胃癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、Atg5的表達(dá)變化及臨床意義

韋斌,黃俏瑩,黃順榮，鐘曉剛，麥威，牙韓清，朱州，張貴年

1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

胃癌屬于常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其病死率在惡性腫瘤中位居第二，而中國(guó)的胃癌病死率約占世界的43%[1]。胃癌早期無(wú)明顯癥狀，易被患者忽視，就診時(shí)絕大多數(shù)患者病情已進(jìn)展到中晚期，預(yù)后較差，5年生存率僅為10%[2]。既往研究[3]表明，早期診斷胃癌可以使患者的5年生存率達(dá)到80%～90%。因此，掌握胃癌病變的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行早期診斷和靶點(diǎn)治療對(duì)延長(zhǎng)患者生存時(shí)間意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)盡管不能編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與染色質(zhì)修飾，調(diào)控蛋白質(zhì)活性，且在時(shí)間、空間以及組織上均具有特異性[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-漿細(xì)胞瘤變體易位1(LncRNA PVT1)是LncRNA的一種類型，在正常組織中低度表達(dá)，然而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的表達(dá)明顯提高，在癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移中具有促進(jìn)作用[5～7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，自噬過(guò)程的異常激活會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)提供條件，自噬相關(guān)基因5(Atg5)的異常表達(dá)是自噬過(guò)程異常激活的關(guān)鍵因素。此外，異常表達(dá)的Atg5能夠影響細(xì)胞內(nèi)新陳代謝及凋亡速率，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，是惡性腫瘤形成和發(fā)展的關(guān)鍵步驟。LncRNA PVT1和Atg5是否共同參與癌變進(jìn)展需臨床進(jìn)一步研究[6]。本研究將探討LncRNA PVT1和Atg5在胃癌組織及其癌旁正常組織的表達(dá)差異，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院于2016年1月～2019年2月收治的103例胃癌患者的臨床及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者符合《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》[9]且經(jīng)術(shù)后病理確診為胃腺癌；既往無(wú)胃部手術(shù)史或放化療史；基本資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；合并胃部其他嚴(yán)重疾病，如胃穿孔、慢性萎縮性胃炎以及胃間質(zhì)瘤等；肝腎功能明顯異常者；存在自身免疫性疾病或免疫系統(tǒng)異常。其中男59例、女44例，年齡≥60歲54例、<60歲49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者79例，低分化者9例、中分化者51例、高分化者43例，TNM分期Ⅰ期42例、Ⅱ期35例、Ⅲ期20例、Ⅳ期6例，腫瘤直徑≤5 cm者61例、>5 cm者42例。所有患者接受胃癌根治術(shù)治療。術(shù)中切取胃癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁5 cm以上正常組織，將其放入液氮中暫時(shí)保存，術(shù)后統(tǒng)一保存于-80 ℃冰箱中。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且參與研究患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 LncRNA PVT1、Atg5檢測(cè)方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。各取胃癌組織及其癌旁正常組織50 mg，均加入1 mL的TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，根據(jù)其操作步驟提取總RNA。用2.0 μg總RNA合成cDNA，通過(guò)PrimeScript 1st strand cDNA合成試劑盒完成操作。LncRNA PVT1和Atg5定量表達(dá)選用凱杰公司SYBR?Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格遵守說(shuō)明書(shū)完成操作。LncRNA PVT1的引物合成條件為42 ℃ 1 h、70 ℃ 5 min，正向引物為5′-CAACCAGGACCGGGTCAAACG-3′，反向引物為5′-GCCTCGGACATGACCTTCCACT-3′，其長(zhǎng)度為92 bp，退火溫度控制在59 ℃。內(nèi)參基因β-actin的正向引物為5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3′，反向引物為5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCG-3′，其長(zhǎng)度為101 bp，退火溫度控制在55 ℃。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性在95 ℃時(shí)維持5 min，變性在95 ℃時(shí)維持10 s，退火及延伸在55 ℃維持30 s。Atg5的引物合成條件為37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min，正向引物為5′-GCCATCAATCGGAAACTCAT-3′，反向引物為5′-CAGCCACAGGACGAAACAG-3′。內(nèi)參基因U6的正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 15 min，變性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s。以上所有引物由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，反應(yīng)均為40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均進(jìn)行3次檢測(cè)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA PVT1、Atg5相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及其癌旁正常組織中LncRNA PVT1和Atg5表達(dá)比較 胃癌組織及其癌旁正常組織中LncRNA PVT1相對(duì)表達(dá)量分別為6.27±1.43、1.34±0.21，Atg5相對(duì)表達(dá)量分別為2.31±0.34、1.05±0.14，胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5相對(duì)表達(dá)量均較癌旁正常組織高(P均<0.01)。

2.2 胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 胃癌組織中LncRNA PVT1與Atg5表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中LncRNA PVT1的表達(dá)和Atg5的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.553，P=0.000)。

3 討論

胃癌的發(fā)生與飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、基因突變及調(diào)控密切相關(guān)[10]，具體機(jī)制極為復(fù)雜，目前仍缺乏便捷有效的早期診斷指標(biāo)，因此多數(shù)患者確診時(shí)胃癌已進(jìn)展到中晚期。隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，近年來(lái)眾多研究[11,12]表明，某些基因失調(diào)能夠增加胃癌易感性，如LncRNA、微小RNA以及c-myc等，這些基因在細(xì)胞分化、增殖以及凋亡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。非編碼RNA含量約占基因組整體的98%，盡管不能編碼蛋白質(zhì)，但能夠調(diào)控mRNA拼接及基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)多種疾病的發(fā)生起重要作用。LncRNA在非編碼RNA中含量最多，具有修飾染色質(zhì)、干擾細(xì)胞質(zhì)中核糖核酸穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)微小RNA活性的作用。LncRNA對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移均具有重要影響，且參與調(diào)控多種腫瘤信號(hào)通路，如mTOR、Wnt、Notch以及NF-κB等[13]。由于LncRNA檢測(cè)具有價(jià)格實(shí)惠、可重復(fù)以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，目前DD3PCA3、MALAT-1以及HOTAIR等多種LncRNA已被作為早期診斷和評(píng)估預(yù)后的標(biāo)志物。LncRNA PVT1位于染色體8q24.21，處于c-myc上游，其內(nèi)包含6種微小RNA。LncRNA PVT1通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)，使原癌基因c-myc表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖[14]。既往研究[7]表明，發(fā)生惡性腫瘤(直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等)時(shí)LncRNA PVT1常出現(xiàn)異常擴(kuò)增及拷貝數(shù)增加。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中的LncRNA LncRNA PVT1相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織提高，與Kong等[15]研究結(jié)果一致。分析原因可能為,胃癌組織中的癌細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子(如IL-6)，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞后使LncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)[16]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中LncRNA PVT1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，表明LncRNA PVT1可以促進(jìn)胃癌發(fā)展，反映胃癌的TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，間接評(píng)估患者病情。其機(jī)制可能為L(zhǎng)ncRNA PVT1能夠激活Zeste同系物2(Ezh2)，而Ezh2已被證實(shí)為癌基因，其表達(dá)上調(diào)可以誘導(dǎo)p15和p16調(diào)控系統(tǒng)活化，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及分化，最終導(dǎo)致癌癥進(jìn)展惡化[17]。此外，LncRNA PVT1能夠抑制PDCD4蛋白轉(zhuǎn)錄，從而阻礙正常細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮生物功能，同時(shí)，PDCD4蛋白表達(dá)降低后會(huì)導(dǎo)致對(duì)金屬蛋白酶9抑制作用減弱，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及侵襲[16]。

自噬是一種通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞器及膜蛋白質(zhì)的細(xì)胞程序性死亡，對(duì)機(jī)體具有一定的保護(hù)作用[18]。然而，異常激活自噬過(guò)程可以破壞機(jī)體內(nèi)正常的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)提供條件。Atg5位于染色體6q21上，通過(guò)共價(jià)結(jié)合Atg12對(duì)自噬過(guò)程的延伸階段具有重要調(diào)控作用。據(jù)相關(guān)研究[19]報(bào)道，Atg5的突變或異常表達(dá)可以損傷DNA并降低基因組的穩(wěn)定性，進(jìn)而增加腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中Atg5相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織高，Atg5的表達(dá)與分化程度和TNM分期有關(guān)。表明Atg5可以評(píng)估胃癌的分化程度及判斷胃癌分期。其原因可能為胃癌組織內(nèi)表達(dá)上調(diào)的泛素特異肽酶22(USP22)通過(guò)使沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirt1)去泛素化，進(jìn)而穩(wěn)定sirt1表達(dá)，而sirt1能夠促進(jìn)Atg5和Atg7去乙?；?，進(jìn)而誘導(dǎo)異常自噬，損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA及蛋白質(zhì)，增強(qiáng)了癌細(xì)胞的侵襲能力[20]。此外，Atg5通過(guò)與泛素化的Atg7和Atg10共價(jià)結(jié)合，從而激活自噬過(guò)程，促進(jìn)癌細(xì)胞內(nèi)大量生成ATP并激活線粒體內(nèi)的β-氧化，使癌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝活躍，加速其分裂及分化，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲及遷移[19]。

本研究表明，胃癌組織中LncRNA PVT1的表達(dá)與Atg5的表達(dá)呈正相關(guān)。表明LncRNA PVT1和Atg5可能具有協(xié)同作用，二者共同誘導(dǎo)胃癌的形成和進(jìn)展。其機(jī)制可能是胃癌組中的LncRNA PVT1能夠直接結(jié)合Atg5，誘導(dǎo)Atg5表達(dá)。既往研究[21]報(bào)道，LncRNA PVT1過(guò)表達(dá)時(shí)能夠使Atg5上調(diào)，而抑制LncRNA PVT1時(shí)則Atg5下調(diào)。然而由于本研究樣本數(shù)量及實(shí)驗(yàn)設(shè)施的限制，LncRNA PVT1和Atg5互相調(diào)控的具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，LncRNA PVT1和Atg5在胃癌組織中均高表達(dá)，二者相互作用共同影響胃癌的發(fā)生和進(jìn)展，可能成為胃癌早期診斷和藥物靶點(diǎn)治療的標(biāo)志物。