提取方法對芒果核仁多酚提取得率及抗氧化活性的影響

鄭斌，趙巧麗，文定青，鄒明宏，武紅霞，王松標(biāo)

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524091）

芒果（Mangifera indica）是漆樹科常綠喬木，廣泛分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等地，素有“熱帶水果之王”之美譽(yù)[1]。近年來我國芒果產(chǎn)量逐步上升，在滿足鮮銷的同時(shí)，相繼涌現(xiàn)出了果汁、果脯、果干、果粉等加工產(chǎn)品[2]。在芒果加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量果皮、果核等廢棄物，大部分被直接丟棄，不僅加重了環(huán)境污染，還造成了資源浪費(fèi)[3]。芒果核占鮮果重的20%～60%，而核仁又占芒果核總重的45%～75%[4]。研究表明，芒果核仁富含沒食子酸甲酯、沒食子酸、槲皮素、香豆素、芒果苷、香草醛、單寧等多酚類物質(zhì)[5-8]，具有抑制細(xì)菌和鏈格孢菌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種生理功能[9-10]，此外多酚類物質(zhì)對癌癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的預(yù)防也具有積極作用[11-12]。因此，從芒果核仁中提取分離多酚對提高芒果深加工產(chǎn)業(yè)附加值具有重要意義。

芒果核仁多酚的提取以回流法、微波法居多[13-14]，此外還有微波-超聲聯(lián)合萃取、雙水相-勻漿萃取和超聲-雙水相耦合提取的報(bào)道[15-17]。但不同提取方法涉及到的溫度、時(shí)間、超聲和微波等條件會(huì)對多酚的抗氧化活性產(chǎn)生影響。段小娟等[18]比較了微波萃取、銅極板和鋼極板等離子萃取、聚能式和清洗式超聲波萃取及真空萃取等方法提取的山丁子多酚的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)微波萃取法所得多酚抗氧化能力最強(qiáng)。蔣麗等[19]采用超聲波法、酶法、常規(guī)浸提、熱回流法及纖維素酶協(xié)同超聲波法分別提取茶多酚，發(fā)現(xiàn)90 ℃熱回流法提取率最高，但過高的溫度會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物抗氧化活性降低；而室溫條件下超聲波法提取茶多酚能獲得較高的提取率，且產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng)；酶法和纖維素酶協(xié)同超聲波法能獲得較高的提取率，但產(chǎn)品純度和抗氧化活性低于超聲波法。目前，有關(guān)提取方法對芒果核仁多酚抗氧化活性影響的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用超聲輔助提取法和熱回流提取法提取芒果核仁多酚，通過響應(yīng)面法對兩種提取方法的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，考察了提取方法對芒果核仁多酚提取得率的影響，初步獲得多酚提取得率高的制備工藝；同時(shí)，對兩種工藝所得芒果核仁多酚的體外抗氧化活性進(jìn)行對比，揭示不同工藝對多酚抗氧化活性的影響規(guī)律，以期為芒果核仁的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芒果果實(shí)：采自國家熱帶果樹種質(zhì)資源圃芒果圃，取核仁，剔除表面雜物，蒸餾水清洗干凈，切成小片，50 ℃恒溫干燥36 h，粉碎后過60 目篩，置于干燥器中儲(chǔ)藏備用。

1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）：美國西格瑪奧德里奇公司；抗壞血酸（VC）：廣東光華化學(xué)試劑廠；2，2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽（ABTS）：德國柯蕾貝爾公司；沒食子酸、福林酚、無水碳酸鈉、水楊酸、雙氧水、鐵氰化鉀、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、冰乙酸等（以上試劑均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II 型高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo 公司；RE-3000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫公司；UV-1200 型紫外分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英峪高科儀器；DFY-200C 型高速萬能粉碎機(jī)：上海利聞科學(xué)儀器有限公司；FD-1C-50 型真空冷凍干燥機(jī)：上海喬躍電子有限公司；PS-30ALD 型超聲波清洗儀：深圳潔康洗凈電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果核仁多酚的超聲輔助提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g 芒果核仁粉末，加入適量提取劑，置于一定溫度和功率的超聲波清洗儀中進(jìn)行提取，過濾，收集濾液，將殘?jiān)貜?fù)提取1 次。合并上述濾液，測定多酚含量并計(jì)算提取得率。

1.3.2 芒果核仁多酚的熱回流提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g 芒果核仁粉末，與適量提取劑混合，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，連接回流冷凝管，按一定溫度提取，過濾，收集濾液，將殘?jiān)貜?fù)提取1 次。合并上述濾液，測定多酚含量并計(jì)算提取得率。

1.3.3 多酚含量的測定

參考李巨秀等[20]的方法進(jìn)行多酚含量的測定，并以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品得到回歸方程為：y=0.004 6x+0.005 4，R2=0.999 6。按下式計(jì)算多酚提取得率：

1.3.4 芒果核仁多酚提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 超聲輔助提取法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以多酚提取得率為指標(biāo)，探討不同提取溶劑、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度和液料比對多酚提取得率的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)定為：固定液料比40 ∶1（mL/g），超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲功率180 W，考察不同提取溶劑（蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、乙酸、丙酮、氯仿、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇）對多酚提取得率的影響；以60%乙醇做提取劑，在固定液料比 40 ∶1（mL/g），超聲溫度 50 ℃和超聲功率 180 W 的條件下，考察不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對多酚提取得率的影響；以60%乙醇做提取劑，在固定液料比 40 ∶1（mL/g），超聲溫度 50 ℃和超聲時(shí)間30 min 的條件下，考察不同超聲功率（120、140、160、180、200、220 W）對多酚提取得率的影響；以60%乙醇做提取劑，在固定液料比 40 ∶1（mL/g），超聲功率200 W 和超聲時(shí)間30 min 的條件下，考察不同超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對多酚提取得率的影響；以60%乙醇做提取劑，在固定超聲功率200 W、超聲溫度70 ℃和超聲時(shí)間30 min 的條件下，考察不同液料比[20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）]對多酚提取得率的影響。

1.3.4.2 熱回流提取法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以多酚提取得率為指標(biāo)，探討不同回流時(shí)間、回流溫度、乙醇濃度和液料比對多酚溶出量的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)定為：固定液料比 40 ∶1（mL/g），乙醇濃度60%、回流溫度70 ℃的條件下，考察不同回流時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對多酚提取得率的影響；固定液料比 40 ∶1（mL/g），乙醇濃度 60%、回流時(shí)間 2 h 的條件下，考察不同回流溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）對多酚提取得率的影響；固定液料比 40 ∶1（mL/g），回流時(shí)間2 h、回流溫度90 ℃的條件下，考察不同乙醇濃度（20、40、60、80、100 %） 對多酚提取得率的影響；固定回流時(shí)間2 h、乙醇濃度60%、回流溫度90 ℃的條件下，考察不同液料比[10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）]對多酚提取得率的影響。

1.3.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在上述各種提取方法單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多酚提取得率為指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用Design-Expert.v8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化芒果核仁多酚的提取工藝。每個(gè)自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼，共設(shè)計(jì)5 個(gè)中心點(diǎn)和29 個(gè)不同組合的試驗(yàn)，兩種提取方法的試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)分別見表1 和表2。

表1 超聲輔助提取法Box-Benhnken 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken design of ultrasonicassisted extraction

表2 熱回流提取法Box-Benhnken 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in Box-Benhnken design of thermalreflux extraction

1.3.5 芒果核仁多酚體外抗氧化活性分析

分別按照超聲輔助提取法和熱回流提取法的最優(yōu)工藝提取芒果核仁多酚，將浸提液濃縮后凍干待用。準(zhǔn)確稱取適量凍干粉，用60%乙醇配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣液，參照張莉等[21]的方法分別進(jìn)行 DPPH·、ABTS+·、O2-·、·OH 清除率和還原力的測定。

1.3.5.1 DPPH·清除率測定

取2 mL 不同濃度的樣品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，搖勻，室溫（25 ℃）條件下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光度Ai。以無水乙醇代替DPPH 溶液測定吸光度Aj，以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度A0。以VC作陽性對照。按照公式（2）計(jì)算DPPH·清除率，并通過計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.5.2 ABTS+·清除率測定

取50 μL 不同濃度的樣品溶液，加入4 mL ABTS+反應(yīng)液，混勻，避光反應(yīng)6 min，在732 nm 處測定吸光度Ax，以甲醇作空白對照測定吸光度A0。以VC作陽性對照。按照公式（3）計(jì)算ABTS+·清除率，并通過計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.5.3 O2-·清除率測定

取不同濃度樣品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.2），混勻，再分別加 25 mmol/L 鄰苯三酚0.4 mL，混勻。反應(yīng)5 min，加入10 mol/L HCl 終止反應(yīng)，測定325 nm 處吸光度值A(chǔ)m；同法，用蒸餾水代替鄰苯三酚，測吸光值為An；用蒸餾水代替樣品，測吸光值為Aq。以VC作陽性對照。按照公式（4）計(jì)算O2-·清除率，并通過計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.5.4 ·OH 清除率測定

分別吸取1 mL 不同濃度樣品溶液，依次加入0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混勻，靜置 30 min，于 510 nm 處測定吸光度Ai，用蒸餾水代替FeSO4測定不同濃度樣品溶液吸光度Aj，用蒸餾水代替樣品測定吸光度A0。以VC作陽性對照。按照公式（5）計(jì)算·OH 清除率，并通過計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.5.5 還原能力測定

分別吸取2.5 mL 不同濃度樣品溶液，依次加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）、1%K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min 后快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止反應(yīng)。取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 蒸餾水、0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，10 min 后于 700 nm 下比色，以 VC作陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。采用Design-Expert.v8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's Test 進(jìn)行差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果核仁多酚提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲輔助提取法單因素試驗(yàn)

采用超聲輔助法時(shí)，不同提取溶劑對芒果核仁多酚提取得率的影響見圖1。

圖1 超聲輔助提取法不同提取溶劑對芒果核仁多酚提取得率的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the extraction yield of mango kernel polyphenols by ultrasonic-assisted extraction

由圖1 可知，芒果核仁多酚在不同提取溶劑中的提取效果不同。水、乙醇、乙醇水溶液、甲醇和乙酸均能用于芒果核仁多酚的提取，但60%乙醇提取效果最好，而氯仿不適合用于芒果核仁多酚的提取，這可能與芒果核仁的組分以及多酚的物理性質(zhì)有極大關(guān)系[22]，說明強(qiáng)極性有機(jī)溶劑對多酚的提取效果優(yōu)于弱極性有機(jī)溶劑?？紤]到提取溶劑的價(jià)格和安全性，后續(xù)試驗(yàn)選擇60%乙醇作為芒果核仁多酚的最佳提取溶劑。

超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度和液料比對芒果核仁多酚提取得率的影響見圖2。

由圖2（a）可知，當(dāng)超聲時(shí)間小于30 min 時(shí)，多酚提取得率隨著超聲時(shí)間的延長逐漸增大。但超聲時(shí)間超過30 min 后，多酚提取得率呈下降趨勢。這可能是由于多酚在超聲環(huán)境中不穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長，易發(fā)生氧化[23]，也有可能是芒果核仁中氧化物氧化聚合生成沉淀[2]。因此，超聲時(shí)間應(yīng)選擇30 min 為宜。

圖2 超聲輔助提取法不同因素對芒果核仁多酚提取得率的影響Fig.2 Effects of different extraction factors on the extraction yield of mango kernel polyphenols by ultrasonic-assisted extraction

由圖2（b）可知，多酚提取得率隨著超聲功率的增大先增大后減小，在超聲功率為200 W 時(shí)多酚提取得率達(dá)到最大。這可能是因?yàn)殡S著超聲功率的增大，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和振動(dòng)加強(qiáng)，對細(xì)胞壁的破碎作用增大，有利于多酚的溶出[24]；當(dāng)功率高于200 W 時(shí)，溶出的多酚可能被破壞。因此，超聲功率以200 W 為宜。

由圖2（c）可知，多酚提取得率隨著超聲溫度的升高逐漸增大，當(dāng)超聲溫度超過70 ℃后，多酚提取得率隨之下降。說明適當(dāng)提高溫度對植物組織的浸潤具有一定的促進(jìn)作用，有利于多酚的溶出，但溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致已溶出的多酚發(fā)生分解[25]。因此，超聲溫度選擇70 ℃。液料比對多酚提取得率也存在一定的影響。

由圖2（d）可知，當(dāng)液料比低于 40 ∶1（mL/g）后，多酚提取得率隨著液料比的增大而增大，并在40 ∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大，此后繼續(xù)增大液料比，多酚提取得率增大不顯著。這是因?yàn)橐毫媳冗^小，溶劑無法與芒果核仁顆粒充分接觸，使多酚溶出受阻[26]，隨著液料比的增加多酚溶出越完全，當(dāng)其完全溶出時(shí)，繼續(xù)增大液料比對提取得率影響不大，且會(huì)造成溶劑浪費(fèi)并增加后續(xù)濃縮難度。因此，液料比應(yīng)選擇40 ∶1（mL/g）為宜。

2.1.2 熱回流提取法單因素試驗(yàn)

回流時(shí)間、回流溫度、乙醇濃度和液料比對芒果核仁多酚提取得率的影響見圖3。

由圖3（a）可知，多酚提取得率隨著回流時(shí)間的延長先增大后減小，并在回流時(shí)間為2.0 h 時(shí)達(dá)到最大。這可能是由于提取時(shí)間過長，已溶出的多酚發(fā)生了氧化反應(yīng)所致[27]。

圖3 熱回流提取法不同因素對芒果核仁多酚提取得率的影響Fig.3 Effects of different extraction factors on the extraction yield of mango kernel polyphenols by thermal-reflux extraction

由圖3（b）可知，回流溫度對多酚提取得率的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這可能是由于溫度的升高加快了多酚滲透、溶解和擴(kuò)散速度；然而，過高的溫度可能導(dǎo)致氧化或降解[25]。因此，回流溫度應(yīng)選擇90 ℃。

由圖3（c）可知，隨著乙醇濃度的增大，多酚提取得率呈先增大后減小趨勢，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)提取得率達(dá)到最大。一定濃度的乙醇溶液滲透能力較強(qiáng)，增大了細(xì)胞內(nèi)部滲透壓，利于多酚的溶出，但隨著乙醇濃度的增大，已溶出多酚對未溶出多酚的逸出產(chǎn)生阻力，不利于協(xié)同浸取[14]。

圖3（d）表明多酚提取得率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢，在液料比為50 ∶1（mL/g）時(shí)多酚提取得率最高。提取溶劑的增加更有利于多酚的溶出，但乙醇沸點(diǎn)較低，隨著溶劑的增多，加熱時(shí)易沸騰溢出或部分成分易隨蒸汽帶走，從而影響多酚的得率[14]。

2.2 芒果核仁多酚提取工藝優(yōu)化

2.2.1 超聲輔助提取法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

超聲輔助提取法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 超聲輔助提取法Box-Benhnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Box-Benhnken design arrangement and corresponding experimental results of ultrasonic-assisted extraction

續(xù)表3 超聲輔助提取法Box-Benhnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 3 Box-Benhnken design arrangement and corresponding experimental results of ultrasonic-assisted extraction

利用Design-Expert.v8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見表4。

表4 超聲輔助提取法回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction

續(xù)表4 超聲輔助提取法回歸模型方差分析Continue table 4 Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction

經(jīng)擬合回歸，得到以多酚提取得率（Y）為響應(yīng)值的多元回歸方程：

Y=11.64+0.05A-0.12B+0.29C-0.51D+0.09AB-0.15AC -0.41AD -0.04BC -0.04BD -0.03CD -1.01A2-0.77B2-0.58C2-1.09D2

從多元回歸方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，可以推斷出方程表示的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)，可進(jìn)行優(yōu)化分析。方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小可以反映出各因素對響應(yīng)值的影響程度，進(jìn)而得出4個(gè)因素對多酚提取得率的影響主次順序?yàn)椋阂毫媳龋境暅囟龋境暪β剩境晻r(shí)間。從表4 可知，回歸模型p＜0.000 1，表明該模型具有顯著性。同時(shí)，失擬項(xiàng)p值不顯著，表明所選的二次回歸模型對實(shí)際情況擬合較好；模型的決定系數(shù)R2=0.923 6，校正決定系數(shù)R2Adj=0.847 2，說明實(shí)測值與預(yù)測值相關(guān)性較好。因此，可以用該模型對超聲輔助提取法提取芒果果核仁多酚的提取得率進(jìn)行理論預(yù)測。顯著性分析表明，一次項(xiàng) C、D 及二次項(xiàng) A2、B2、C2和 D2對多酚提取得率影響極顯著，交互項(xiàng)AD 對多酚提取得率影響顯著，其他交互項(xiàng)影響不顯著。

超聲輔助提取法不同因素交互作用對多糖提取得率的影響見圖4。

從曲面圖和等高線圖可以看出在不同取值的變量下各變量之間交互作用的顯著程度。圖4（a）等高線顯示，液料比和超聲溫度處于0 水平時(shí)，超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用不顯著，當(dāng)固定超聲功率時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，多酚提取得率先增大后逐漸降低；當(dāng)固定超聲時(shí)間時(shí)，隨著超聲功率的增大，多酚提取得率先增大后減??；響應(yīng)面圖顯示，多酚提取得率在超聲時(shí)間的0～1 水平和超聲功率的-1～0 水平之間有最大值。

圖4 超聲輔助提取法不同因素交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot of interaction effects of different factors by ultrasonic-assisted extraction

圖4（b）顯示，液料比和超聲功率為0 水平時(shí)，超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用不顯著，其中超聲時(shí)間的影響強(qiáng)度低于超聲溫度，多酚提取得率在超聲溫度的0～1 水平之間有最大值。

由圖4（c）可知，超聲功率和超聲溫度為0 水平時(shí)，固定液料比，多酚提取得率隨著超聲時(shí)間的延長先增大后減小，固定超聲時(shí)間，多酚提取得率隨著液料比的增加先增大后緩慢降低，且液料比的影響強(qiáng)度大于超聲時(shí)間，兩因素間等高線呈橢圓型，說明二者交互作用顯著。

由圖4（d）、4（e）和 4（f）可知，超聲功率和超聲溫度，超聲功率和液料比，超聲溫度和液料比的交互作用不顯著。

通過Design-Expert.v8.0.6 軟件求解回歸方程，得到超聲輔助提取法提取芒果核仁多酚的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間31min，超聲功率199W，超聲溫度79℃，液料比38 ∶1（mL/g），預(yù)測多酚提取得率可達(dá)11.74%。考慮到實(shí)際操作的方便性，將最優(yōu)條件調(diào)整為超聲時(shí)間30 min，超聲功率200 W，超聲溫度79 ℃，液料比38 ∶1（mL/g），按此工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到芒果核仁多酚提取得率平均值為11.62%，與預(yù)測值接近，說明該模型能較好的預(yù)測芒果核仁多酚提取得率。

2.2.2 熱回流提取法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

熱回流提取法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

利用Design-Expert.v8.0.6 軟件對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見表6。

表5 熱回流提取法Box-Benhnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Box-Benhnken design arrangement and corresponding experimental results of thermal-reflux extraction

表6 熱回流提取法回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of the constructed regression model by thermal-reflux extraction

續(xù)表6 熱回流提取法回歸模型方差分析Continue table 6 Analysis of variance of the constructed regression model by thermal-reflux extraction

經(jīng)擬合回歸，得到以多酚提取得率（Y'）為響應(yīng)值的多元回歸方程：

Y'=7.27-0.03E+0.18F-0.05G+0.13H+0.09EF-0.03EG+0.02EH-0.05FG-0.03FH-0.12GH-0.30E2-0.28F2-0.68G2-0.31H2

由表6 可知，回歸模型p＜0.000 1，說明該模型具有顯著性。同時(shí)，失擬項(xiàng)p 值不顯著，表明該二次多項(xiàng)回歸方程對實(shí)際情況擬合情況好；模型的決定系數(shù)R2=0.928 3，說明實(shí)測值與預(yù)測值相關(guān)性較好。因此，可以用該模型對熱回流提取法提取芒果核仁多酚的提取得率進(jìn)行理論預(yù)測。顯著性分析表明，一次項(xiàng)F 對多酚提取得率影響極顯著，H 對多酚提取得率影響顯著，二次項(xiàng)E2、F2、G2和H2對多酚提取得率的影響也達(dá)到極顯著水平，各交互項(xiàng)對多酚提取得率無顯著影響。各因素對芒果核仁多酚提取得率影響的大小順序?yàn)椋篎＞H＞G＞E，即回流溫度＞液料比＞乙醇濃度＞回流時(shí)間。

通過Design-Expert.v8.0.6 軟件求解回歸方程，得到熱回流提取法提取芒果核仁多酚的最佳提取工藝為：回流時(shí)間2 h，回流溫度93 ℃，乙醇濃度59%，液料比 52 ∶1（mL/g），預(yù)測多酚提取得率可達(dá) 7.32%。按此工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到芒果核仁多酚提取得率平均值為7.41%，與預(yù)測值接近，表明響應(yīng)面法所得芒果核仁多酚的提取工藝參數(shù)可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

熱回流提取法不同因素交互作用對多糖提取得率的影響見圖5。

2.3 兩種提取方法對比

對芒果核仁多酚兩種提取方法的最佳工藝進(jìn)行對較，結(jié)果見表7。

圖5 熱回流提取法不同因素交互作用對多糖提取得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of interaction effects of different factors by thermal-reflux extraction

表7 芒果核仁多酚兩種提取方法的比較Table 7 Comparison of two extraction methods of mango kernel polyphenols

由表7 可知，超聲輔助提取法的多酚提取得率比熱回流提取法高出36.23%。此外，與熱回流提取法相比，超聲輔助提取法的提取時(shí)間較短，提取溫度和液料比均較低。因此，從多酚提取得率和生產(chǎn)成本的角度考慮，利用超聲輔助提取法提取芒果核仁多酚比熱回流提取法更合適。

2.4 兩種方法所得芒果核仁多酚體外抗氧化活性分析

以 DPPH·、ABTS+·、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率以及還原力為指標(biāo)，綜合評價(jià)芒果核仁多酚的體外抗氧化活性，并以Vc 溶液為對照，結(jié)果如圖6 所示。

芒果核多酚對 DPPH·、ABTS+·、O2-·和·OH 的半抑制濃度（IC50）見表 8。

圖6 芒果核仁多酚對 DPPH·、ABTS+·、O2-·和·OH 的清除效果及還原力Fig.6 Scavenging capacity and reducing power of mango kernel polyphenols on DPPH·、ABTS+·，superoxide anion and hydroxyl radicals

表8 芒果核多酚抗氧化活性Table 8 Antioxidant activities of mango kernel polyphenols

DPPH·具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)，極易形成自由基。在反應(yīng)體系中對DPPH·的清除率越高，表明物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[28]。由圖6（a）可知，兩種方法所得的芒果核仁多酚對DPPH·的清除能力均較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度僅為40 μg/mL 時(shí)，二者對DPPH·的清除率均已達(dá)80%以上，且隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加；根據(jù)IC50值可以看出，不同樣品對DPPH·的清除能力由高到低依次為VC＞超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚＞熱回流提取法所得芒果核仁多酚。

由圖6（b）可知，超聲輔助提取法和熱回流提取法所得芒果核仁多酚對ABTS+·的清除能力均較強(qiáng)，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，在濃度為200 μg/mL～600 μg/mL 時(shí)，二者對 ABTS+·的清除能力增強(qiáng)顯著，且超聲輔助法所得芒果核多酚對ABTS+·的清除能力大于熱回流提取法。當(dāng)質(zhì)量濃度超過600 μg/mL 后，二者對ABTS+·的清除能力差異不顯著；根據(jù)IC50值可知，不同樣品對ABTS+·清除能力的關(guān)系為VC＞超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚＞熱回流提取法所得芒果核仁多酚。

由圖6（c）可知，超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚對O2-·的清除能力均強(qiáng)于同濃度熱回流提取法所得芒果核仁多酚，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，但均低于同濃度的VC；根據(jù)IC50值可以看出，不同樣品對O2-·的清除能力由高到低依次為VC＞超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚＞熱回流提取法所得芒果核仁多酚。

由圖6（d）可知，各濃度超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚對·OH 的清除能力與熱回流提取法差異不顯著，且均低于同濃度的VC；根據(jù)IC50值可知，不同樣品對·OH 清除能力的關(guān)系為VC＞超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚＞熱回流提取法所得芒果核仁多酚。此外，超聲輔助提取法和熱回流提取法所得芒果核仁多酚均具有較強(qiáng)的還原力（圖6e），當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL～400 μg/mL 時(shí)，熱回流提取法所得芒果核仁多酚的還原力大于超聲輔助提取法，當(dāng)濃度超過400 μg/mL 后，二者還原力差異不顯著，但均高于同濃度的VC溶液。

雖為相同質(zhì)量濃度的芒果核仁多酚，但抗氧化活性卻不同，說明提取方法對芒果核仁多酚活性具有一定的影響，這與李新原等[29]和葉新紅[30]的研究結(jié)果相似，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于不同的提取條件影響了多酚抗氧化官能團(tuán)與其他分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致抗氧化活性的差異[29]。上述抗氧化活性分析試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助提取法比熱回流提取法更有利于保留芒果核仁多酚的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本研究以多酚提取得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分別優(yōu)選了超聲輔助提取法和熱回流提取法提取芒果核仁多酚的工藝參數(shù)，通過對比發(fā)現(xiàn)，超聲輔助提取法優(yōu)于熱回流提取法，其最佳提取工藝為：超聲時(shí)間30 min，超聲功率200 W，超聲溫度 79 ℃，液料比 38 ∶1（mL/g），在此條件下，芒果核仁多酚提取得率為11.62%。通過對比超聲輔助提取法和熱回流提取法所得芒果核仁多酚的體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，超聲輔助提取法所得芒果核仁多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對 DPPH·、ABTS+·、O2-·和·OH 的清除能力均強(qiáng)于熱回流提取法，說明超聲輔助提取法對芒果核仁多酚的抗氧化活性損失較少。此外，超聲輔助提取法所需時(shí)間短、能耗低、溶劑消耗量少、提取得率高，有望成為高品質(zhì)芒果核仁多酚的制備方法，但有關(guān)芒果核仁多酚抗氧化及其他生物活性和構(gòu)效關(guān)系有待深入研究。