谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化蛋白質(zhì)糖基化的研究進(jìn)展

李洪波，李春爽，張?zhí)扃鳎罴t娟，于景華

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

蛋白質(zhì)為生命活動提供必需氨基酸，但天然蛋白質(zhì)在某些功能性質(zhì)上具有局限性，不能滿足加工過程中的需求，可通過物理、化學(xué)、酶法、基因工程或化學(xué)-酶法結(jié)合等技術(shù)修飾[1]，從而改變蛋白質(zhì)的某個理化性質(zhì)，達(dá)到改善蛋白質(zhì)功能特性的目的。

蛋白質(zhì)糖基化是化學(xué)改性方法中的一種，廣泛存在于酒液釀造、香精生產(chǎn)、煙草制造等過程中。該過程是將親水性的糖與蛋白質(zhì)分子共價交聯(lián)，使產(chǎn)物兼具蛋白質(zhì)大分子的功能特性和糖的親水性，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性，并改善蛋白質(zhì)的其他功能特性[2]。美拉德反應(yīng)是蛋白質(zhì)糖基化修飾的途徑之一，在食品的色、香、味等風(fēng)味特征中起重要作用，但經(jīng)較長時間加熱處理或在長期保存的氧化過程中會產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，該物質(zhì)可能與一些潛在的慢性病形成有關(guān)[3]。與美拉德反應(yīng)相比，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase)催化糖基化反應(yīng)的條件溫和，同時利用了酶的專一性，能有效減少AGEs的產(chǎn)生。有研究表明，酶促糖基化產(chǎn)物對AGEs的主要成分Nε-(1-羧甲基)-L-賴氨酸(CML)的抑制率是普通抗氧化劑氨基胍的兩倍[4]。TGase作為生物催化劑，催化蛋白質(zhì)糖基化從而改善蛋白質(zhì)的功能特性，使其在食品加工過程中具有良好的發(fā)展前景。本文綜述了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化蛋白質(zhì)糖基化途徑，并對反應(yīng)機(jī)理、作用形式及其產(chǎn)物在食品中的應(yīng)用進(jìn)行了闡述。

1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)機(jī)理

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的蛋白酶，其中?；w為蛋白質(zhì)多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基。當(dāng)多肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基為氨基受體時，TGase催化形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸異肽鍵，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)。當(dāng)伯胺類物質(zhì)為氨基受體時，TGase催化谷氨酰胺殘基與伯胺類物質(zhì)發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[5]。如果小分子伯胺物質(zhì)為氨基糖時，即發(fā)生蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)。但是，在TGase催化蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)時，蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)反應(yīng)也在進(jìn)行，這兩個反應(yīng)存在競爭關(guān)系[6]。若底物中不存在氨基，水作為酰基受體，谷氨酰胺殘基脫酰胺形成谷氨酸和氨[7]，反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。

注：(a)谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基交聯(lián)反應(yīng)；(b)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)； (c)脫酰胺反應(yīng)。

圖1 TGase反應(yīng)機(jī)理

2 TGase酶促糖基化的作用形式

與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究相比，酶促糖基化反應(yīng)的研究較少。1984年，Yan等[8]利用動物來源TGase催化β-酪蛋白與胺化麥芽三糖的連接，首次證實(shí)了TGase催化蛋白質(zhì)糖基化的可行性，隨后開始了酶促糖基化的研究。表1列舉了TGase酶促糖基化的研究進(jìn)展。

上海市化工行業(yè)協(xié)會是由從事化工生產(chǎn)、經(jīng)營、施工、科研、教育、設(shè)計及服務(wù)等活動的企事業(yè)單位、團(tuán)體和其他經(jīng)濟(jì)組織自愿組成的行業(yè)性社會團(tuán)體。據(jù)統(tǒng)計，上海與化工相關(guān)的企業(yè)總計有2000多家，其中納入上海市統(tǒng)計局統(tǒng)計范圍的規(guī)模以上化工企業(yè)680家。目前會員單位有232家，約占規(guī)模以上企業(yè)29%。協(xié)會會員單位的構(gòu)成主要有：中央在滬企業(yè)、國有企業(yè)、民營企業(yè)、中外合資企業(yè)、外商獨(dú)資企業(yè)等，集中了國內(nèi)外一大批著名集團(tuán)公司和企業(yè)。

表1 TGase酶促糖基化反應(yīng)研究進(jìn)展

注：表中“-”為尚未明確報道。

到目前為止，他僅完成了大伯的“交牲”——?dú)⒁活^牛給他死去的大伯，其他3位伯父，還欠著?！拔矣X得很內(nèi)疚，”陶興文說，“我向我父親申請，看能不能改變下習(xí)俗，通融一下，讓我?guī)讉€堂兄弟，跟我一起祭祀?！?/p>

TGase催化蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)主要有3種形式：①TGase催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)后形成高聚物再與糖分子發(fā)生美拉德反應(yīng)，探究美拉德反應(yīng)是否可以改善TGase交聯(lián)的蛋白性質(zhì)，如經(jīng)TGase催化交聯(lián)后的米渣蛋白與不同相對分子質(zhì)量的糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，與交聯(lián)蛋白相比，相對分子質(zhì)量較低的五碳糖-核糖糖基化產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的乳化性，乳化活力指數(shù)(EAI)提高約96%，乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)提高近70%[18]。②蛋白質(zhì)和糖首先參與美拉德反應(yīng)，再經(jīng)TGase酶法脫酰胺改性來增加親水側(cè)鏈羧基含量，此方法目的是通過美拉德反應(yīng)掩蓋蛋白質(zhì)中賴氨酸側(cè)鏈上ε-NH2，從而減少分子間或分子內(nèi)交聯(lián)，使修飾的蛋白既具有糖的親水性，又能減少高分子聚合物，從而提高溶解度。如將谷朊分別與葡萄糖或葡聚糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，經(jīng)TGase處理后得到的產(chǎn)物與非糖基化谷朊相比，溶解性小幅度提高約4%，持水性在酶反應(yīng)1 h內(nèi)顯著提高了1倍[19]。③TGase直接催化糖基化反應(yīng)，以改善蛋白性質(zhì)。Jiang[20-21]、Song[22]等利用TGase催化幾種蛋白與帶伯胺的糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，以研究改性蛋白性質(zhì)變化，結(jié)果表明，與原蛋白相比，其中大豆蛋白-氨基葡萄糖EAI、ESI分別增加19%和35%，泡沫穩(wěn)定性提高29%，凝膠強(qiáng)度提高30%，酪蛋白-氨基葡萄糖EAI和ESI分別增加10.5%和13.8%，泡沫穩(wěn)定性提高6.4%，在pH 6和pH 9下溶解度分別提高23.9%和10.2%，酪蛋白酸鈉-殼聚糖EAI提高14.5%，ESI差別不大，凝膠時間縮短105～125 min。王曉杰等[23]對酶促糖基化改善玉米蛋白性質(zhì)方面的研究表明，糖基化修飾和體外消化均可以明顯改善玉米谷蛋白的抗氧化活性和體外促酒精代謝活性，與原蛋白相比，在TGase作用下玉米谷蛋白-殼寡糖體外消化性提高18.08%。

酶促糖基化產(chǎn)物在魚類產(chǎn)品深加工、副產(chǎn)物的利用方面也有一定的應(yīng)用潛力。Fan等[34]用TGase催化魚鱗膠原蛋白與殼聚糖的交聯(lián)，并作用于小鼠成纖維細(xì)胞L929，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該交聯(lián)產(chǎn)物明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加膠原蛋白的分泌，有助于提高細(xì)胞的吸濕性、保水性、抗氧化性。所以該交聯(lián)作用具有修復(fù)皮膚細(xì)胞的潛力，可能在化妝品、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域有更多的應(yīng)用價值。Hong等[35]將酶降解的魚皮明膠蛋白水解物與氨基葡萄糖在TGase存在下糖基化，結(jié)果表明，在亞油酸氧化體系中，經(jīng)堿性蛋白酶水解物在25℃下糖基化3.5 h得到的交聯(lián)衍生物，抗氧化活性和生物活性比原水解物有所提高，這種糖基化肽可以作為潛在的抗菌劑和抗氧化劑。利用酶促糖基化方法加工水產(chǎn)品副產(chǎn)物可以進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)價值，減少資源浪費(fèi)。

酶促糖基化蛋白可以減少水產(chǎn)品的致敏性。研究表明酶促糖基化后的原肌球蛋白的致敏性降低，這是由于賴氨酸和谷氨酰胺等游離氨基酸殘基的修飾會改變結(jié)合表位，從而影響了抗體的結(jié)合能力。同時，酶促產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的改變也可能導(dǎo)致抗原表位的隱藏或暴露，影響致敏性抗體IgG/IgE結(jié)合能力[33]。

甜蕎優(yōu)良品種篩選及配套栽培技術(shù)研究…………………………… 羅中旺，金曉蕾，辛萬和，智 銳，靳偉龍，關(guān) 奎，黃潁奇（22）

3 TGase酶促糖基化蛋白在食品中的應(yīng)用

TGase催化蛋白質(zhì)糖基化利用酶的專一性、高效性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，主要針對蛋白側(cè)鏈基團(tuán)或多肽鏈進(jìn)行特異性修飾，改善食品蛋白的諸多性質(zhì)，從而提高食品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，同時經(jīng)改性的蛋白質(zhì)分子或多肽在開發(fā)利用加工副產(chǎn)物方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。以下主要介紹了TGase催化蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)在不同食品中的應(yīng)用。

3.1 TGase酶促糖基化蛋白在谷類食品中的應(yīng)用

面筋蛋白是小麥淀粉的加工副產(chǎn)物，因其含有較多的疏水性氨基酸，溶解度較低，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，可通過酶促糖基化提高其功能特性。Gottardi等[30]利用蛋白酶水解面筋蛋白得到多肽，隨后與氨基葡萄糖在不同溫度下分別進(jìn)行美拉德反應(yīng)和TGase催化糖基化反應(yīng)。結(jié)果表明,在37℃下，與美拉德反應(yīng)結(jié)果相比，酶促糖基化修飾產(chǎn)物的抗氧化性提高近3倍，且具有抗菌性，同時減少了美拉德反應(yīng)中副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

進(jìn)一步研究表明, 美拉德反應(yīng)與酶促糖基化反應(yīng)存在競爭關(guān)系，其中酶促糖基化占主導(dǎo)地位，這可能是由于美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)物不穩(wěn)定，從而更有利于穩(wěn)定的酶促糖基化共軛物的形成，并相對減少美拉德副產(chǎn)物的產(chǎn)生[16]，也可能是糖在TGase催化作用下與肽鏈中谷氨酰胺殘基的結(jié)合位點(diǎn)形成空間位阻，阻礙了谷氨酰胺殘基附近的賴氨酸殘基與糖的美拉德反應(yīng)，從而減少AGEs的形成[17]。酶促糖基化過程也會影響蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)。質(zhì)譜和動態(tài)光散射分析表明，蛋白質(zhì)聚合物的尺寸隨著氨基糖濃度的增大逐漸減小。這表明氨基糖和多肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基競爭氨基受體，從而降低了蛋白質(zhì)的聚合程度[6]。

昆明市發(fā)展鄉(xiāng)村旅游的鄉(xiāng)鎮(zhèn)大多處于偏僻地區(qū)，團(tuán)結(jié)鄉(xiāng)則位于昆明市西郊。近年來，團(tuán)結(jié)鄉(xiāng)通過新農(nóng)村建設(shè)等途徑，在一定程度上提升了城鎮(zhèn)化水平，但基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)相比其他地區(qū)依然落后，農(nóng)村道路和衛(wèi)生條件有待改善，人口素質(zhì)有待提高。

3.2 TGase酶促糖基化蛋白在水產(chǎn)品中的應(yīng)用

一般來說，與交聯(lián)蛋白相比，蛋白與氨基糖的結(jié)合增強(qiáng)了改性產(chǎn)物的功能性質(zhì)。據(jù)報道，蛋白質(zhì)的疏水性殘基可以錨定到乳液或泡沫中油/氣滴的表面，同時親水性殘基定向到覆蓋在油/氣滴表面的水相[26]。高相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)聚合物及低活性的交聯(lián)蛋白降低了其泡沫形成能力和乳化活性[27-28]。但是蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基糖的結(jié)合會增加蛋白表面的親水性，并增強(qiáng)蛋白分子水化或水結(jié)合能力，致使酶促糖基化的改性蛋白可以形成更加穩(wěn)定的乳液或泡沫[20]。同時，蛋白質(zhì)的交聯(lián)和酶促糖基化可以通過隱藏過敏表位來協(xié)同改善食物蛋白的致敏性[25,29]。

酶促糖基化反應(yīng)可以改善乳蛋白的功能性質(zhì)。一般情況下，酶促糖基化反應(yīng)會提高蛋白的乳化性，而Chen等[6]研究酶促糖基化乳清蛋白的乳化性質(zhì)分別在高鹽濃度體系和低鹽濃度體系下的變化，結(jié)果表明，在兩種體系下最理想的結(jié)合方式是酶促分子間或分子內(nèi)交聯(lián)，即在此反應(yīng)條件下的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最高，因形成的大分子有更厚、更強(qiáng)的屏障，能夠降低油水乳化體系中的聚結(jié)和絮凝。而TGase催化糖基化反應(yīng)會抑制分子間或分子內(nèi)交聯(lián)，形成的相對分子質(zhì)量較小，吸附在油水界面上的蛋白層較薄，因此乳化活性和乳化穩(wěn)定性較低。

TGase催化蛋白交聯(lián)，形成大分子聚合物。研究表明，高相對分子質(zhì)量的聚合物和擴(kuò)展的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會改變交聯(lián)蛋白的某些功能性質(zhì)，如溶解性的降低，表面疏水性的增加，表觀黏度的增加或凝膠特性的變化[24]。當(dāng)糖基化和蛋白交聯(lián)同時發(fā)生時，改性產(chǎn)物的功能受到兩個反應(yīng)的綜合影響。如TGase催化蛋白質(zhì)低聚物的形成展開了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致掩埋在三級結(jié)構(gòu)中的疏水氨基酸殘基暴露，增加了其表面疏水性[20]。但結(jié)合了氨基糖的蛋白的親水性卻有所增加，這主要是由于氨基糖的結(jié)合類似于蛋白質(zhì)多肽鏈的一個分支結(jié)構(gòu)，干擾了蛋白質(zhì)分子二級結(jié)構(gòu)的有序形成，從而得到了開放的二級結(jié)構(gòu)，增加了蛋白的親水性[21,25]?？偟慕Y(jié)果是，改性產(chǎn)品的表面疏水性(或親水性)降低(或增加)。

3.3 TGase酶促糖基化蛋白在乳制品中的應(yīng)用

Case1.G=,此時G內(nèi)冪零,由定理5可知若m≥2,P?(G)連通且diam(P?(G))≤4;若m=1,由定理6的證明可知CP(Q)=1,再利用定理5可知真冪圖P?(G)不連通且連

酶促糖基化后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也會發(fā)生相應(yīng)的變化，一般表現(xiàn)為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)更開放，三級結(jié)構(gòu)中酪氨酸分子呈現(xiàn)暴露態(tài)，這些構(gòu)象的變化改善了蛋白質(zhì)的功能特性。全越[31]利用TGase催化燕麥麩皮中球蛋白與氨基葡萄糖交聯(lián)，相比未修飾球蛋白，交聯(lián)后蛋白質(zhì)的β-折疊降低，α-螺旋增加，β-轉(zhuǎn)角減少。而在Zhang等[32]修飾黑豆分離蛋白方法中，比較濕熱糖基化處理、TGase催化與殼寡糖糖基化、酶催化蛋白之間交聯(lián)3個反應(yīng)分別對原蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，結(jié)果表明糖基的導(dǎo)入使得蛋白質(zhì)形成更加開放的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲減少，有序的二級結(jié)構(gòu)增多。

酶促糖基化反應(yīng)也可以降低牛乳中β-乳球蛋白的致敏性。Yuan等[16]探究β-乳球蛋白與氨基葡萄糖酶促糖基化對致敏性影響，結(jié)果表明，在37℃下，相比原β-乳球蛋白，經(jīng)修飾后的蛋白與致敏性抗體IgG和IgE結(jié)合能力降低，因結(jié)構(gòu)變化使抗原表位隱藏或暴露，從而降低了與致敏性抗體結(jié)合能力。

3.4 TGase酶促糖基化蛋白的其他應(yīng)用

(1)作為微膠囊壁材。由于海藻油中含有對人體有益的多不飽和脂肪酸，但加入食品中極易氧化，Yuan等[36]用大豆蛋白和殼聚糖復(fù)合凝聚作為制備海藻油微膠囊壁材，加入TGase使壁材的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)一步堅(jiān)固，提高了微膠囊的氧化穩(wěn)定性。

(2)制備可食性膜。Di Pierro等[37]在TGase催化作用下制備殼聚糖-乳清蛋白可食性膜，制成的交聯(lián)膜在較寬泛的酸堿度范圍內(nèi)都具有較低的溶解性、溶脹度和良好的生物降解性。TGase的存在也增強(qiáng)膜機(jī)械阻力，降低變形能力，對氧和二氧化碳的阻隔效率明顯提高，減少了水蒸氣的滲透性。在使用TGase催化制備殼聚糖-卵清蛋白膜中也得到同樣效果，并且經(jīng)胰蛋白酶水解，表現(xiàn)出優(yōu)良的酶水解性[38]。研究發(fā)現(xiàn)酶促糖基化反應(yīng)中加入果膠，會促使化學(xué)鍵交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使可食性膜更堅(jiān)固[39-40]。總之，TGase酶促糖基化方式能明顯提高膜強(qiáng)度，在可食性膜的制備中具有廣闊的發(fā)展前景。

(3)作為調(diào)味劑的配方成分。在Hong等[41]的實(shí)驗(yàn)中，將雞肉蛋白分別用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解，并對水解產(chǎn)物肽進(jìn)行改性，即在TGase催化下與氨基葡萄糖作用，制備液體調(diào)味品成分，進(jìn)行感官評價。發(fā)現(xiàn)TGase存在與否對于增強(qiáng)鹽味并沒有顯著性作用，但是酶促糖基化限制了氨基葡萄糖對水解肽的潛在修飾作用，顯著抑制AGEs的合成，從而減少有毒物質(zhì)積累。

4 展 望

綜觀谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的應(yīng)用研究歷程，充分利用食品加工副產(chǎn)物是酶促糖基化蛋白質(zhì)的研究熱點(diǎn)，以減少浪費(fèi)、提高經(jīng)濟(jì)價值為出發(fā)點(diǎn)，對食品加工副產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)處理，通過酶促糖基化反應(yīng)改善蛋白功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)，完善糖基化反應(yīng)條件，將在食品領(lǐng)域中有更廣泛的發(fā)展前景。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶作為生物催化劑，如何更具安全性地添加到食品中也是今后研究的重點(diǎn)。