胃癌組織中SPAG5的表達及意義

葛柯樂，方成，燕海嬌，袁青玲，陳文玉，王琦，吳駿

蘇州大學附屬第三醫(yī)院，江蘇常州 213003

胃癌是一種異質性、多因素的疾病，是常見的惡性腫瘤之一。早期胃癌癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時已是胃癌晚期，預后差，病死率高[1]。因此，迫切需要探尋出新的診斷方法和準確評估患者預后的標志物，這對臨床研究及患者的治療具有重要的指導意義。2001年，驅動蛋白家族成員精子相關抗原5(SPAG5)被首次發(fā)現(xiàn)，其也稱為有絲分裂紡錘體相關蛋白5[2,3]。SPAG5作為紡錘體結合蛋白之一，在有絲分裂S期通過C-未端序列結合于紡錘體，在細胞周期M期表達升高，調控有絲分裂中紡錘體的裝配時間及姐妹染色體分離，主要表達于精原細胞，在胃、腸、肝臟等正常組織中低表達[4～7]。SPAG5表達的高低與細胞的增殖狀態(tài)密切相關，下調細胞的SPAG5蛋白表達，將形成多級異常紡錘體，致使分裂停止[8,9]。已有相關研究[10～12]表明，SPAG5具有促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，SPAG5參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在宮頸癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌及膀胱癌中SPAG5表達量增加，且其過表達與患者不利的預后相關[10,12～14]。提示SPAG5可能是參與癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要致癌基因，可視為潛在的治療靶點。SPAG5在胃癌中的作用尚不清楚，本項研究旨在檢測SPAG5在胃癌組織中的表達變化，同時分析其與患者臨床病理特征的關系，明確SPAG5在胃癌患者中預后價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集2015年9月～2017年3月在常州市第一人民醫(yī)院行胃癌根治術的41例患者的臨床資料。其中，男30例、女11例，年齡30～73歲、中位年齡61歲。所有病例為經(jīng)手術治療的初診患者，術后經(jīng)2名以上病理學專家確診，并按照WHO胃癌組織學分類和分級標準進行胃癌分期的判定。納入標準：①術后切除標本經(jīng)病理診斷證實為胃癌；②臨床病例資料完整，隨訪數(shù)據(jù)準確。排除標準：①合并其他原發(fā)腫瘤；②合并其他影響胃癌預后的疾病或因素。術后標本取出后部分保存于液氮中，部分用10%多聚甲醛固定并包埋在石蠟中。

同時，從上海芯超生物有限公司購買胃癌組織芯片(HStm-A180Su-11)。芯片中包含180例芯點(90例癌組織和與之匹配的90例癌旁組織)。組織來源患者中男61例、女29例，中位年齡65.5歲。所有患者術前均未接受放射或化學等其他治療，芯片中所有組織經(jīng)病理專家讀片確診為胃癌。胃癌TNM分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期系統(tǒng)(2010年第七版)。

1.2 SPAG5 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR。利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取組織樣本中的總RNA，紫外分光光度儀測定260、280 nm吸光度值，計算RNA含量。根據(jù)PrimeScriptTMRT(Clontech Laboratories)試劑盒說明書步驟逆轉錄成cDNA。采用ABI Prism 7900HT熒光定量PCR儀檢測(Applied Biosystems)，以ABL1作為內參，每個實驗重復做3次。SPAG5和ABL1基因的引物及TaqMan探針采用美國ABI公司商品(Hs00197708_m1和Hs00245445_m1)。RT-PCR體系為：TaqMan?Gene Expression Master Mix(2×) 10 μL，引物及TaqMan探針1 μL，cDNA 2 μL(相當于100 mg RNA)，加雙蒸水補足反應總體積為20 μL。反應條件為：50 ℃ 2 min預變性，95 ℃ 10 min熱啟動，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火延伸，40個循環(huán)，60 ℃延伸時采集熒光信號。將SPAG5基因已知陽性模板從10～1×103倍比稀釋，作標準曲線，曲線斜率為-0.301 9，相關系數(shù)為0.9966。PCR擴增效率106%，提示該PCR反應體系及引物均正常。ABL1內參基因的實時熒光定量PCR體系及條件同SPAG5基因，反應40個循環(huán)。采用2-ΔCt進行相對定量分析。

1.3 SPAG5蛋白檢測 采用免疫組化法。實驗步驟嚴格按照鏈霉菌親和素—過氧化物酶法(SP)兩步法進行。SPAG5抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。常規(guī)脫蠟、水化,3% H2O2室溫孵育15 min,枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復,加入多克隆兔抗人SPAG5抗體(稀釋比1∶1 000)置于室溫下2 h，使用Envisionfi過氧化物酶試劑盒(Dako)檢測抗原抗體反應。然后將組織在室溫下用0.05% 3,3-二氨基聯(lián)苯胺(Dako)中孵育30 s，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色后請兩位中級職稱以上病理醫(yī)生采用半定量H-score評分法對組織標本進行評分，每個標本隨機取5個高倍視野(200倍)，以細胞質和細胞膜中出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，以染色強度和該強度下細胞的百分比乘積定為標本染色評分[15]。染色強度從陰性至強陽性分別計為1、2、3分；陽性細胞率0計0分，≤10%計1分，>10%～50%計2分，>50%～80%計3分，>80%計4分；總分為0～12，將0～6定為低表達、8～12為高表達。

1.4 隨訪 患者術后隨訪采用電話或門診復查形式，末次隨訪時間為2019年05月01日。總生存期(OS)為從病理確診日期到死亡日期或末次隨訪時間；無疾病生存期(DFS)為從病理確診日期到疾病復發(fā)或死亡時間。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件包和Graphpad Prism 8.0.1進行統(tǒng)計學分析及繪圖。首先對檢測數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，偏態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)(四分數(shù))[M(P25,P75)]表示。根據(jù)Cutoff Finder網(wǎng)站獲取SPAG5 mRNA評估預后的截斷值[16]。采用Wilcoxon秩和檢驗比較胃癌組織和癌旁組織SPAG5表達的差異；采用Mann-WhitneyU檢驗、χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗比較SPAG5表達與患者臨床病理特征的差異；采用Kaplan-Meier方法建立生存曲線，Log-Rank檢驗方法比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SPAG5 mRNA在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 SPAG5 mRNA在所有胃癌組織中均表達，中位相對表達量為0.300(0.145,0.683)。從Cutoff Finder網(wǎng)站獲SPAG5 mRNA的最佳截斷值為0.184，并根據(jù)截斷值分為高表達者30例和低表達者11例。SPAG5 mRNA表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關系見表1。

表1 41例胃癌組織中SPAG5 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.2 SPAG5蛋白在胃癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性 41例胃癌患者中，SPAG5蛋白高表達率75.6%(31/41)，低表達率24.4%(10/41)；胃癌組織中SPAG5蛋白表達與患者臨床病理特征的關系見表2。在胃癌組織芯片研究中，有4例癌組織實驗過程中脫落，剩余86例有效樣本進行研究。發(fā)現(xiàn)胃癌組織SPAG5蛋白表達高于癌旁組織(胃癌組織和癌旁組織的H-score評分中位值分別為8和4)，P<0.01；SPAG5蛋白高表達率69.8%(60/86)，低表達率30.2%(26/86)；SPAG5蛋白表達與患者臨床病理特征的關系見表3。

表2 41例胃癌組織中SPAG5蛋白表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

注：本表格中理論頻數(shù)均小于5，采用Fisher確切概率檢驗。

2.3 SPAG5表達與胃癌患者預后的關系 41例胃癌患者均獲取隨訪，中位DFS和OS分別為28(11.5～35.0)、33(18.5～36.0)個月。芯片組織中胃癌患者隨訪時間為88個月，中位OS為24.0(8.0～84.3)個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，在41例胃癌組織中，SPAG5 mRNA高表達者無病生存率和總生存率分別為46.67%、53.33%，低表達者分別為54.55%、81.82%，兩者比較差異均無統(tǒng)計學意義；SPAG5蛋白高表達者無病生存率和總生存率分別為48.39%、58.06%，低表達者分別為50.00%、70.00%，兩者比較差異均無統(tǒng)計學意義。在胃癌芯片組織中，SPAG5蛋白高表達者總生存率(31.67%)與低表達者(42.31%)比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

胃癌已成為癌癥死亡的最常見病因之一，根據(jù)國際癌癥研究機構發(fā)布的2018年全球最新癌癥統(tǒng)計報告顯示，因癌癥死亡的病例中，胃癌占8.2%，居第2位[17]。盡管胃癌診療技術不斷完善，但是胃癌5年生存率仍很低[18]，因此迫切需要胃癌早期診斷和評估患者預后的生物標志物。大量研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與過表達一些致癌基因密切相關。近來研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤中可檢測位于染色體Ch17q11.2上SPAG5基因的過表達且其參與體內不同的分子生物學過程包括細胞增殖和凋亡[19,20]。2016年Abdel-Fatah等報告在10%～19%乳腺癌中存在Ch17q11.2基因位點擴增，且SPAG5基因拷貝畸變數(shù)與患者不利的臨床預后及不良的臨床病理特征相關，包括TP53突變、PAM50-LumB表型和PAM50-HER2表型等[19]。更進一步研究顯示，SPAG5高表達與患者預后不良相關。SPAG5高表達患者對含蒽環(huán)類藥物的新輔助化療更敏感，患者生存期更長，其原因可能是SPAG5擴增導致染色體不穩(wěn)定和紡錘體著絲點松弛，提高蒽環(huán)類藥物干擾有絲分裂，從而提高抗腫瘤作用，故SPAG5是乳腺癌患者蒽環(huán)類新輔助化療方案的獨立預測因子之一[19,21]。下調宮頸癌中SPAG5的表達發(fā)現(xiàn)，有絲分裂G2/M期受阻，細胞增殖受抑，從而阻止癌細胞的轉移和增殖[12]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)SPAG5可通過上調Wnt3來激活AKT/mTOR信號通路，促進膀胱癌細胞增殖，抑制其凋亡。在肝癌研究中，SPAG5通過β-catenin/TCF4信號通路下調SCARA5的表達促進肝癌細胞增殖[11]。綜上可見，SPAG5目前多被認為發(fā)揮促進腫瘤細胞生長的作用，可視為新的生物標志物。

表3 胃癌組織芯片中SPAG5蛋白表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

為探索SPAG5與胃癌的關系，對41例胃癌患者研究發(fā)現(xiàn)，SPAG5 mRNA表達與胃癌患者臨床病理因素無明顯相關性，SPAG5蛋白表達僅與患者的性別相關，女性患者高表達比例高于男性。生存分析發(fā)現(xiàn)，SPAG5表達與患者DFS及OS均無明顯相關性。考慮前期研究樣本量偏少，且缺少癌旁組織進行對照，為進一步完善實驗，獲得更可靠的實驗結果，我們檢測了商品化的胃癌組織芯片中SPAG5的表達，結果發(fā)現(xiàn)癌組織SPAG5表達高于癌旁組織，但SPAG5蛋白表達高低與患者臨床病理因素及OS均無顯著相關性。雖然芯片組織中SPAG5蛋白表達高低與性別無明顯相關性，但女性患者高表達比例高于男性，因此，SPAG5與性別的關系需進一步研究。采用UALCAN網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者SPAG5 mRNA表達與OS的關系，同樣發(fā)現(xiàn)SPAG5基因表達與OS無相關(P=0.79)，結果與本課題一致，提示SPAG5在胃癌中無預后判斷價值。但是，Liu等[22]最近報道SPAG5高表達與胃癌患者不利預后顯著相關，且高表達與腫瘤直徑≥5 cm和晚分期明顯相關，女性患者高表達比例高于男性(66% vs. 58%)，但差異不顯著，進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，SPAG5通過上調Survivin蛋白，激活wnt/β-catenin信號通路，促進胃癌細胞增殖。雖然本研究的結果與TCGA數(shù)據(jù)庫一致，但是與Liu等實驗結果存在差異，這可能與特定的人群及樣本量相關。此外，實驗材料和過程以及結果判讀與本研究也不盡相同。

本項研究仍然存在一些不足之處，該研究為回顧性研究，樣本量偏少，關于患者信息及疾病特征的收集納入會存在不可控的偏倚，且患者術后治療方式不能詳細獲得。此外，該研究納入的臨床數(shù)據(jù)有限，因此SPAG5與胃癌患者其他的臨床病理特征的相關性無法分析。由于SPAG5與患者預后無顯著相關性，所以未進一步擬合COX回歸分析。因此，需要從不同醫(yī)院收集更多的胃癌標本來證實SPAG5與胃癌的關系。SPAG5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學機制需要進一步闡明。

綜上所述，胃癌組織中SPAG5表達高于癌旁組織，SPAG5表達高低可能與患者性別有關，SPAG5不具有評估胃癌患者預后作用，需進一步擴大樣本來驗證結果的可靠性。