lncRNA HSD52在卵巢癌組織中的表達(dá)及其對卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

張瑜 吳美琴 涂紅勤 張清 曾友玲

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）婦科（武漢433016）

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、病死率高的特點，近年來有年輕化的趨勢［1］。目前卵巢癌仍缺乏早期有效的診斷方法，多數(shù)患者就診時已處于晚期，因而預(yù)后較差［2］。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因失活等多種分子改變。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是近些年新發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA 分子，通過轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾、核內(nèi)運輸、轉(zhuǎn)錄干擾等多種方式調(diào)控基因的表達(dá)［3-4］。有研究［5-7］表明，lncRNA 與人類各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、胃癌等中均存在異常表達(dá)的lncRNA，其表達(dá)量與腫瘤的大小、臨床分期、預(yù)后顯著相關(guān)。越來越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)參與卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、衰老等生物過程，更多的lncRNA 有待探索［8-9］。本研究首先通過檢測多個尚未報道研究的lncRNA 在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果表明lncRNA HSD52在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯降低，其表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因而lncRNA HSD52 在卵巢癌中的作用機制研究可能具有重要意義。本研究旨在檢測lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，觀察其對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，初步探討其分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年2月至2019年5月本院婦科73例卵巢癌根治性手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織，術(shù)后立即于液氮中冷凍保存。所有標(biāo)本均經(jīng)本院兩名以上病理科專家確診?；颊吣挲g36 ～69 歲，平均（46.76 ± 9.52）歲。病理分型：漿液性癌41例，黏液性癌13例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期36例。所有患者術(shù)前均未行放化療，本研究經(jīng)本院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞與主要試劑載有l(wèi)ncRNA HSD52 序列的質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自上海吉凱公司。正常卵巢上皮細(xì)胞（IOSE80）和卵巢癌細(xì)胞株（OC3、A2780、OVCAR-3、HO-8910、SKOV-3）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司。噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。熒光實時定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。ECL 顯影液購自美國Thermo 公司。一抗（EDN3、α-Tubulin、p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun）和二抗購自美國Abcam 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IOSE80、A2780、HO-8910、SKOV-3 接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，OC3、OVCAR-3 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的SKOV-3 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到30%時，采用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑將載有l(wèi)ncRNA HSD52 序列的質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SKOV-3 細(xì)胞，分別命名為實驗組和對照組，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)基。

1.4 RNA提取和熒光實時定量PCR（qRT-PCR）應(yīng)用TRIzol 提取卵巢癌組織或細(xì)胞株的總RNA，檢測RNA 濃度和純度后，以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH 為內(nèi)參檢測lncRNA HSD52 和EDN3 mRNA 的表達(dá)，以U6 為內(nèi)參檢測miR-498-5p的表達(dá)。GAPDH 上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；lncRNA HSD52 上游引物為5′-TGCCCTGGAAGGGACTAGA-3′，下游引物為5′-TTGCAAATGCTGTCCACTTG-3′；EDN3 上游引物為5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′，下游引物為5′-GCAGGCCTTGTCATATCTCC-3′；miR-498-5p 上游引物為5′-GGGAAAGTTCGGTCCC-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性10 min，62 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCt方法計算表達(dá)量。

1.5 MTT 法檢測SKOV-3 細(xì)胞增殖能力將對照組和實驗組SKOV-3 細(xì)胞分別接種于96 孔板，每孔200 μL，細(xì)胞密度為1×104個/mL。分別于接種后第1、2、3、4、5 天，每孔加入20 μL MTT 試劑（濃度為5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床振蕩25 min。酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm 波長處的光密度（OD）值。每個時間點設(shè)4 個復(fù)孔，實驗重復(fù)4 次。

1.6 Matrigel 侵襲實驗檢測SKOV-3 細(xì)胞侵襲能力應(yīng)用Matrigel 膠包被Transwell 上室的微孔膜。將對照組和實驗組SKOV-3 細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基重懸后，分別接種于Transwell 上室，每孔200 μL，細(xì)胞密度為5 × 104個/mL。下室加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)24 h 后，用棉簽輕輕擦去微孔膜上室面細(xì)胞。多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS 溶液洗3 次。0.1%結(jié)晶紫染液室溫下染色30 min，PBS 溶液洗3 次。室溫下晾干后，在高倍顯微鏡下隨機選取4 個視野記穿膜細(xì)胞數(shù)，拍照并統(tǒng)計。實驗重復(fù)4 次。

1.7 生物信息學(xué)軟件預(yù)測lncRNA HSD52 的作用機制 應(yīng)用LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測lncRNA HSD52 配對結(jié)合的miRNA，應(yīng)用miRanda 軟件預(yù)測miRNA 配對結(jié)合的基因。

1.8 Western Blot實驗檢測EDN3蛋白的表達(dá)收集處于對數(shù)生長期的兩組SKOV-3 細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。測定蛋白濃度后，以40μg/孔蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。應(yīng)用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF 膜2 h，孵育一抗EDN3（1∶1 000 稀釋）、p-ERK（1∶1 000 稀釋）、AP-1（1∶2 000 稀釋）、c-fos（1∶2 000）、c-Jun（1∶2 000）及α-Tubulin（1∶1 000），在4 ℃下孵育過夜。次日洗膜后，在室溫下孵育二抗2 h，洗膜后應(yīng)用ECL 顯影劑進行顯影曝光，α-Tubulin 為蛋白內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細(xì)胞株中均呈低表達(dá)qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，lncRNA HSD52 在73例卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為0.76 ± 0.13 和5.18 ± 0.64。與癌旁組織相比，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA HSD52 的表達(dá)明顯降低（t=32.87，P＜0.01）。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，lncRNA HSD52 在卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3、PC-3、C4-2B、22Rv1、DU-145）和正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80中的表達(dá)分別為0.69 ± 0.02、0.43 ± 0.02、0.79 ±0.02、0.31 ± 0.03、0.13 ± 0.02 和1.01 ± 0.07。與正常卵巢上皮細(xì)胞相比，lncRNA HSD52 在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），其中在SKOV-3 細(xì)胞中表達(dá)最低（P＜0.01），見圖1。

圖1 lncRNA HSD52 在卵巢癌細(xì)胞株和正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression level of lncRNA HSD52 in ovarian cancer cell lines and normal ovarian epithelial cell

2.2 轉(zhuǎn)染載有l(wèi)ncRNA HSD52 序列質(zhì)粒上調(diào)SKOV-3 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HSD52 的表達(dá)轉(zhuǎn)染載有l(wèi)ncRNA HSD52 序列質(zhì)粒后48 h，qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HSD52表達(dá)量分別為10.37±1.58和1.01±0.07。與對照組相比，實驗組SKOV-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HSD52的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。

2.3 上調(diào)lncRNA HSD52 抑制SKOV-3 細(xì)胞的增殖能力MTT 檢測結(jié)果顯示，在接種后第2、3、4、5天，上調(diào)lncRNA HSD52 的實驗組SKOV-3 細(xì)胞OD值明顯低于對照組（P＜0.05），表明上調(diào)lncRNA HSD52 可抑制SKOV-3 細(xì)胞的增殖能力，見圖2。

圖2 上調(diào)lncRNA HSD52 對SKOV-3 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of overexpression lncRNA HSD52 on the proliferation of SKOV-3 cells

2.4 上調(diào)lncRNA HSD52 明顯抑制SKOV-3 細(xì)胞的侵襲能力Matrigel 侵襲實驗結(jié)果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)分別為43.10 ± 7.85 和94.58 ± 9.82，實驗組明顯低于對照組（P＜0.01），表明上調(diào)lncRNA HSD52 可抑制SKOV-3 細(xì)胞的侵襲能力。見圖3。

圖3 上調(diào)lncRNA HSD52 對SKOV-3 細(xì)胞侵襲能力的影響（100×）Fig.3 Effect of overexpression lncRNA HSD52 on the invasion of SKOV-3 cells（100×）

2.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測lncRNA HSD52 的分子作用機制應(yīng)用LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測顯示，lncRNA HSD52 可配對結(jié)合miR-498-5p；應(yīng)用miRanda 軟件預(yù)測顯示，miR-498-5p 可配對結(jié)合EDN3 mRNA，見圖4。

圖4 生物信息學(xué)軟件預(yù)測lncRNA HSD52 作用機制Fig.4 Bioinformatics technology predicts the mechanism of action of lncRNA HSD52

2.6 上調(diào)lncRNA HSD52 對SKOV-3 細(xì)胞中miR-498-5p 和EDN3 mRNA 表達(dá)的影響qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，實驗組和對照組SKOV-3 細(xì)胞中miR-498-5p 表達(dá)分別為0.19 ± 0.05 和1.00 ± 0.03，實驗組miR-498-5p 的表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.01）。實驗組和對照組SKOV-3 細(xì)胞中EDN3 mRNA 表達(dá)分別為6.32±0.492 和1.01±0.06，實驗組EDN3 mRNA 的表達(dá)明顯高于對照組（P＜0.01），表明上調(diào)lncRNA HSD52 可降低miR-498-5p的表達(dá)，促進EDN3 mRNA 的表達(dá)。

2.7 上調(diào)lncRNA HSD52 對EDN3 蛋白和ERK 信號通路蛋白表達(dá)的影響Western Blot 檢測結(jié)果顯示，上調(diào)lncRNA HSD52 后，EDN3 蛋白表達(dá)水平增加，ERK 信號通路如p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun 等多種蛋白的表達(dá)明顯降低，提示上調(diào)lncRNA HSD52 后ERK 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制，見圖5。

3 討論

圖5 上調(diào)lncRNA HSD52 對SKOV-3 細(xì)胞EDN3 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of high-expressed lncRNA HSD52 on the expression of EDN3 protein and related proteins in SKOV-3 cells

卵巢癌是威脅女性健康的最常見腫瘤之一，其異常的增殖和轉(zhuǎn)移能力是影響卵巢癌患者預(yù)后的重要因素［10-11］。lncRNA 最初被認(rèn)為是RNA 聚合酶Ⅱ的副產(chǎn)物，屬于基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不能發(fā)揮任何生物學(xué)功能［12-13］。越來越多的研究顯示，lncRNA 在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有望成為卵巢癌診斷和治療的有效靶點［14-16］。YOU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6-AS1 在卵巢癌組織中顯著高表達(dá)，通過靶向作用于miR-613，促進卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。SHEN 等［18］通過比較卵巢癌組織和癌旁組織發(fā)現(xiàn)，LINC01627 在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯增加，與卵巢癌患者的不良預(yù)后關(guān)系密切。lncRNA HSD52 是一種由1 094 個核苷酸組成的lncRNA，其對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響并不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織和正常卵巢上皮細(xì)胞相比，卵巢癌組織和細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA HSD52 的表達(dá)均明顯下降，表明lncRNA HSD52 可能參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。MTT 法和Matrigel 侵襲實驗進一步顯示，上調(diào)lncRNA HSD52 可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，lncRNA HSD52 可能在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因作用。lncRNA 發(fā)揮基因調(diào)控作用的重要分子機制之一是“競爭性內(nèi)源RNA”，即通過競爭性結(jié)合內(nèi)源性miRNA，干擾miRNA 與其靶基因mRNA 之間的靶向結(jié)合，間接促進靶基因mRNA 的翻譯［19-21］。lncRNA HSD52 在卵巢癌中的抑癌作用可能依賴于“競爭性內(nèi)源RNA”機制。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA HSD52 與miR-498-5p 之間存在結(jié)合位點，miR-498-5p 與EDN3 mRNA 之間存在結(jié)合位點。有研究表明，miR-498-5p 可明顯促進前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，降低腫瘤的放療敏感性，發(fā)揮原癌基因作用［22］。EDN3 基因位于染色體20q13，是血管內(nèi)皮素家族成員之一，主要作用于細(xì)胞表面的內(nèi)皮素受體B［23］。EDN3 蛋白在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與患者的總生存期具有相關(guān)性［24］。EDN3 蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物功能，發(fā)揮明顯的抑癌基因作用［25］。本研究通過qRT-PCR檢測和Western Blot 實驗表明，lncRNA HSD52 過表達(dá)可降低miR-498-5p的表達(dá)，同時促進miR-498-5p 下游靶基因EDN3 的表達(dá)。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，SKOV-3 細(xì)胞中EDN3蛋白表達(dá)增加后，ERK 信號通路蛋白如p-ERK、AP-1、c-fos 和c-Jun 的表達(dá)明顯降低，ERK 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制，提示EDN3 蛋白可能通過抑制ERK信號通路發(fā)揮作用。下一步的研究方向是通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灻鞔_lncRNA HSD52 與miR-498-5p 的靶向結(jié)合位點，驗證lncRNA HSD52在動物體內(nèi)對卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HSD52 在卵巢癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)，上調(diào)lncRNA HSD52 可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其分子作用機制為特異性吸附miR-498-5p 調(diào)控EDN3 基因的表達(dá)。lncRNA HSD52 的研究可能為卵巢癌診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物及治療靶點。