tài)學(xué)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫功能，降低炎癥反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激有關(guān)［14-20］。