鰱魚頭磷脂的提取工藝優(yōu)化及乳化性能研究

王然然，王 琦,2，王學(xué)東，岳大鵬，陳季旺，張維農(nóng),2，王海濱，賀軍波,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 2.武漢輕工大學(xué) 油脂及植物蛋白工程技術(shù)研發(fā)中心，武漢 430023)

磷脂是細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)中的主要成分之一，具有多種生理功效，如活化細(xì)胞，調(diào)節(jié)身體激素平衡，增強(qiáng)人體免疫力和再生力等[1]。在結(jié)構(gòu)方面，磷脂屬兩親結(jié)構(gòu)，是一種兩性表面活性劑，親油一端將油滴以薄膜狀的形式包裹，親水一端與水分子相吸，大大降低了水油之間的界面張力，從而使水和油形成了均勻穩(wěn)定的乳液。磷脂應(yīng)用在食品工業(yè)中具有乳化和抗氧化等作用[2]。

鰱魚屬大宗淡水魚，是我國著名四大家魚之一，目前已成為很好的水產(chǎn)加工原料，但有關(guān)鰱魚在食品方面的研究主要集中在魚糜、魚皮和魚油等方面[3-4]，有關(guān)魚頭方面的研究較少。魚頭作為鰱魚加工的主要副產(chǎn)物之一，占全魚質(zhì)量的1/4～1/3，主要用于加工動物飼料，原料的利用率不高且附加值較低,對鰱魚頭中磷脂的提取分析研究報(bào)道鮮見[5-6]。目前，磷脂的提取方法主要有溶劑萃取法[7]、柱層析法[8]、超臨界CO2萃取法和膜分離法[9]等。基于成本和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，本文選擇溶劑萃取法提取鰱魚頭磷脂，提高了鰱魚副產(chǎn)物的加工價值，同時檢測鰱魚頭磷脂的乳化特性并與常見的商品大豆卵磷脂作比較，為其在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活鰱魚，武漢華南海鮮批發(fā)市場；大豆卵磷脂，美國Sigma公司；無水乙醇、氯仿、甲醇、氨水、三氧化鉬、鉬粉、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鈣，均為分析純；正己烷，色譜純；長康綠態(tài)原香四級壓榨菜籽油，湖南岳陽；磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰膽堿(PC)、鞘磷脂(SM)，瑞典Larodan公司。

YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；YH-500隔膜真空泵；SHZ-82水浴恒溫振蕩器；FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)；FD5冷凍干燥機(jī)；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；層析硅膠(GF254)薄板-鋁箔片基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鰱魚頭磷脂提取

新鮮鰱魚頭→破壁機(jī)破碎→真空冷凍干燥→加入乙醇溶液→恒溫振蕩器中振蕩提取一定時間→抽濾→濾液于80℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑→磷脂產(chǎn)物。

1.2.2 磷脂純度和磷脂產(chǎn)物提取率的測定

參考SN/T 3851—2014測定磷脂純度。

1.2.3 鰱魚頭磷脂組成分析

薄板在烘箱105℃烘干活化1～2 h，取出在干燥器中冷卻至室溫即可使用。將薄板切割為寬5 cm、長10 cm，按照氯仿、甲醇與水體積比為65∶25∶4配制展開劑，將磷脂樣品配成200 mg/mL的氯仿溶液進(jìn)行點(diǎn)板，在展開劑中展開離薄板頂端2 cm處取出，使用Dittmer-Lester試劑對薄層結(jié)果進(jìn)行顯色和分析，然后掃描薄層結(jié)果，并使用Scion Image軟件處理圖像后分析不同磷脂種類含量。

1.2.4 鰱魚頭磷脂的脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定鰱魚頭磷脂的脂肪酸組成。

氣相色譜條件：HP-FFAP石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序?yàn)?60℃保持2 min，以20℃/min升至300℃，保持6 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；掃描速度3.21次/s；質(zhì)量掃描范圍(m/z)10～460。

用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行全離子掃描分析。用化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫NIST11進(jìn)行解析,確認(rèn)鰱魚頭磷脂中各種脂肪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)化合物色譜峰響應(yīng)，利用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對含量。

1.2.5 乳化性能的測定

1.2.5.1 乳化步驟

樣品乳化劑(一定質(zhì)量濃度鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂)→一定溫度下保溫10 min→加入10 mL菜籽油和10 mL蒸餾水→于8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿2 min→調(diào)整pH→快速轉(zhuǎn)移到相應(yīng)溫度的水浴鍋中靜置4 h→計(jì)算乳液的乳化層比例。

1.2.5.2 乳化層比例的計(jì)算

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)初步整理后，采用SPSS 17.5統(tǒng)計(jì)軟件用于正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)及其方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設(shè)置50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度，在料液比1∶10、提取溫度25℃、提取時間1.5 h條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖1可知，磷脂純度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先增大后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，磷脂純度最高，達(dá)54.85%。乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，水分過多，極性過強(qiáng)，磷脂的溶解度下降，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，極性逐漸減弱，使乙醇的I/O值(無機(jī)性值/有機(jī)性值)接近被提取磷脂的I/O值，磷脂的溶解度逐漸上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，又會因?yàn)闃O性的下降，使磷脂的溶解度降低[10]。陳文娟等[11]發(fā)現(xiàn)大黃魚魚卵乙醇提取物中磷脂含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增大，而用無水乙醇提取時，磷脂含量反而下降。最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，磷脂產(chǎn)物提取率處于3.35%～5.70%之間，波動不大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，磷脂產(chǎn)物提取率為4.39%，因此確定70%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

溯江而下，江面的水產(chǎn)養(yǎng)殖，一度成為生態(tài)公害。珍珠、漁業(yè)這些新興產(chǎn)業(yè)給村民帶來財(cái)富的同時，也付出著昂貴的生態(tài)代價。

2.1.2 料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設(shè)置1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14的料液比梯度，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度25℃、提取時間1.5 h條件下，考察料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖2可知，磷脂純度隨著料液比的增加逐漸升高，但當(dāng)料液比從1∶8增加到1∶12時，磷脂純度的增加幅度不明顯，當(dāng)增加到1∶14時有下降的趨勢。當(dāng)溶劑量增加時，增加了鰱魚頭粉與乙醇溶液的接觸面積，促進(jìn)磷脂的析出，但溶劑量過大，則成本大，經(jīng)濟(jì)性差，在料液比1∶8時，磷脂純度較高，為61.07%。許艷萍等[12]發(fā)現(xiàn)過高的料液比會導(dǎo)致部分非磷脂成分在溶液中的溶解度升高，影響磷脂的純度，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。最佳料液比的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，料液比為1∶6～1∶12時，磷脂產(chǎn)物提取率處于2.78%～3.12%之間，波動不大，當(dāng)料液比為1∶8時，磷脂產(chǎn)物提取率為2.78%，因此確定1∶8為最佳料液比。

2.1.3 提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設(shè)置25、35、45、55、65℃和75℃的提取溫度梯度，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶8、提取時間1.5 h條件下，考察提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖3可知，磷脂純度隨著提取溫度的升高先上升后下降，當(dāng)提取溫度為45℃時，磷脂純度最高，達(dá)63.41%。提取溫度的升高可加快溶質(zhì)的傳質(zhì)速率，利于磷脂的析出，但隨著提取溫度繼續(xù)升高，乙醇揮發(fā)加劇，導(dǎo)致體系內(nèi)乙醇體積分?jǐn)?shù)降低，不利于磷脂的提取。過高的溫度還會使磷脂氧化降解，影響磷脂的純度[13]。最佳提取溫度的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，提取溫度從35℃升高到65℃時，磷脂產(chǎn)物提取率呈明顯降低趨勢，當(dāng)提取溫度為45℃時，磷脂提取率為2.55%，因此確定45℃為最佳提取溫度。

2.1.4 提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設(shè)置1.5、3、4.5、6、7.5 h和9 h的提取時間梯度，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶8、提取溫度45℃條件下，考察提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖4可知，提取時間超過3 h后，磷脂純度無明顯變化。延長時間有利于磷脂在有機(jī)溶劑中的析出，但是乙醇溶液對磷脂的提取能力最終會達(dá)到飽和狀態(tài)，提取時間達(dá)到3 h時，達(dá)到飽和狀態(tài)，純度為66.2%。最佳提取時間的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，提取時間為3 h時，磷脂產(chǎn)物提取率最高，達(dá)3.47%，因此確定3 h為最佳提取時間。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化鰱魚頭磷脂提取工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 方差分析

從表2可知，影響鰱魚頭磷脂純度的主次因素依次為A>D>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時間>提取溫度>料液比。從表3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響非常顯著，而料液比和提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響顯著。綜上所述，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)最佳工藝條件為A3B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶10，提取溫度35℃，提取時間3 h。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件做3組平行試驗(yàn)，3次試驗(yàn)磷脂產(chǎn)物提取率的平均值為3.35%，磷脂純度平均值為74.45%。

2.3 鰱魚頭磷脂薄層分析結(jié)果

最優(yōu)條件下提取的鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂薄層分析結(jié)果見圖5和表4。

圖5 不同磷脂薄層分析結(jié)果

表4 鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂各組分含量 %

注：同行數(shù)值后不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

從圖5和表4可知：鰱魚頭磷脂包含PC、PE和SM 3種組分，含量依次為PC>PE>SM；大豆卵磷脂含有PC、PE、SM、PA和PI 5種組分，含量依次為PC>PE>SM>PA>PI；PC和PE在鰱魚頭磷脂中的含量高于大豆卵磷脂。

PC是生物體生長發(fā)育極為重要的磷脂[14]。PE又稱腦磷脂，是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成部分，可改善大腦功能[15]。SM的兩大代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺和鞘氨醇參與體內(nèi)的細(xì)胞生長、分化和凋亡等生理活動，對于抑制癌癥具有潛在的作用效果[16]。鰱魚頭磷脂中的PC、PE和SM含量都較高，可以推測鰱魚頭磷脂具有較好的生理活性。

2.4 鰱魚頭磷脂脂肪酸組成

最優(yōu)條件下提取的鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂脂肪酸組成見表5。

表5 鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂脂肪酸組成 %

由表5可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂都以多不飽和脂肪酸(PUFA)為主，PUFA的含量在大豆卵磷脂中高于鰱魚頭磷脂。就PUFA而言，鰱魚頭磷脂以C22∶6n-3(DHA)為主，大豆卵磷脂以C18∶2n-6為主。

2.5 乳化性能的測定結(jié)果

2.5.1 磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設(shè)置0.25、0.5、1、3 mg/mL和5 mg/mL磷脂質(zhì)量濃度梯度，在溫度20℃、pH 7條件下考察磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖6可知，在常溫下，無離子環(huán)境中，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化層比例隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加而漸漸增加，鰱魚頭磷脂增加的幅度較大豆卵磷脂緩慢。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，想要獲得良好乳化效果的前提是要加入足夠量的乳化劑，因?yàn)閮上嗨徒缑嫖降姆肿訑?shù)目會因?yàn)槿榛瘎舛容^低而過低，導(dǎo)致界面膜強(qiáng)度差，乳液穩(wěn)定性弱，只有當(dāng)乳化劑濃度達(dá)到相當(dāng)量時，界面膜上膠黏分子較多，界面膜強(qiáng)度較強(qiáng)，乳液中液滴分離性較好而不易發(fā)生聚結(jié)，乳液穩(wěn)定性好。鰱魚頭磷脂在當(dāng)前試驗(yàn)條件下，乳化能力稍低于大豆卵磷脂，結(jié)合對鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂組成分析發(fā)現(xiàn)，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂皆以PC為主，PC能在乳液界面形成有序單分子層和雙層膜的層狀結(jié)構(gòu)，利于乳液的穩(wěn)定；同時發(fā)現(xiàn)PC含量高的混合磷脂較PC含量低的混合磷脂不易形成穩(wěn)定的乳狀液，這可能是因?yàn)榇蠖孤蚜字械腜A和PI帶有電荷，PA和PI在水中溶解性更好，比中性磷脂作乳化劑更易分散，以形成更強(qiáng)的界面膜，提高了乳液的穩(wěn)定性[18-19]。

2.5.2 離子強(qiáng)度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

在乳化前加入NaCl或CaCl2，設(shè)置0.05%、0.1%、0.2%和0.4%的離子添加量梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、溫度20℃、pH 7條件下，考察離子強(qiáng)度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 NaCl添加量對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

圖8 CaCl2添加量對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖7和圖8可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力隨著離子強(qiáng)度的增加都逐漸減小。不含電解質(zhì)或電解質(zhì)濃度較低時，能有效地阻止乳液中質(zhì)點(diǎn)間發(fā)生不可逆絮凝，增加電解質(zhì)或電解質(zhì)濃度時，則降低了雙電層的厚度并降低了顆粒之間的靜電排斥力，乳液中質(zhì)點(diǎn)間將易發(fā)生不可逆絮凝[20]。CaCl2對不同種類磷脂乳化能力的影響大于NaCl。相同質(zhì)量濃度下，CaCl2對乳液的破壞作用大于NaCl，這是因?yàn)楫?dāng)電解質(zhì)離子濃度相同時，電解質(zhì)離子的電荷數(shù)越大，其壓縮雙電層的作用越明顯，電位越低，乳液穩(wěn)定性越差[21]。

2.5.3 pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設(shè)置pH分別為3、4、5、6、7、8、9的乳液pH梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、溫度20℃條件下，考察pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖9可知，在pH處于3～6之間時，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂基本都無乳化能力，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂皆在pH 7時乳化效果最佳，隨著pH的增加，鰱魚頭磷脂乳化效果有所降低，與大豆卵磷脂一致。磷脂類組分屬于離子型表面活性劑，pH對其影響很大，只有在磷脂分子離子化時才表現(xiàn)出表面活性。pH的波動將造成活性表面分子的電離狀態(tài)的變化，升高或降低乳液的穩(wěn)定性，由于磷脂帶有大量的電荷，在pH為中性的環(huán)境中，磷脂具有較強(qiáng)的靜電斥力作用，從而吸附在油滴表面，以保持乳液的穩(wěn)定，但當(dāng)環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝詶l件時，則是不穩(wěn)定的[22]。

2.5.4 溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設(shè)置4、20、30、40、50℃和60℃的溫度梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、pH 7條件下，考察溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結(jié)果見圖10。

圖10 溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖10可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力隨著溫度的升高而有所降低。低溫條件下鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化穩(wěn)定性較好，4℃和20℃下，鰱魚頭磷脂的乳化能力稍低于大豆卵磷脂，溫度升高到30～50℃時，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力都出現(xiàn)下降，前者的乳化能力高于后者，溫度升至60℃時兩者都失去了乳化能力。高溫降低磷脂的乳化能力，乳化劑的溶解度會隨著溫度的升高而增大，油水界面上吸附的磷脂將因?yàn)槠淙芙舛鹊脑龃蠖蠓葴p少，界面膜強(qiáng)度變?nèi)?，同時，乳液自身的黏度會隨著溫度的上升而下降，乳液內(nèi)部的質(zhì)點(diǎn)與質(zhì)點(diǎn)之間的碰撞概率上升，從而影響乳液的穩(wěn)定性[23]。

3 結(jié) 論

采用乙醇溶液提取鰱魚頭磷脂，以期得到高純度磷脂。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響非常顯著，而料液比和提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響顯著。最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶10、提取溫度35℃、提取時間3 h，在此條件下磷脂產(chǎn)物提取率為3.35%，磷脂純度高達(dá)74.45%。利用此方法提取鰱魚頭磷脂，可一次性提取較高純度的磷脂，簡便快捷，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

對鰱魚頭磷脂的乳化特性進(jìn)行研究，并與商品大豆卵磷脂作比較，結(jié)果顯示：在常溫、無離子環(huán)境下的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，鰱魚頭磷脂的乳化能力稍低于大豆卵磷脂；離子強(qiáng)度對鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力影響都較大，高離子強(qiáng)度甚至?xí)蛊鋯适榛芰?；兩者在中性和低溫環(huán)境中乳化性能較好，在30～50℃的環(huán)境中鰱魚頭磷脂的乳化能力稍好于大豆卵磷脂?？傮w而言，鰱魚頭磷脂的乳化特性接近于大豆卵磷脂，但是鰱魚頭磷脂含有DHA，通過對鰱魚頭磷脂的研究，可以進(jìn)一步豐富新的功能型磷脂在食品工業(yè)中的應(yīng)用。