黔產(chǎn)忍冬葉中木犀草苷含量測(cè)定*

馬子力，黃興龍，馮劍英，姚元貴，劉春艷，馬四補(bǔ)，張 衛(wèi)，胡欣悅，張麗艷▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2貴州省赤水市人民醫(yī)院，貴州 赤水 564700)

忍冬為忍冬科忍冬屬半常綠纏繞灌木，忍冬藥用歷史悠久，早在漢末《名醫(yī)別錄》中就有關(guān)于忍冬為“上品”的記載[1]。2015版《中國(guó)藥典》已將“金銀花”“忍冬藤”列為藥用植物[2]，同時(shí)藥典中將金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量作為其主要質(zhì)控指標(biāo)[3]。其花及花蕾有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效[4]。忍冬花又稱(chēng)金銀花，目前金銀花作為抗病毒常用藥材[5]，已廣泛投入臨床應(yīng)用。金銀花市場(chǎng)需求量大，導(dǎo)致藥材價(jià)格居高不下，亟需新的藥材替代品。筆者通過(guò)查閱典籍發(fā)現(xiàn)，晉代《肘后備急方》便有“忍冬莖葉挫數(shù)壺煮”的記載[6]，表明“葉”同樣為該藥材的藥用部位。臨床研究表明，使用鮮忍冬葉泡茶，急性腸炎患者可以在三天內(nèi)被治愈[7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，忍冬葉中同樣含有綠原酸及木犀草苷[8]，木犀草苷除具有抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用之外，對(duì)人體的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)還具有一定程度的保護(hù)作用[9]。本研究旨在通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)黔產(chǎn)忍冬葉中木犀草苷含量，為黔產(chǎn)忍冬葉載入地方標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；METTLER TOLEDO XSE105DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒公司)；LE204E型電子分析天平(METTOER TOLEDO公司)；KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇(色譜純，TEDIA High Purity Solvents)；乙腈(色譜純，TEDIA High Purity Solvents)；甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；木犀草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，11720-201609，純度≥98%)，純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)；磷酸(分析純，成都金山化學(xué)有限公司)。

樣品于2017年采自貴州省各區(qū)縣，陰干。藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙睛：0.5%甲酸梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取木犀草苷對(duì)照品1.68 mg置于10 mL量瓶，用80%甲醇溶解并定容、搖勻，即得0.1646 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取藥材粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲60 min稱(chēng)定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，精密量取20 mL樣品溶液，置蒸發(fā)皿中揮干，再用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，并經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

將上述對(duì)照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，吸取對(duì)照品溶液各1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程y=2023.8x- 39.58，R2=0.9997。表明在進(jìn)樣量0.1646～1.6460 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of the linear relationship (n=6)

圖1 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.1 Standard curve of luteoloside

2.5 精密度考察

按上述色譜條件將對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積為3308.4、3328.1、3366.8、3206.6、3131.1、3232.7，計(jì)算其RSD為2.69%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取樣品1份(產(chǎn)地：貴州 龍里)供試品溶液，按上述色譜條件每隔5 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)6次，測(cè)定峰面積為591.0、604.4、602.8、567.2、572.3、571.3，計(jì)算其RSD為2.86%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份(產(chǎn)地：貴州 龍里)供試品溶液，各約1 g，按上述供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算其百分含量的RSD結(jié)果為1.52%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取6份已知含量的藥材粉末(產(chǎn)地：貴州 龍里)約0.5 g，精密稱(chēng)定后，分別加入3.8612 μg/mL濃度的對(duì)照品溶液各50 mL，按上述條件進(jìn)行供試品溶液的制備；按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，按公式回收率=(測(cè)得量-樣品中的含量)/(加入對(duì)照品的量)×100%計(jì)算，結(jié)果表明平均回收率為98.36%，RSD=1.39%，見(jiàn)表2所示。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Spiked recovery rate results(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

各樣品粉末按“2.3供試品溶液制備”項(xiàng)下制備得到供試品溶液，精密吸取各供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，平行測(cè)定2次，計(jì)算木犀草苷含量，得到14批樣品中木犀草苷含量為0.0261%～0.050%，平均含量為0.035%。其中2號(hào)樣品含量最低，為0.0261%；10號(hào)樣品木犀草苷含量最高，為0.050%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab.3 Results of the content determination (n=2)

3 討論

本研究采用DAD檢測(cè)器在紫外區(qū)190～400 nm對(duì)木犀草苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到木犀草苷在350 nm處有最大吸收，因此選取350 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)主要考察了乙腈-0.5%磷酸(A)、乙腈-0.5%醋酸(B)、乙腈-0.5%甲酸(C)3種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.5%甲酸為流動(dòng)相時(shí)，木犀草苷分離效果佳且峰形好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相，同時(shí)對(duì)3個(gè)不同廠家的色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×250 mm，5 μm)、inerTsustain AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)行考察，結(jié)果以Agilent ZORBAX SB-Phenyl色譜柱分離度高，峰形較其他色譜柱好，故選用該色譜柱。此外本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度甲醇、不同提取時(shí)間對(duì)忍冬葉中木犀草苷含量的影響，結(jié)果在甲醇濃度為80%、超聲提取為60 min時(shí)木犀草苷含量最高。在上述條件下，本研究對(duì)該方法流速、柱溫、甲酸濃度進(jìn)行了一系列的耐用性考察，最終確定木犀草苷在1.0 mL/min、35 ℃、0.5%甲酸條件下色譜圖基線(xiàn)平穩(wěn)、木犀草苷分離度較好、峰形較好、理論塔板數(shù)高。

該研究采用HPLC-DAD法對(duì)忍冬葉中木犀草苷含量進(jìn)行測(cè)定，并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果該方法精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，表明該方法穩(wěn)定可靠。通過(guò)對(duì)黔產(chǎn)14批忍冬葉樣品中木犀草苷含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果均值為0.035%，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及藥典相關(guān)規(guī)定按照平均值下浮20%，初步確定忍冬葉藥材干燥品含木犀草苷不得少于0.028%。該方法將為黔產(chǎn)忍冬葉載入地方標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。