魚木高效可持續(xù)離體快速繁殖研究*

湯 聰 梁韓枝 黃嘉琦 譚嘉川 胡 秀

(1.廣州建筑園林股份有限公司，廣東 廣州 510030；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225）

魚木（Crateva formosensis）是山柑科（Capparaceae）魚木屬（Crateva）多年生落葉喬木。該屬在全世界有8 個種、4 個變種，其中有5 種分布于中國[1]。魚木的花序大、花絲長而纖細、開花繁茂，是優(yōu)良的木本觀花植物。魚木還是一種藥用植物。從魚木樹皮提取的羽杉醇具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、利尿、降血壓以及降低膽固醇含量的作用，果皮具有抗真菌作用[2-3]。魚木的座果率和種子萌發(fā)率都很低，自然更新較為困難[4-6]，人工繁殖的效率也很低，加上由于藥用開發(fā)而進行的過度采伐，目前已經(jīng)被列為“稀少植物”。離體培養(yǎng)快速繁殖對于自然繁殖周期超過一年的植物種類，具有明顯優(yōu)勢。目前，在同屬植物中沙梨木（Crateva nurvala）、樹頭菜(Crateva unilocularis)等，以枝條、插穗為外植體，建立了無菌繁殖體系[7-8]。在同屬植物中，現(xiàn)有外植體的取材受季節(jié)性限制很大，無菌處理繁復(fù)且困難，離體培養(yǎng)時增殖率偏低，無菌苗生根質(zhì)量不理想，使得魚木屬植物商業(yè)化栽培仍然無法實現(xiàn)。就魚木而言，國內(nèi)外均未見有關(guān)離體培養(yǎng)的報道。本研究擬從外植體選擇、誘導(dǎo)增殖、生根這幾個方面入手，建立高效的魚木離體快繁體系。在外植體選擇方面，嘗試選擇來源豐富的側(cè)根，在控制條件下誘導(dǎo)半木質(zhì)化莖段，再取新枝的莖段為外植體，以此提高無菌處理效率[9]；在誘導(dǎo)階段，由于側(cè)根扦插誘發(fā)的萌枝內(nèi)源激素含量不及截干后的萌枝，在外源激素的選擇上，除了使用同屬植物離體誘導(dǎo)中常用的BA 和NAA 之外,擬添加對外源激素具有促進作用的TDZ 進行輔助；在增殖和生根階段，擬采用適當(dāng)提高外源激素濃度促進增殖，在生根前再進行壯苗獲取適宜生根的半木質(zhì)化無菌苗的策略。以下是詳細報道。

1 材料與方法

1.1 材料

魚木（Crateva formosensis），來源于廣東省臺山市，為根插繁殖獲得的萌枝，高30～40 cm，枝條半木質(zhì)化。根段的扦插選用來源豐富、對樹體損傷較小的側(cè)根進行；扦插時在溫室進行，避免受到雨水污染；灌溉時采用無菌水，且僅濕潤基質(zhì)，避免噴灑萌發(fā)出的新枝；保持溫室相對濕度為60%以下，避免滋生霉菌。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 取根段萌發(fā)的半木質(zhì)化莖段為外植體，75%（v/v）酒精消毒10-15 s，無菌水漂洗1 次，無菌濾紙吸干，0.1%（w/v）升汞浸泡8 min，無菌水漂洗7 次，無菌濾紙吸干，切成1.5 cm 左右并帶一個節(jié)的莖段，接種于添加不同質(zhì)量濃度的BA、NAA、TDZ 及其組合的培養(yǎng)基中（表1）?；九囵B(yǎng)基為MS，添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 調(diào)整為5.6-5.8。每瓶接種1 個，每個處理接種30 瓶。在溫度為23-25 ℃、光照12 h/d、光照強度1 500～2 000 lx 條件下培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率、增殖系數(shù)并觀察生長情況。

1.2.2 繼代增殖 取上述最優(yōu)培養(yǎng)基上形成的長勢良好的植株，切取大小相近的側(cè)芽，接種于含不同質(zhì)量濃度BA、NAA 與GA3及其組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)（表2）。每瓶接種3 個，每個處理10 瓶。繼代間隔為30 d，繼代3 次。分別在每次繼代結(jié)束后觀察記錄其長勢并統(tǒng)計其叢生芽增殖系數(shù)與玻璃化率。將長勢一致的玻璃化苗移植于不含任何激素的MS 固體培養(yǎng)基中，每瓶接種3 個，共40 瓶。30 d 后觀察記錄其生長情況并統(tǒng)計其玻璃化率。

1.2.3 壯苗及循環(huán)繼代 將玻璃化苗轉(zhuǎn)接于不含任何激素的MS 空白培養(yǎng)基中進行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為40 d，每瓶接種3 個，共40 瓶。30 d 后觀察記錄其生長情況并統(tǒng)計其玻璃化率。

1.2.4 壯苗及生根 將帶2-3 個節(jié)的健壯苗轉(zhuǎn)接于空白培養(yǎng)基上進行壯苗，誘導(dǎo)半木質(zhì)化苗，培養(yǎng)時間為30 d。將非木質(zhì)化和半木質(zhì)化的無菌苗，分別接種于添加不同質(zhì)量濃度的IBA (0.5、1.0、1.5 mg·L-1)的1/2MS 與MS 培養(yǎng)上（表3）進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，研究不同木質(zhì)化程度和外源激素對生根率和生根系數(shù)的影響，培養(yǎng)時間為40 d。

1.2.5 煉苗和移栽 待幼苗4-5 cm 高時，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，在室內(nèi)放置3 d，使幼苗初步適應(yīng)外界環(huán)境。再從培養(yǎng)基中取出幼苗，用無菌水洗去附著的培養(yǎng)基，移栽到泥炭土∶細沙（v : v =2 : 1）的土壤中。初次移栽時澆透水，以后每天采用噴霧的方法保持土壤濕潤。30 d 后統(tǒng)計幼苗的成活率并記錄其長勢。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析方法 用DPS（version 7.05）軟件，采用Duncan 新復(fù)極差法進行方差分析，顯著性水平為0.05，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

腋芽誘導(dǎo)率/%=（萌芽數(shù)/接種數(shù)）×100；

芽增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種數(shù)；

玻璃化率/%=（30 d 后的玻璃化幼苗數(shù)/30 d 后的總幼苗數(shù)）×100；

生根率/%=（生根的個體數(shù)/接種數(shù)）×100；

生根系數(shù)=側(cè)根總數(shù)/接種數(shù)；

移栽成活率/%=（成活植株數(shù)/移栽數(shù)）×100；

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

通過避免扦插時接受雨水污染，控制澆水用水的來源及環(huán)境濕度，根段扦插后的半木質(zhì)化階段無菌處理污染率小于5%。莖段培養(yǎng)5 d 后，各處理側(cè)芽均開始萌動，培養(yǎng)30 d 后側(cè)芽均可萌發(fā)，萌發(fā)率均為100%，但增殖系數(shù)有顯著差異。未添加任何激素處理組，外植體及其萌發(fā)的側(cè)芽逐漸黃化死亡，增殖率為0（表1）。各處理腋芽萌發(fā)為枝條（圖1，A,B），部分處理新枝的腋芽也能萌發(fā)。剪切外植體萌發(fā)的枝條為節(jié)及剝?nèi)《伟l(fā)生的腋芽（圖1，B）可用于進一步繼代。從增值系數(shù)上看，BA 質(zhì)量濃度一定時，添加NAA 或TDZ 對芽的增殖系數(shù)無顯著影響，但添加TDZ 誘導(dǎo)出的芽體粗壯，新枝的腋芽能二次萌發(fā)（圖1，B），增殖芽質(zhì)量好。當(dāng)BA 質(zhì)量濃度為0-2.0 mg·L-1時，芽增殖系數(shù)隨著BA 質(zhì)量濃度的升高而增加，但隨BA 質(zhì)量濃度的升高，植株葉片開始黃化，脫落。最高的芽增殖系數(shù)配方為：MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 0.1 mg·L-1，可達6.35，但葉片皺縮不舒展，部分出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象，雖然在MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 0.1 mg·L-1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體其芽增殖系數(shù)僅為4.11，但葉片翠綠舒展，長勢良好，可以用于進一步的繼代增殖。

表1 激素配比對魚木初代誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different phytohormone and their combination on shoots induction in primary culture

2.2 繼代增殖

繼代培養(yǎng)時，添加BA 與NAA 的處理組其芽增殖系數(shù)顯著高于單獨添加BA 的處理組（表2）。在MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的芽增殖系數(shù)最高，可達12.09，但玻璃化程度也較高。同時添加BA 和NAA 時，隨著BA 與NAA 的比例增大，芽增殖系數(shù)與玻璃化程度呈增長趨勢。添加GA3對芽增殖系數(shù)無顯著效應(yīng)，但可以促進節(jié)間伸長。綜合增殖系數(shù)、芽體生長狀態(tài)以及后續(xù)培養(yǎng)目標(biāo)，適宜后續(xù)持續(xù)增殖的培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，適于后續(xù)壯苗生根的培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1。

表2 激素配比對魚木繼代增殖的影響Table 2 Effect of different phytohormone and their conbination on multiple shoots

2.3 壯苗及循環(huán)繼代

選取完全玻璃化的植株（圖2，C1）于MS 不含任何植物激素的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，在培養(yǎng)5-10 d 的時候，植株的葉片出現(xiàn)脫落的情況，但新長出的芽點為綠色（圖2，C2）。在培養(yǎng)12-20 d 的時候，新芽的葉片舒展，植株的莖桿開始由原來的黃色變?yōu)辄S綠色。培養(yǎng)40 d 后植株長勢良好，葉片翠綠舒展，增殖系數(shù)為2.8（圖2，C3）。將復(fù)壯后的無菌苗切為帶一個芽的莖節(jié)，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進行循環(huán)繼代。

2.4 壯苗及生根培養(yǎng)

非木質(zhì)化的無菌苗在生根培養(yǎng)基中逐漸黃化死亡（圖1，F(xiàn)-b）。以半木質(zhì)化的無菌苗為材料的各處理在培養(yǎng)7-12 d 開始生根，生根均十分迅速。在培養(yǎng)40 d 后觀察可知，當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度在0.5-1.5 mg·L-1的范圍時，生根率和生根系數(shù)與IBA 質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，IBA 質(zhì)量濃度越高則生根率與生根系數(shù)越高。在1/2 MS+ IBA1.5 mg·L-1的處理中，生根率與生根系數(shù)最高，分別可達92%與6.33（表3）。當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度相同時，在1/2MS 培養(yǎng)基上形成的根短小而密集（圖1，G），而在MS 培養(yǎng)基上形成的根相對粗長，但生根系數(shù)較低（圖1，F(xiàn)-a, b），表明魚木的生根率和生根系數(shù)受IBA 質(zhì)量濃度和培養(yǎng)基中大量元素的雙重影響，綜合生根系數(shù)及根生長狀況，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ IBA1.5 mg·L-1。

表3 IBA 濃度及基本培養(yǎng)基對魚木無菌苗生根的影響Table 3 The effect of different medium supplementing with different concentration of IBA on rooting of C. formosensis excised stems

2.5 煉苗和移栽

打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋，放置于溫室進行煉苗。3 d 后，用自來水沖洗根部附著的瓊脂，把小苗移栽于花盆中。盆栽基質(zhì)配比為 : 泥炭土 : 細沙=2 : 1（體積比）。保持土壤濕潤，空氣相對濕度為90%以上。一周后可逐漸降低空氣相對濕度。30 d 后移栽成活率為100%，小苗長勢良好（圖1，G）。

圖1. 魚木無性系組培育苗過程Fig.1 Tissue culture and seeding raising of Crateva formosensis

圖2 魚木植株壯苗及循環(huán)繼代過程Fig.2 The process of plant growing and recycling

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的無菌處理是建立離體培養(yǎng)體系的第一步，也是非常關(guān)鍵的一步。對選用莖段為外植體的木本植物而言，無菌體系的建立尤其困難。幼嫩的莖段帶菌少、無菌處理容易，但是該類莖段內(nèi)源激素和營養(yǎng)貯備都明顯不足，側(cè)芽難以萌發(fā)；木質(zhì)化的莖段萌發(fā)正常但帶菌多且難以去除。因而，大多數(shù)研究都采用半木質(zhì)化的莖段為外植體，既能確保側(cè)芽萌發(fā)、又能獲得一些無菌苗。盡管如此，在無菌處理時半木質(zhì)化外植體污染的比例仍然很高。對魚木屬的植物而言，在自然條件下以枝條的莖段為外植體時，10—11 月取材污染最小，但在培養(yǎng)過程會有較多的滲出物和褐化現(xiàn)象；1—8 月取材不會有滲出物和褐化現(xiàn)象，但5—8 月的污染率很高，8 月取材污染率為100%，1—3 月為休眠期，因而較為理想的取材時間是3—5 月新枝初展的季節(jié)。Neetika[10]選取30 年生的成年大樹，于5—7 月取材，以枝條頂端以下第6-9節(jié)為外植體。印度的Sharma[11]為了獲得較好的無菌處理效果和誘導(dǎo)率，不得不將外植體的取樣時間限制在特定的季節(jié)（10—11 月），取材部位限定在萌枝上的第6-10 節(jié)，并且對萌枝的成熟度也進行了限定，僅萌枝的生長時間只能為40-50 d。此外，很多研究著力于去篩選合適的無菌處理劑及處理濃度、處理時間，或采用盡可能多的無菌處理劑和處理方法進行組合處理，但這不是無菌處理的關(guān)鍵。無菌體系建立的關(guān)鍵是獲取帶菌少的外植體。本研究采用人工方法促發(fā)帶菌少的新枝，待半木質(zhì)化后取材接種，無需繁復(fù)的無菌處理步驟，即可獲得100%的無菌率，且外植體腋芽均可順利萌發(fā)。采用側(cè)根扦插人工促發(fā)的條件包括：避免接受雨水污染、采用無菌水灌溉、灌溉時避免噴灑新枝、保持空氣相對濕度低于70%?？刂菩轮Ρ晃廴镜姆椒ㄊ潜M可能的降低新枝的濕度，避免環(huán)境中的微生物在枝條上過度繁殖和附著。

3.2 TDZ 最初作為除草劑使用，后來被發(fā)現(xiàn)具有促進細胞增殖的作用。在木本植物的離體誘導(dǎo)上具有很好的效果。但TDZ 本身并不是一種細胞分裂素，TDZ 是通過加強占主導(dǎo)作用的激素而起作用的，效用決定于細胞分類素和生長素的比例關(guān)系。與BA 相比較，TDZ 的用量比較低，通常在0.01-0.1 mg/L。在已有的魚木屬植物的離體繁殖中，TDZ 曾單獨用于葉柄不定芽的誘導(dǎo)，本研究結(jié)果將TDZ 配合BA 和NAA 使用，誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)為枝條，與之類似。與未使用TDZ 的研究相比， 本研究使用了較低的BA 濃度（0.5 vs 2.0-4.0），在增殖階段也使用了較低的BA 濃度（0.5 vs 2.0）。這一差異顯示在BA 占主導(dǎo)地位的情況下，TDZ 具有很強的促進細胞分裂的作用。對比增殖階段的BA 用量發(fā)現(xiàn)，本研究使用了較低的濃度獲得了較高的增殖率，顯示TDZ 的效用在繼代過程中有傳遞現(xiàn)象。

3.3 空白培養(yǎng)基的作用主要是釋放前一階段無菌苗體內(nèi)累積的外源激素，在本研究中主要用于降低在繼代過程中由于外源BA 累積，以使復(fù)壯后的無菌苗可進一步繼代或用生根。在繼代培養(yǎng)中隨著次數(shù)的增加，外源激素在無菌苗中不斷累積，其作用效果趨向于占主導(dǎo)作用的激素的效果。本研究中隨著BA 在植物體內(nèi)的累積，隨著繼代次數(shù)增加無菌苗出現(xiàn)了不同程度的玻璃化。玻璃化現(xiàn)象在Panwar 等在同屬的沙梨木的離體培養(yǎng)中也被觀察到，表明魚木屬植物在離體培養(yǎng)時較容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象[12-13]。但玻璃化并不影響增殖，也比較容易恢復(fù)正常。將玻璃化苗轉(zhuǎn)接于不含激素的空白培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d 左右可恢復(fù)為正常苗，從而可繼續(xù)繼代或進入生根階段。

3.4 Neetika[10]與Sharma[5]相似，認(rèn)為采用成年大樹新生枝條為外植體，通過降低增殖階段的外源激素，并在此培養(yǎng)基上進行循環(huán)繼代即可一步成苗，并認(rèn)為以此可以縮短增殖的時間，提高增殖率。然而從Neetika 研究中可以看到，由于在增殖階段降低了細胞分裂素的使用，在相同的繼代時間內(nèi)，增殖率較Sharma[11]的有所下降。此外，在采用無菌苗的葉片和節(jié)進一步在相同培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)，芽誘導(dǎo)率從初代誘導(dǎo)的 80%上升至100%，芽的長度則將下降。Neetika 研究顯示在循環(huán)繼代多次以后，必然要增加促進芽伸長的繼代環(huán)節(jié)。因此，從較長時間段來看，Neetika 的增殖率并不比Sharma[5]的高。植物離體快速繁殖，從大的方面可以分為愈傷組織發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑。二者之間除了是否經(jīng)歷脫分化以外，最大的區(qū)別在于，愈傷組織發(fā)生途徑的增殖是通過細胞增殖，器官發(fā)生途徑是通過芽的增殖或無菌苗節(jié)間的伸長來完成。也因此，由于細胞增殖的速度快，愈傷組織發(fā)生途徑的增殖速度要遠高于器官發(fā)生途徑。同理，從較長時間內(nèi)來計算，將作為增殖單位的芽控制在比較小的體積的增殖方案，增殖率較高。本研究也采用了與Neetika 相似的增殖策略，將作為增殖單位的芽控制在比較小的體積，30 d 平均增殖10 倍左右。當(dāng)繼代兩出現(xiàn)玻璃化時，通過在空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)對無菌苗體內(nèi)的累積的外源激素進行釋放，再進行反復(fù)繼代。當(dāng)需要生根移栽時，選擇健壯的無菌苗在MS + BA 0.1 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1的培養(yǎng)基上壯苗為半木質(zhì)化苗再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。

3.5 在大多數(shù)木本植物中，離體培養(yǎng)的無菌苗的生根都很困難。幾乎所有研究都著力在基本培養(yǎng)基的類型、生根激素的種類選擇和濃度配比上進行優(yōu)化。這些優(yōu)化確實能夠提高生根率和生根系數(shù)，然而對一些生根困難的種類仍然無法達到理想效果。在魚木屬中，目前獲得的最高的生根率是Benniamin[14]在Crataeva magna 中，以MS 為基本培養(yǎng)基添加9.84 -2.0 μmol IBA 和 0.54-0.1 umol NAA 獲得了70 % 的生根率，平均每株的生根率為3 條。Sharma[11]，以MS 5.37-1.0 μmol NAA 或不添加 NAA，在添加2.22-4.44 μmol BA 的培養(yǎng)基上獲得的苗生根率只有30% ，但是從添加低濃度的BA 培養(yǎng)基(0.22-0.44 μmol) 上獲得的苗生根率可以達到 70% 。我們在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，生根的植株都是半木質(zhì)化或木質(zhì)化的無菌苗。事實上很多木本植物在扦插繁殖時，對插條的要求必須是半木質(zhì)化的枝條。因此，生根誘導(dǎo)的影響因素除了基本培養(yǎng)基的類型、生根激素的種類選擇和濃度配比以外，準(zhǔn)備生根用的無菌苗本身的狀態(tài)必須是半木質(zhì)化的。本研究獲得了很好的生根率，一方面可能是使用了半木質(zhì)化的無菌苗，另一方面可能是生根前半木質(zhì)化的苗是采用空白培養(yǎng)基繼代壯苗后獲得，細胞分裂素含量較低。本研究的結(jié)果也表明，未木質(zhì)化的無菌苗在所用培養(yǎng)基上逐漸黃化死亡，只有半木質(zhì)化的無菌苗才能生根。本研究通過對生根用苗進行壯苗處理獲得半木質(zhì)化苗，優(yōu)化基本培養(yǎng)基類型和IBA 的使用濃度，獲得了可商業(yè)化應(yīng)用的生根技術(shù)方案，為魚木的離體培養(yǎng)的商業(yè)化栽培成為可能。

3.6 采用魚木根段扦插后萌發(fā)的半木質(zhì)化新枝為外植體，可有效獲得帶菌少的外植體，同時來源豐富、不受季節(jié)限制、無菌處理簡單，增殖率高且可進行持續(xù)增殖，生根率和生根質(zhì)量高，最適的初代培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 0.1 mg·L-1，適宜后續(xù)持續(xù)增殖的培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，適于后續(xù)壯苗生根的培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1。適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ IBA 1.5 mg·L-1。通過上述操作，可有效滿足魚木規(guī)模化生產(chǎn)用苗。