負(fù)載胰島素PLGA微球?qū)ΨN植體周圍成骨影響的動物研究*

魏雪竺 劉長營 李貝貝 李 鈞 馬 攀

口腔種植技術(shù)作為一種新興的技術(shù)發(fā)展迅速，種植適應(yīng)癥范圍也在不斷擴(kuò)大，包括糖尿病在內(nèi)的許多全身疾病在控制穩(wěn)定的前提下都可以作為種植的適應(yīng)癥[1]。而高血糖患者的種植仍然是相對高風(fēng)險的，我國作為2型糖尿病患者的患病大國，血糖控制目前不容樂觀[2]，仍有許多患者因?yàn)檠菬o法控制到理想范圍無法進(jìn)行口腔種植[3]。因此需要進(jìn)一步研究適合高血糖的2型糖尿病患者的種植技術(shù)方法，相關(guān)研究主要仍在動物研究的階段[4]。種植體相關(guān)的動物研究主要采用的成品種植體直徑較大，不適用于大鼠等小型實(shí)驗(yàn)動物。且成品種植體表面大多采用涂層處理，表面不利于加載藥物，往往需要更多的動物樣本[5]。本研究擬設(shè)計(jì)并制作一種新型的應(yīng)用于大鼠等小型動物的種植體，應(yīng)用該種植體并負(fù)載甘精胰島素PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)微球，觀察對GK大鼠(2型糖尿病大鼠)種植體周圍成骨的影響。

圖1 種植體設(shè)計(jì)圖及封閉螺絲示意圖

1.材料與方法

1.1 材料 動物用種植體10枚；雄性GK大鼠10只；甘精胰島素PLGA微球，空白微球；矯正共振頻率分析測量儀(Osstell ISQ，瑞典)等。

PLGA微球制作：采用W/O/W法制作甘精胰島素及空白PLGA微球。

1.2 自主設(shè)計(jì)的新型種植體模型 本實(shí)驗(yàn)所采用的種植體材質(zhì)為純鈦種植體，種植體外形圖如圖1所示。種植體長度6mm，直徑2.8mm，表面為無螺紋的光滑表面。種植體內(nèi)徑為1.8mm，內(nèi)部有螺紋，種植體內(nèi)部螺紋與Bego種植體內(nèi)部螺紋一致。種植體與封閉螺絲接口處內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)為45°的斜面，以便于種植體和封閉螺絲更好的吻合。種植體內(nèi)徑與Osstell ISQ測量儀套裝中Bego種植體的SmartPeg感應(yīng)器(共振頻率測量桿)吻合，以便實(shí)驗(yàn)過程中測ISQ值。種植體表面采用微弧氧化處理。種植體由北京萊頓生物有限公司制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組 將10只12周齡的GK大鼠飼養(yǎng)一周。測定血糖值，血糖＞16.7mmol/L表示建模成功，10只大鼠均符合建模要求，將大鼠采用抽簽法隨機(jī)分成2組，每組5只。2組分別為甘精胰島素組和空白對照組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)組及對照組術(shù)前半小時腹腔注射30mg/kg青霉素預(yù)防感染。水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，StraumannR○手術(shù)工具盒中先鋒鉆、直徑2.2mm、2.8mm環(huán)形齒科鉆預(yù)備種植體窩，并于右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)植入種植體。甘精胰島素組大鼠在種植體植入前，給予局部200μg PLGA微球負(fù)載與種植體表面。使用精確度為0.0001g的天平，稱取2mg PLGA微球，在96孔板內(nèi)溶于0.2ml生理鹽水中，用加樣槍輕輕吹勻后吸取20μl，在種植體植入前放于種植窩內(nèi)，之后植入種植體。對照組則將0.02%三羥甲基氨基甲烷的空白PLGA微球加入制備好的種植窩內(nèi)。測定初始ISQ值后分層縫合。并在種植手術(shù)植入后第3、4、5、6周，局麻下測量ISQ值，測量3次取平均值。在第6周測量完成大鼠ISQ值后，處死大鼠，拍攝CT(結(jié)果如圖3所示)。截取右側(cè)脛骨，用于種植體骨磨片。種植體骨磨片采用亞甲基藍(lán)-品紅染色，使用Image Pro Plus軟件分析測量種植體-骨界面長度及種植體-骨整合長度，并計(jì)算種植體-骨整合率。對兩組GK大鼠每周進(jìn)行血糖測量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。對同一周甘精胰島素組和空白對照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

甘精胰島素標(biāo)準(zhǔn)品制得的PLGA微球載藥量為24.87%±0.57%，包封率為62.19±1.41%。掃描電子顯微鏡下可見微球形態(tài)如圖2所示基本為球型，甘精胰島素組PLGA微球平均直徑4.34±1.65μm，對照組PLGA微球平均直徑4.18±1.29μm。使用吸光度法測得甘精胰島素PLGA微球12h釋放率35.36%，2d釋放率67.25%，8d釋放率88.55%，14d釋放率94.49%。

圖2 甘精胰島素(左圖)及對照組(右圖)PLGA微球

甘精胰島素組及對照組大鼠實(shí)驗(yàn)前后的血糖值如圖3所示。甘精胰島素組和對照組每周測量血糖值均大于18mmol/L，且每周兩組間血糖值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞2.61)。

圖3 大鼠血糖值

甘精胰島素和對照組ISQ值如表1所示。甘精胰島素組第4、5、6周ISQ值及第6周種植體骨結(jié)合率顯著高于對照組。兩組ISQ值從第3周起呈現(xiàn)明顯的增長趨勢，且甘精胰島素組ISQ值高于對照組。在第1、3周兩組間ISQ值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在第4、5、6周甘精胰島素組ISQ值顯著高于對照組。第6周時CT如圖4所示可見2組種植體周圍可見骨結(jié)合，磨片染色如圖5所示，可見新生成的骨小梁，計(jì)算甘精胰島素組種植體骨結(jié)合率(種植體骨結(jié)合率為59.73±0.92%，對照組種植體骨結(jié)合率為44.6±0.97%，甘精胰島素組種植體骨結(jié)合率顯著高于對照組(如圖6所示)。

表1 甘精胰島素和對照組ISQ值(無單位)

圖4 第6周GK大鼠種植體CT圖像(左圖為甘精胰島素組，右圖為對照組)

圖5 種植體磨片(左圖為甘精胰島素組，右圖為對照組，下圖為完整視野下種植體磨片)

圖6 第6周種植體骨結(jié)合率

3.討論

設(shè)計(jì)的種植體形態(tài)能夠滿足12周齡GK大鼠脛骨植入時的需要，種植體內(nèi)徑的設(shè)計(jì)也能夠滿足實(shí)驗(yàn)中測定ISQ值的需要，對純鈦種植體表面進(jìn)行微弧氧化能夠使種植體獲得良好的生物相容性。通過測定實(shí)驗(yàn)動物的種植體穩(wěn)定性增長水平，避免過多的實(shí)驗(yàn)動物分組，減少實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量。微弧氧化處理的種植體表面負(fù)載微球，氧化層表面為加載藥物提供了空隙，增加了種植體的表面積，有利于成骨[6]。光滑表面的種植體較螺紋表面的種植體更有利于觀察和計(jì)算種植體骨結(jié)合率，并且有利于種植體表面進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究時負(fù)載藥物的均勻分布。甘精胰島素PLGA微球通過類胰島素樣作用，促進(jìn)大鼠高糖環(huán)境下種植體周圍的骨結(jié)合[7]。與傳統(tǒng)加藥方式相比，甘精胰島素PLGA微球能夠在種植體表面緩慢、持續(xù)的釋放，藥物的作用時間相對較長，不需要多次給藥[8]。且局部的精準(zhǔn)給藥排除了甘精胰島素降糖作用導(dǎo)致的骨結(jié)合率增高[9]。另一方面甘精胰島素PLGA微球制作成本較高，且并不能長時間存放，在體外的儲存環(huán)境下其微球依然會緩慢破裂[10]。

種植體植入后ISQ值的測量數(shù)據(jù)為第1、3、4、5、6周，并沒有測量第2周的ISQ值。因?yàn)樵谥斑M(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，在第2周旋出封閉螺絲時種植體也隨封閉螺絲一同旋出。這可能是因?yàn)榉N植體植入初期破骨細(xì)胞相對活躍[11]，并沒有形成相對良好的骨結(jié)合，且本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的光滑表面并沒有機(jī)械固位力。從第1周到第3周，種植體ISQ值增長相對緩慢，且甘精胰島素組與對照組間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是因?yàn)楦示葝u素的類胰島素樣作用對種植體在植入初期種植體-骨界面破骨細(xì)胞主導(dǎo)的破骨活動并不顯著[12]。甘精胰島素組PLGA微球釋放的甘精胰島素產(chǎn)生的類胰島素樣作用主要促進(jìn)成骨細(xì)胞改建[13]。從第3周起種植體表面成骨活動活躍，ISQ值穩(wěn)步增加。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的光滑表面短種植體能夠成功應(yīng)用于GK大鼠，獲得良好的生物相容性，在高血糖環(huán)境下獲得一定的骨結(jié)合。甘精胰島素組GK大鼠種植體穩(wěn)定性增長水平和種植體骨結(jié)合率明顯高于對照組，進(jìn)一步證實(shí)了PLGA微球負(fù)載的甘精胰島素對2型糖尿病大鼠種植體周圍成骨具有促進(jìn)作用[14]。