DNMT1、DNMT3a在進(jìn)展期直腸癌新輔助治療中的表達(dá)及臨床意義

高曉斌，武雪亮，趙軼峰，聶雙發(fā)，梁 峰，劉小飛，張迎春

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科，河北 張家口 075000)

有研究表明，2015年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例約為38.80萬例，發(fā)病率位居第3，死亡例約為18.7萬例，死亡率位居第5[1]。目前，手術(shù)治療仍是治療直腸癌的主要方法，然而，單純依靠手術(shù)治療往往面臨術(shù)后高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率的問題。近年來，新輔助治療因其降期、提高R0切除率、延長患者生存期等優(yōu)勢，成為進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式[2]。新輔助治療的評估有內(nèi)鏡評估、影像學(xué)評估、病理學(xué)評估等，但很大程度上依賴于直觀印象和個人主觀性，缺乏特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的生物學(xué)標(biāo)記物支持[3]。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是人類表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA基化結(jié)構(gòu)和功能的重要酶家族，內(nèi)含3個重要成員：DNMT1、DNMT2和DNMT3，其中DNMT1是目前研究最為廣泛也最為深入的酶類，其在DNA修復(fù)和正常甲基化功能過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；DNMT2主要負(fù)責(zé)tDNA的甲基轉(zhuǎn)移；DNMT3內(nèi)含3個亞基，3a、3b和3L，3a、3b與啟動子區(qū)CpG島、DNA的異常甲基化關(guān)系密切，而3L系調(diào)節(jié)蛋白[4]。研究證實，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的活性增強(qiáng)或表達(dá)上調(diào)能介導(dǎo)DNA異常甲基化，與人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。有研究表明DNMT1和DNMT3a的異常表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，二者均可作為結(jié)直腸癌早期診斷的重要潛在生物學(xué)指標(biāo)。我們擬應(yīng)用免疫組化法檢測二者在進(jìn)展期直腸癌新輔助治療前后的表達(dá)，結(jié)合腫瘤消退學(xué)分級分析新輔助治療對進(jìn)展期直腸癌根治手術(shù)的療效及對上述兩種蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科2017-02-2018-02月間行新輔助治療+全直腸系膜切除術(shù)(TME)50例患者的直腸癌組織標(biāo)本和臨床資料，其中男31例，女19例；年齡34～71歲，平均52.5歲；CEA≤5 μg·L-133例，CEA>5 μg·L-117例；低分化9例，中分化26例，高分化15例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)相關(guān)檢查、依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟UICC結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(2018年第八版)[6]確診為進(jìn)展期直腸癌；②均為首次治療；③對新輔助治療有較好的依從性和耐受性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①拒絕行新輔助治療；②伴嚴(yán)重的基礎(chǔ)病，有明顯的手術(shù)禁忌癥；③病例資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 新輔助治療

患者先行盆腔適形調(diào)強(qiáng)技術(shù)的術(shù)前SCRT，總放射劑量25.0 Gy，劑量分割5Gy×5次。之后行化療治療，Xelox方案：奧沙利鉑130 mg/m2，1d；卡培他濱2 000 mg/m2，1～14 d。3周為1周期，共4周期。新輔助治療完成后6～8周，滿足手術(shù)條件后，行遵循TME原則的根治性手術(shù)治療。

1.2.2 免疫組化檢測及結(jié)果判定

癌組織標(biāo)本連續(xù)切片，4 μm，貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中DNMT1、DNMT3a的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5個高倍視野(×400)。DNMT1陽性主要分布于細(xì)胞核中，而DNMT3a陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標(biāo)準(zhǔn)：按染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃為1分，深黃2分，棕褐或棕黃3分；陽性細(xì)胞計數(shù)：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。兩者相加<2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等強(qiáng)度陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。由兩名具備高級職稱的病理醫(yī)師雙盲法獨(dú)立評分。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察新輔助治療前后DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平，新輔助療效評價標(biāo)準(zhǔn)采用2010年AJCC第七版推薦的TRG[7]評估方法：0級：完全退縮；1級：中等退縮；2級：輕微退縮；3級：無退縮。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，DNMT1和DNMT3a的臨床病理特征和免疫組化特征比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson’s等級相關(guān)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1和DNMT3a在進(jìn)展期直腸癌組織中的表達(dá)及與病理特征之間的關(guān)系

DNMT1和DNMT3a在直腸癌組織中的陽性表達(dá)分別為84.00%和78.00%，二者均與病變的分化程度、cT分期、cN分期和cTNM分期關(guān)系密切(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、CEA、CA199無關(guān)(表1，圖1A、圖2A)。

2.2 DNMT1和DNMT3a在進(jìn)展期直腸癌組織中的陽性表達(dá)

DNMT1和DNMT3a在新輔助治療后直腸癌組織中的陽性表達(dá)分別為36.00%和30.00%，與治療前相比，明顯降低，差異顯著(P<0.05)(圖1B、圖2B)。

圖1 新輔助治療前(A)、后(B)DNMT1表達(dá)情況(SP×400)

圖2 新輔助治療前(A)、后(B)DNMT3a表達(dá)情況(SP×400)

表1 新輔助治療前DNMT1和DNMT3a陽性表達(dá)與直腸癌臨床病理特征間的關(guān)系 n(%)

表1：續(xù)

2.3 直腸癌組織中DNMT1和DNMT3a表達(dá)與新輔助療效的關(guān)系

新輔助放化療后50例患者中，TRG分級：0級2例(4.00%)，1級22例(44.00%)，2級19例(38.00%)，3級7例(14.00%)，不同DNMT1和DNMT3a表達(dá)患者新輔助放化療后療效差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.233、2.047，P<0.05)；其中DNMT1和DNMT3a陽性表達(dá)者療效較陰性表達(dá)者差(P<0.05)(表2)。

表2 不同療效患者的DNMT1和DNMT3a的表達(dá)(n)

2.4 DNMT1和DNMT3a表達(dá)在直腸癌組織中的相關(guān)性

DNMT1和DNMT3a蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.455，P=0.000)(圖3)。

圖3 直腸癌組織中DNMT1和DNMT3a表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與諸多因素相關(guān)，其中抑癌基因的失活和原癌基因的激活發(fā)揮關(guān)鍵作用，其病變機(jī)制涉及表觀遺傳學(xué)的改變：DNA甲基化、染色體重塑、組蛋白修飾和lncRNA調(diào)控[8-10]，其中DNA甲基化是目前研究最為深入的機(jī)制之一。

DNMT為DNA修飾酶，具有高度保守性且在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控[11]。在哺乳動物細(xì)胞中鑒定出3種活性的DNMT分別為DNMT1、DNMT3a及DNMT3b，其中DNMT1主要負(fù)責(zé)復(fù)制先前存在的甲基化模式，DNMT3a和DNMT3b主要作為從頭開始的甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)通過在胞嘧啶上添加甲基來建立DNA甲基化模式。SARABI等[12]研究證實大腸癌細(xì)胞DNMT的表達(dá)與總體DNA甲基化水平呈正相關(guān)，其在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)DNMT1不僅與胚胎發(fā)育、細(xì)胞衰老過程相關(guān)，同時在人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DNMT1是DNA甲基化的關(guān)鍵作用酶，DNMT1活性的增加能促進(jìn)DNA異常甲基化。HE等[13]應(yīng)用免疫組化檢測胰腺腫瘤及腫瘤旁正常組織中GLI1和DNMT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中GLI1、DNMT1和DNMT3a的陽性表達(dá)明顯高于正常組織，表明上述3種因子的異常高表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)；引入環(huán)巴胺抑制GLI1 mRNA和蛋白水平表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3a mRNA和蛋白水平亦隨之下降，因而考慮DNMT1和DNMT3a在胰腺腫瘤中受GLI1的調(diào)控，且二者的編碼基因均是其靶基因。YANG等[14]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了54例胃癌患者石蠟切片中DNMT1和DNMT3a的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌組織中DNMT1和DNMT3a表達(dá)分別為35(64.8%)和38(70.4%)明顯高于正常組織，且二者的陽性表達(dá)與TNM分期(P=0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)相關(guān)，因而預(yù)測DNMT在胃癌中存在過表達(dá)狀態(tài)，且與異常啟動甲基化有關(guān)。FENG等[15]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測136例肺癌患者和147名健康對照者中DNMT1和DNMT3a的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3a蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對照組，進(jìn)一步Logistic回歸結(jié)果證實二者蛋白的高表達(dá)能增加肺癌發(fā)病率。

本研究應(yīng)用免疫組化法檢測分析以上兩種蛋白在新輔助治療前后直腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示DNMT1、DNMT3a的陽性表達(dá)均與病變的分化程度、臨床分期有關(guān)，且二者在直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。HUANG等[16]應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western印跡檢測DNMT1，DNMT3a和DNMT3b在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均顯著上調(diào)，支持本研究結(jié)論。本研究顯示二者在新輔助治療前后在直腸癌組織中的表達(dá)水平存在明顯差異，結(jié)合TGR結(jié)果，二者的表達(dá)與新輔助治療后腫瘤消退程度關(guān)系密切，其中，DNMT1和DNMT3a陰性表達(dá)者較其陽性表達(dá)者腫瘤消退更明顯，表明對于二者均為陽性的直腸腫瘤患者預(yù)后較陰性患者差。

綜上，DNMT1和DNMT3a在進(jìn)展期直腸癌組織中的陽性表達(dá)均與腫瘤臨床病理特征相關(guān)，可作為新輔助治療療效和預(yù)后評估的重要分子生物學(xué)監(jiān)測指標(biāo)。本研究納入樣本相對較少，且為單中心研究，二者之間的具體的相互作用機(jī)制仍未闡明，需繼續(xù)研究。