針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠小腦GABA、Glu表達(dá)的影響?

郝曉敏 梁靖蓉 曾天笑 孫 嬌 袁靜云 吳嬌娟 張旭東 劉清國(guó)

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

據(jù)最新流行病學(xué)資料表明［1］，我國(guó)人群高血壓病的患病率仍呈升高趨勢(shì)，患者的知曉率、治療率和控制率（粗率）總體仍處于較低的水平。高血壓病作為一種嚴(yán)重危害人類健康的心腦血管疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺可通過(guò)調(diào)節(jié)心、腦、腎等多個(gè)靶腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)達(dá)到降壓效果。小腦作為針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉降壓所激活的靶腦區(qū)之一，除參與調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)、肌緊張及維持身體平衡外，在調(diào)節(jié)心血管功能方面起重要作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，電刺激小腦頂核可引起動(dòng)脈壓明顯升高，小腦存在與心血管功能活動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)元；針刺太沖穴被激活的腦區(qū)主要集中于小腦-后葉、扣帶回、背側(cè)丘腦和額葉聯(lián)合皮層等［2］；針刺可通過(guò)調(diào)節(jié)小腦中去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）達(dá)到降壓效果［3］，說(shuō)明通過(guò)某些途徑小腦會(huì)影響血壓的變化。另有國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者研究證實(shí)高血壓動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏γ-氨基丁酸（GABA），中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA的缺乏可能是引發(fā)高血壓的一個(gè)因素［4］。還有研究顯示［5］，針刺干預(yù)后血壓的降低將會(huì)使谷氨酸（Glu）含量降低。GABA、Glu分別作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，能夠起到改善血壓機(jī)制的作用［6］。本研究通過(guò)觀察針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓和小腦組織中GABA、Glu含量表達(dá)的影響，探討針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法對(duì)小腦參與降壓作用與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法的生物效應(yīng)差異，促進(jìn)高血壓研究成果及時(shí)向臨床轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）24只，Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6只。所用大鼠均為雄性，9周齡，體質(zhì)量（220±30）g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006］。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，定期紫外線消毒，室溫22～23℃，濕度60%，自由進(jìn)食及飲水。每日清掃動(dòng)物糞便，更換墊料。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用大鼠飼料。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的各項(xiàng)處理均遵照中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的有關(guān)動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與批準(zhǔn)號(hào)：BUCM-4-2018061501-2058。

1.2 試劑與儀器 漢醫(yī)牌針灸針（北京漢醫(yī)醫(yī)療器械，規(guī)格0.25 mm×13 mm）。無(wú)創(chuàng)血壓儀：BP-6（成都泰盟科技有限公司）。韓氏穴位針灸刺激儀：HANS-200E（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）。ELISA定量檢測(cè)試劑盒：Rat GABA ELSIA KIT、Rat GLU ELSIA KIT（BG公司）。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）。電熱恒溫培養(yǎng)箱：（DH4000A，天津泰斯特）。MINI shaker：（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）。自動(dòng)洗板機(jī)：（thermo，USA）。

1.3 干預(yù)方法 將WKY大鼠6只作為空白組，SHR大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、電針組、補(bǔ)法組、瀉法組，每組6只。除空白組和模型組外，針刺各組均取“太沖穴”（雙側(cè)），取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材定位：于后肢足背1、2趾骨間凹陷處取“太沖穴”。各針刺組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于每日下午將大鼠鉆入自制鼠套中，固定于實(shí)驗(yàn)桌上，以右手為刺手，分別于雙側(cè)太沖穴直刺1～2 mm。電針組：進(jìn)針后兩側(cè)太沖穴上的毫針?lè)謩e連接韓式電針儀的正極與負(fù)極，刺激強(qiáng)度為電流強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz，共留針20 min。補(bǔ)法組：大拇指作用力向前用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力向后退回，每次捻轉(zhuǎn)幅度360°，每分鐘60次，持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min，共留針20 min。瀉法組：大拇指作用力向后時(shí)用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力向前退回，每次捻轉(zhuǎn)幅度360°，每分鐘60次，持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min，共留針20 min。針刺時(shí)讓大鼠完全鉆入鼠套內(nèi)固定，以便于操作，所有針刺操作均由同一人完成，連續(xù)針刺14 d?？瞻捉M與模型組每日進(jìn)行與各針刺組相同的抓捉固定刺激，不行針刺治療。

1.4 血壓測(cè)定 在室溫（22±2）℃條件下，將清醒狀態(tài)下的大鼠于36℃下預(yù)熱（用溫控器調(diào)節(jié)溫度恒定）約15 min，用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓，連續(xù)測(cè)量3次，取其均值，避免噪音等外界環(huán)境刺激對(duì)血壓的影響。于針刺第1、4、7、11、14日的上午固定時(shí)間段測(cè)量血壓值，以減少誤差。正式測(cè)壓前訓(xùn)練若干次，每天測(cè)血壓訓(xùn)練1次，連續(xù)3 d。注意：測(cè)壓過(guò)程動(dòng)作要輕柔，不能激惹大鼠，以免引起血壓波動(dòng)。加溫時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，要固定在15 min；網(wǎng)套尺寸要合適，避免大鼠掙脫；尾套尺寸要合適，以免影響血壓；室溫要恒定，避免過(guò)高或過(guò)低對(duì)血壓造成影響。

1.5 小腦中GABA、Glu含量測(cè)定 各組大鼠在麻醉狀態(tài)下立即處死取材，各組先腹主動(dòng)脈取血、斷頭摘取小腦組織，再經(jīng)液氮凍存，后存放在-80℃冷凍室內(nèi)。用ELISA法檢測(cè)各組大鼠小腦組織中GABA、Glu的含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，繼以LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠針刺治療前后收縮壓比較 見(jiàn)表1。與空白組比較，其他各組大鼠收縮壓在針刺的第1、4、7、11、14日均具有顯著差異（P＜0.01），表明SHR大鼠模型一直保持比較穩(wěn)定的高血壓狀態(tài)。針刺治療第1日，與模型組比較，各治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3個(gè)治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療第4日，與模型組比較，瀉法組收縮壓顯著降低（P＜0.01），電針組次之（P＜0.05）。治療第7日開(kāi)始，與模型組比較，各針刺組收縮壓均顯著降低（P＜0.01）；與補(bǔ)法組比較，瀉法組收縮壓顯著降低（P＜0.05）。治療第11至14日，與補(bǔ)法組和電針組比較，瀉法組收縮壓均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且第14日收縮壓降低更顯著（P＜0.01）；而補(bǔ)法組和電針組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠針刺治療前后收縮壓比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠針刺治療前后收縮壓比較（mmHg，±s）

與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與電針組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與補(bǔ)法組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01。下同

針刺第14日112.50±2.88 173.63±1.69**162.50±2.07**△△158.25±1.98**△△▲▲□□162.38±3.07**△△組別空白組模型組補(bǔ)法組瀉法組電針組n 8 8 8 8 8針刺第1日110.38±2.33 165.13±1.46**164.63±2.07**164.50±1.77**164.75±1.67**針刺第4日111.88±1.46 165.50±1.07**164.25±0.89**163.25±1.67**△△163.75±2.55**△針刺第7日112.25±1.98 169.38±2.00**163.75±2.31**△△161.50±2.45**△△□163.50±2.00**△△針刺第11日112.38±2.97 172.00±2.73**163.13±1.55**△△160.50±1.77**△△□▲162.88±2.17**△△

2.2 各組大鼠小腦組織中GABA、Glu含量比較 見(jiàn)表2。針刺后與空白組比較，其他各組GABA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Glu表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；GABA、Glu含量模型組與空白組比較有明顯差異（P＜0.01）。與模型組比較，補(bǔ)法組、瀉法組和電針組小腦組織中GABA含量顯著升高（P＜0.01）；與補(bǔ)法組和電針組比較，瀉法組大鼠小腦組織中GABA含量升高顯著（P＜0.05或P＜0.01），而補(bǔ)法組和電針組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Glu含量與模型組比較，3個(gè)治療組均有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）；與補(bǔ)法組、電針組比較，瀉法組大鼠小腦組織中Glu含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），而補(bǔ)法組與電針組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠小腦組織中GABA、Glu含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠小腦組織中GABA、Glu含量比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組補(bǔ)法組瀉法組電針組n 6 6 6 6 6 GABA 123.57±8.78 81.22±6.67**96.95±6.58**△△110.99±8.64**△△▲□□100.24±5.96**△△Glu 2.62±0.47 4.27±0.11**3.76±0.40**△3.14±0.49*△△▲□□3.60±0.31**△△

3 討論

高血壓病作為嚴(yán)重危害人類身心健康的常見(jiàn)心血管病之一，是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，根據(jù)臨床證候特點(diǎn)將其歸為中醫(yī)學(xué)“頭痛”“眩暈”“肝風(fēng)”等范疇。高血壓病最常見(jiàn)的癥狀以肝系為主，主要證候類型為肝陽(yáng)上亢和肝火熾盛，符合臨床實(shí)際［7］?！端貑?wèn)·至真要大論篇》中指出“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，《千金方》中也指出“肝厥頭痛，肝為厥逆，上亢頭腦也”，都強(qiáng)調(diào)肝在本病發(fā)病中的重要性。前期文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)表明，針灸治療原發(fā)性高血壓使用頻次最高的為太沖穴［8］，作為足厥陰肝經(jīng)原穴，是肝之原氣經(jīng)過(guò)和留止之處，有平肝潛陽(yáng)、行氣解郁、清肝養(yǎng)血的作用，對(duì)SHR大鼠降壓效果最佳。故本課題選用太沖穴作為治療穴。SHR是目前國(guó)際上公認(rèn)的最接近人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓及抗高血壓藥物篩選的基礎(chǔ)研究［9］。針刺作為一種非藥物療法，治療高血壓病見(jiàn)效快，操作簡(jiǎn)便且無(wú)明顯不良反應(yīng)，在臨床得到了大力推廣運(yùn)用。小腦作為前期研究針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法所激活的靶腦區(qū)之一，體積僅占全腦10%左右，然而小腦神經(jīng)元數(shù)量卻占腦神經(jīng)元總數(shù)的一半之多［10］，有研究發(fā)現(xiàn)小腦頂核內(nèi)存在大量GABA能神經(jīng)元［11］，Glu也是腦區(qū)中最重要且常見(jiàn)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于小腦等部位［12］。兩者分別作為小腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，對(duì)血壓的調(diào)控起重要的作用［13］。既往多項(xiàng)研究均表明，小腦對(duì)心血管活動(dòng)具有重要調(diào)節(jié)作用［3，14-16］。近年不斷的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)抑制性遞質(zhì)GABA與興奮性遞質(zhì)Glu相互作用在高血壓病等疾病中起著重要作用［15-16］。綜上所述，血壓與小腦中GABA和Glu關(guān)系密切，探索針刺對(duì)血壓的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其與小腦內(nèi)GABA、Glu的關(guān)系，將對(duì)闡明高血壓的發(fā)病及治療具有重要理論價(jià)值和臨床意義。

針刺第1日，與空白組比較，模型組、補(bǔ)法組、瀉法組和電針組血壓差異顯著，且血壓較空白組均顯著升高，說(shuō)明SHR造模成功；與模型組相比，補(bǔ)法組、瀉法組和電針組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示針刺第1日并未發(fā)揮明顯降壓效應(yīng)。自針刺第4日開(kāi)始，各治療組逐漸開(kāi)始發(fā)揮降壓效應(yīng)，且不同治療組發(fā)揮降壓效應(yīng)時(shí)間與程度不同。針刺第4日，與模型組相比，瀉法組與電針組首先開(kāi)始發(fā)揮降壓效應(yīng)，且降壓效果顯著，但瀉法組與電針組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。針刺第7日，與模型組相比，補(bǔ)法組開(kāi)始產(chǎn)生降壓效果，即3個(gè)治療組均發(fā)揮降壓效應(yīng)；與補(bǔ)法組相比，瀉法組降壓更顯著。說(shuō)明從第4日開(kāi)始，針刺手法即開(kāi)始發(fā)揮降壓效應(yīng)，瀉法組與電針組比補(bǔ)法組起效時(shí)間早，且瀉法組降壓效果優(yōu)于補(bǔ)法組。針刺第11日至第14日，與補(bǔ)法組和模型組比較，瀉法組的降壓效果更顯著，且隨著針刺時(shí)間的延長(zhǎng)，瀉法組表現(xiàn)出更明顯的降壓效果。但補(bǔ)法組與電針組之間比較并未見(jiàn)差異。以上結(jié)果表明，從針刺第4日開(kāi)始，針刺手法即發(fā)揮降壓效應(yīng)，且瀉法組降壓效果最佳。補(bǔ)法組與電針組在降壓程度方面未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但電針組起效時(shí)間要早于補(bǔ)法組，可能是電針組低頻刺激，參數(shù)可控的特點(diǎn)導(dǎo)致。可見(jiàn)針刺手法可以顯著降低SHR的血壓，且瀉法組效果最顯著，與前期研究結(jié)果也一致，說(shuō)明不同針刺手法存在效應(yīng)上的差異性［3，17］。

GABA作為一種神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)基質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物大腦中，是神經(jīng)中樞內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究資料表明［6］，GABA可以通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)達(dá)到降低血壓、舒緩血管的作用，同時(shí)還具有鎮(zhèn)靜抗驚厥、調(diào)節(jié)大腦機(jī)能、加速新陳代謝及改善生殖生理等多種生物學(xué)功能［18］。GABA的降壓機(jī)制主要是通過(guò)兩種途徑：一是抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性，二是與腦內(nèi)GABAA和GABAB受體結(jié)合起到擴(kuò)張血管作用。GABA能改善動(dòng)脈反射功能可能與其能與腦內(nèi)受體結(jié)合改善血壓的機(jī)制有關(guān)［19］。在PVN局部灌注GABA后，可見(jiàn)血壓下降、心率減慢，表現(xiàn)為交感神經(jīng)興奮的抑制［20］，可見(jiàn)GABA對(duì)血壓的調(diào)控具有重要作用且與小腦關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小腦組織中GABA含量明顯降低，表明SHR大鼠血壓升高可能與小腦中GABA含量的降低有關(guān)。與模型組比較，補(bǔ)法組、瀉法組和電針組均能顯著升高GABA的含量；與補(bǔ)法組和電針組比較，瀉法組升高GABA含量最顯著。

Glu作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與血壓變化最相關(guān)的興奮性氨基酸遞質(zhì)［13］，主要分布于小腦等部位［12］。有研究表明，Glu是作用于脊髓中間外側(cè)柱交感-腎上腺素能神經(jīng)元的主要興奮性遞質(zhì)，可引起交感心血管運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)活動(dòng)加強(qiáng)，使血壓升高［21-22］。針刺可通過(guò)減少RV-LM核團(tuán)中Asp、Glu的釋放，減弱交感神經(jīng)興奮性，從而降低大鼠血壓［13］。早期研究結(jié)果表明［23］，谷氨酸在血壓調(diào)節(jié)的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制中亦起著主要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小腦組織中Glu含量明顯升高，表明SHR大鼠血壓升高可能與小腦中Glu含量的升高有關(guān)。與模型組比較，補(bǔ)法組、瀉法組和電針組均能顯著降低Glu的含量；與補(bǔ)法組和電針組比較，瀉法組降低GABA含量最顯著。

綜上，在高血壓大鼠的中樞發(fā)病機(jī)制中，小腦GABA含量的降低與Glu的含量的升高可能是其原因之一。對(duì)SHR大鼠施以針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法均能顯著降低血壓，使小腦GABA含量升高、Glu含量降低，且不同手法具有截然不同的效應(yīng)性，這可能是針刺調(diào)控血壓的中樞機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)中瀉法組對(duì)血壓和小腦中2種神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)最顯著，降壓效果最佳，與補(bǔ)法組和電針組相比差異最明顯，從而驗(yàn)證了針刺手法的有效性和差異性；補(bǔ)法組與電針組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但電針組發(fā)揮降壓效應(yīng)較早，可能是電針組低頻刺激，參數(shù)可控的特點(diǎn)導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作過(guò)程尚存不足之處，針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉對(duì)小腦參與降壓的機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。