鰱魚頭磷脂的提取工藝優(yōu)化及乳化性能研究

王然然，王 琦,2，王學東，岳大鵬，陳季旺，張維農(nóng),2，王海濱，賀軍波,2

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023； 2.武漢輕工大學 油脂及植物蛋白工程技術研發(fā)中心，武漢 430023)

磷脂是細胞基本結構中的主要成分之一，具有多種生理功效，如活化細胞，調(diào)節(jié)身體激素平衡，增強人體免疫力和再生力等[1]。在結構方面，磷脂屬兩親結構，是一種兩性表面活性劑，親油一端將油滴以薄膜狀的形式包裹，親水一端與水分子相吸，大大降低了水油之間的界面張力，從而使水和油形成了均勻穩(wěn)定的乳液。磷脂應用在食品工業(yè)中具有乳化和抗氧化等作用[2]。

鰱魚屬大宗淡水魚，是我國著名四大家魚之一，目前已成為很好的水產(chǎn)加工原料，但有關鰱魚在食品方面的研究主要集中在魚糜、魚皮和魚油等方面[3-4]，有關魚頭方面的研究較少。魚頭作為鰱魚加工的主要副產(chǎn)物之一，占全魚質(zhì)量的1/4～1/3，主要用于加工動物飼料，原料的利用率不高且附加值較低,對鰱魚頭中磷脂的提取分析研究報道鮮見[5-6]。目前，磷脂的提取方法主要有溶劑萃取法[7]、柱層析法[8]、超臨界CO2萃取法和膜分離法[9]等。基于成本和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，本文選擇溶劑萃取法提取鰱魚頭磷脂，提高了鰱魚副產(chǎn)物的加工價值，同時檢測鰱魚頭磷脂的乳化特性并與常見的商品大豆卵磷脂作比較，為其在食品工業(yè)中的進一步應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮活鰱魚，武漢華南海鮮批發(fā)市場；大豆卵磷脂，美國Sigma公司；無水乙醇、氯仿、甲醇、氨水、三氧化鉬、鉬粉、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鈣，均為分析純；正己烷，色譜純；長康綠態(tài)原香四級壓榨菜籽油，湖南岳陽；磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰膽堿(PC)、鞘磷脂(SM)，瑞典Larodan公司。

YRE-301旋轉蒸發(fā)器；YH-500隔膜真空泵；SHZ-82水浴恒溫振蕩器；FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機；FD5冷凍干燥機；UV-1100紫外可見分光光度計；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；層析硅膠(GF254)薄板-鋁箔片基。

1.2 試驗方法

1.2.1 鰱魚頭磷脂提取

新鮮鰱魚頭→破壁機破碎→真空冷凍干燥→加入乙醇溶液→恒溫振蕩器中振蕩提取一定時間→抽濾→濾液于80℃真空旋轉蒸發(fā)去除溶劑→磷脂產(chǎn)物。

1.2.2 磷脂純度和磷脂產(chǎn)物提取率的測定

參考SN/T 3851—2014測定磷脂純度。

1.2.3 鰱魚頭磷脂組成分析

薄板在烘箱105℃烘干活化1～2 h，取出在干燥器中冷卻至室溫即可使用。將薄板切割為寬5 cm、長10 cm，按照氯仿、甲醇與水體積比為65∶25∶4配制展開劑，將磷脂樣品配成200 mg/mL的氯仿溶液進行點板，在展開劑中展開離薄板頂端2 cm處取出，使用Dittmer-Lester試劑對薄層結果進行顯色和分析，然后掃描薄層結果，并使用Scion Image軟件處理圖像后分析不同磷脂種類含量。

1.2.4 鰱魚頭磷脂的脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定鰱魚頭磷脂的脂肪酸組成。

氣相色譜條件：HP-FFAP石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序為160℃保持2 min，以20℃/min升至300℃，保持6 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa；進樣量1 μL；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；掃描速度3.21次/s；質(zhì)量掃描范圍(m/z)10～460。

用氣相色譜-質(zhì)譜進行全離子掃描分析。用化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和標準質(zhì)譜圖庫NIST11進行解析,確認鰱魚頭磷脂中各種脂肪酸的化學結構。根據(jù)化合物色譜峰響應，利用面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量。

1.2.5 乳化性能的測定

1.2.5.1 乳化步驟

樣品乳化劑(一定質(zhì)量濃度鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂)→一定溫度下保溫10 min→加入10 mL菜籽油和10 mL蒸餾水→于8 000 r/min的轉速下勻漿2 min→調(diào)整pH→快速轉移到相應溫度的水浴鍋中靜置4 h→計算乳液的乳化層比例。

1.2.5.2 乳化層比例的計算

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)初步整理后，采用SPSS 17.5統(tǒng)計軟件用于正交試驗優(yōu)化設計及其方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設置50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇體積分數(shù)梯度，在料液比1∶10、提取溫度25℃、提取時間1.5 h條件下，考察乙醇體積分數(shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖1可知，磷脂純度隨著乙醇體積分數(shù)的升高先增大后減小，當乙醇體積分數(shù)為70%時，磷脂純度最高，達54.85%。乙醇體積分數(shù)較低時，水分過多，極性過強，磷脂的溶解度下降，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，極性逐漸減弱，使乙醇的I/O值(無機性值/有機性值)接近被提取磷脂的I/O值，磷脂的溶解度逐漸上升，當乙醇體積分數(shù)過高時，又會因為極性的下降，使磷脂的溶解度降低[10]。陳文娟等[11]發(fā)現(xiàn)大黃魚魚卵乙醇提取物中磷脂含量隨著乙醇體積分數(shù)的增大逐漸增大，而用無水乙醇提取時，磷脂含量反而下降。最佳乙醇體積分數(shù)的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，磷脂產(chǎn)物提取率處于3.35%～5.70%之間，波動不大，當乙醇體積分數(shù)為70%時，磷脂產(chǎn)物提取率為4.39%，因此確定70%為最佳乙醇體積分數(shù)。

溯江而下，江面的水產(chǎn)養(yǎng)殖，一度成為生態(tài)公害。珍珠、漁業(yè)這些新興產(chǎn)業(yè)給村民帶來財富的同時，也付出著昂貴的生態(tài)代價。

2.1.2 料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設置1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14的料液比梯度，在乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度25℃、提取時間1.5 h條件下，考察料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖2可知，磷脂純度隨著料液比的增加逐漸升高，但當料液比從1∶8增加到1∶12時，磷脂純度的增加幅度不明顯，當增加到1∶14時有下降的趨勢。當溶劑量增加時，增加了鰱魚頭粉與乙醇溶液的接觸面積，促進磷脂的析出，但溶劑量過大，則成本大，經(jīng)濟性差，在料液比1∶8時，磷脂純度較高，為61.07%。許艷萍等[12]發(fā)現(xiàn)過高的料液比會導致部分非磷脂成分在溶液中的溶解度升高，影響磷脂的純度，與本試驗研究結果一致。最佳料液比的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，料液比為1∶6～1∶12時，磷脂產(chǎn)物提取率處于2.78%～3.12%之間，波動不大，當料液比為1∶8時，磷脂產(chǎn)物提取率為2.78%，因此確定1∶8為最佳料液比。

2.1.3 提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設置25、35、45、55、65℃和75℃的提取溫度梯度，在乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶8、提取時間1.5 h條件下，考察提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響，結果見圖3。

圖3 提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖3可知，磷脂純度隨著提取溫度的升高先上升后下降，當提取溫度為45℃時，磷脂純度最高，達63.41%。提取溫度的升高可加快溶質(zhì)的傳質(zhì)速率，利于磷脂的析出，但隨著提取溫度繼續(xù)升高，乙醇揮發(fā)加劇，導致體系內(nèi)乙醇體積分數(shù)降低，不利于磷脂的提取。過高的溫度還會使磷脂氧化降解，影響磷脂的純度[13]。最佳提取溫度的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，提取溫度從35℃升高到65℃時，磷脂產(chǎn)物提取率呈明顯降低趨勢，當提取溫度為45℃時，磷脂提取率為2.55%，因此確定45℃為最佳提取溫度。

2.1.4 提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響

取2.5 g經(jīng)冷凍干燥后的鰱魚頭粉，設置1.5、3、4.5、6、7.5 h和9 h的提取時間梯度，在乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶8、提取溫度45℃條件下，考察提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響，結果見圖4。

圖4 提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響

由圖4可知，提取時間超過3 h后，磷脂純度無明顯變化。延長時間有利于磷脂在有機溶劑中的析出，但是乙醇溶液對磷脂的提取能力最終會達到飽和狀態(tài)，提取時間達到3 h時，達到飽和狀態(tài)，純度為66.2%。最佳提取時間的選取同時參考磷脂產(chǎn)物提取率，提取時間為3 h時，磷脂產(chǎn)物提取率最高，達3.47%，因此確定3 h為最佳提取時間。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗得到的最佳乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間，設計四因素三水平的正交試驗優(yōu)化鰱魚頭磷脂提取工藝。正交試驗因素與水平見表1，正交試驗方案及結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗方案及結果

表3 方差分析

從表2可知，影響鰱魚頭磷脂純度的主次因素依次為A>D>C>B，即乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫度>料液比。從表3可知，乙醇體積分數(shù)和提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響非常顯著，而料液比和提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響顯著。綜上所述，根據(jù)正交試驗結果，確認最佳工藝條件為A3B3C1D2，即乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶10，提取溫度35℃，提取時間3 h。根據(jù)正交試驗得到的最佳工藝條件做3組平行試驗，3次試驗磷脂產(chǎn)物提取率的平均值為3.35%，磷脂純度平均值為74.45%。

2.3 鰱魚頭磷脂薄層分析結果

最優(yōu)條件下提取的鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂薄層分析結果見圖5和表4。

圖5 不同磷脂薄層分析結果

表4 鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂各組分含量 %

注：同行數(shù)值后不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

從圖5和表4可知：鰱魚頭磷脂包含PC、PE和SM 3種組分，含量依次為PC>PE>SM；大豆卵磷脂含有PC、PE、SM、PA和PI 5種組分，含量依次為PC>PE>SM>PA>PI；PC和PE在鰱魚頭磷脂中的含量高于大豆卵磷脂。

PC是生物體生長發(fā)育極為重要的磷脂[14]。PE又稱腦磷脂，是神經(jīng)細胞膜的重要組成部分，可改善大腦功能[15]。SM的兩大代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺和鞘氨醇參與體內(nèi)的細胞生長、分化和凋亡等生理活動，對于抑制癌癥具有潛在的作用效果[16]。鰱魚頭磷脂中的PC、PE和SM含量都較高，可以推測鰱魚頭磷脂具有較好的生理活性。

2.4 鰱魚頭磷脂脂肪酸組成

最優(yōu)條件下提取的鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂脂肪酸組成見表5。

表5 鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂脂肪酸組成 %

由表5可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂都以多不飽和脂肪酸(PUFA)為主，PUFA的含量在大豆卵磷脂中高于鰱魚頭磷脂。就PUFA而言，鰱魚頭磷脂以C22∶6n-3(DHA)為主，大豆卵磷脂以C18∶2n-6為主。

2.5 乳化性能的測定結果

2.5.1 磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設置0.25、0.5、1、3 mg/mL和5 mg/mL磷脂質(zhì)量濃度梯度，在溫度20℃、pH 7條件下考察磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結果見圖6。

圖6 磷脂質(zhì)量濃度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖6可知，在常溫下，無離子環(huán)境中，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化層比例隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加而漸漸增加，鰱魚頭磷脂增加的幅度較大豆卵磷脂緩慢。有文獻報道[17]，想要獲得良好乳化效果的前提是要加入足夠量的乳化劑，因為兩相水油界面吸附的分子數(shù)目會因為乳化劑濃度較低而過低，導致界面膜強度差，乳液穩(wěn)定性弱，只有當乳化劑濃度達到相當量時，界面膜上膠黏分子較多，界面膜強度較強，乳液中液滴分離性較好而不易發(fā)生聚結，乳液穩(wěn)定性好。鰱魚頭磷脂在當前試驗條件下，乳化能力稍低于大豆卵磷脂，結合對鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂組成分析發(fā)現(xiàn)，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂皆以PC為主，PC能在乳液界面形成有序單分子層和雙層膜的層狀結構，利于乳液的穩(wěn)定；同時發(fā)現(xiàn)PC含量高的混合磷脂較PC含量低的混合磷脂不易形成穩(wěn)定的乳狀液，這可能是因為大豆卵磷脂中的PA和PI帶有電荷，PA和PI在水中溶解性更好，比中性磷脂作乳化劑更易分散，以形成更強的界面膜，提高了乳液的穩(wěn)定性[18-19]。

2.5.2 離子強度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

在乳化前加入NaCl或CaCl2，設置0.05%、0.1%、0.2%和0.4%的離子添加量梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、溫度20℃、pH 7條件下，考察離子強度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結果見圖7。

圖7 NaCl添加量對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

圖8 CaCl2添加量對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖7和圖8可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力隨著離子強度的增加都逐漸減小。不含電解質(zhì)或電解質(zhì)濃度較低時，能有效地阻止乳液中質(zhì)點間發(fā)生不可逆絮凝，增加電解質(zhì)或電解質(zhì)濃度時，則降低了雙電層的厚度并降低了顆粒之間的靜電排斥力，乳液中質(zhì)點間將易發(fā)生不可逆絮凝[20]。CaCl2對不同種類磷脂乳化能力的影響大于NaCl。相同質(zhì)量濃度下，CaCl2對乳液的破壞作用大于NaCl，這是因為當電解質(zhì)離子濃度相同時，電解質(zhì)離子的電荷數(shù)越大，其壓縮雙電層的作用越明顯，電位越低，乳液穩(wěn)定性越差[21]。

2.5.3 pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設置pH分別為3、4、5、6、7、8、9的乳液pH梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、溫度20℃條件下，考察pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結果見圖9。

圖9 pH對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖9可知，在pH處于3～6之間時，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂基本都無乳化能力，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂皆在pH 7時乳化效果最佳，隨著pH的增加，鰱魚頭磷脂乳化效果有所降低，與大豆卵磷脂一致。磷脂類組分屬于離子型表面活性劑，pH對其影響很大，只有在磷脂分子離子化時才表現(xiàn)出表面活性。pH的波動將造成活性表面分子的電離狀態(tài)的變化，升高或降低乳液的穩(wěn)定性，由于磷脂帶有大量的電荷，在pH為中性的環(huán)境中，磷脂具有較強的靜電斥力作用，從而吸附在油滴表面，以保持乳液的穩(wěn)定，但當環(huán)境轉變?yōu)樗嵝詶l件時，則是不穩(wěn)定的[22]。

2.5.4 溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

設置4、20、30、40、50℃和60℃的溫度梯度，在磷脂質(zhì)量濃度1 mg/mL、pH 7條件下，考察溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響，結果見圖10。

圖10 溫度對乳液體系中磷脂乳化能力的影響

由圖10可知，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力隨著溫度的升高而有所降低。低溫條件下鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化穩(wěn)定性較好，4℃和20℃下，鰱魚頭磷脂的乳化能力稍低于大豆卵磷脂，溫度升高到30～50℃時，鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力都出現(xiàn)下降，前者的乳化能力高于后者，溫度升至60℃時兩者都失去了乳化能力。高溫降低磷脂的乳化能力，乳化劑的溶解度會隨著溫度的升高而增大，油水界面上吸附的磷脂將因為其溶解度的增大而大幅度減少，界面膜強度變?nèi)?，同時，乳液自身的黏度會隨著溫度的上升而下降，乳液內(nèi)部的質(zhì)點與質(zhì)點之間的碰撞概率上升，從而影響乳液的穩(wěn)定性[23]。

3 結 論

采用乙醇溶液提取鰱魚頭磷脂，以期得到高純度磷脂。采用單因素試驗和正交試驗考察乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間的影響。結果發(fā)現(xiàn)：乙醇體積分數(shù)和提取時間對鰱魚頭磷脂提取的影響非常顯著，而料液比和提取溫度對鰱魚頭磷脂提取的影響顯著。最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)80%、料液比1∶10、提取溫度35℃、提取時間3 h，在此條件下磷脂產(chǎn)物提取率為3.35%，磷脂純度高達74.45%。利用此方法提取鰱魚頭磷脂，可一次性提取較高純度的磷脂，簡便快捷，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

對鰱魚頭磷脂的乳化特性進行研究，并與商品大豆卵磷脂作比較，結果顯示：在常溫、無離子環(huán)境下的試驗濃度范圍內(nèi)，鰱魚頭磷脂的乳化能力稍低于大豆卵磷脂；離子強度對鰱魚頭磷脂和大豆卵磷脂的乳化能力影響都較大，高離子強度甚至會使其喪失乳化能力；兩者在中性和低溫環(huán)境中乳化性能較好，在30～50℃的環(huán)境中鰱魚頭磷脂的乳化能力稍好于大豆卵磷脂?？傮w而言，鰱魚頭磷脂的乳化特性接近于大豆卵磷脂，但是鰱魚頭磷脂含有DHA，通過對鰱魚頭磷脂的研究，可以進一步豐富新的功能型磷脂在食品工業(yè)中的應用。