HIF-1α、PD-L1與非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

齊 倩 王春梅 楊 娟 田 英 馮 超

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常見的一類病理類型，其約占肺癌患者總數(shù)的85%，且發(fā)現(xiàn)時(shí)往往處于疾病中晚期，雖然近年來微創(chuàng)手術(shù)、放療及免疫靶向治療等手段的開展有效的提升了NSCLC的療效，但此類患者遠(yuǎn)期存活率仍顯著較低[1-2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC患者病灶擴(kuò)散的重要方式之一，研究指出，對未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行預(yù)測性評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)對于患者手術(shù)及治療具有較好的指導(dǎo)意義[3-4]。Aguiar等[5]研究提出，程序性死亡分子配體(programmed death-ligand 1, PD-L1)是多個(gè)免疫細(xì)胞表面關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)，其表達(dá)與NSCLC在治療中發(fā)生免疫逃逸具有高度的相關(guān)性。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作為NSCLC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移重要影響因素，乏氧反應(yīng)在其中扮演了很重要的角色，乏氧反應(yīng)誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)則是介導(dǎo)乏氧反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其表達(dá)與NSCLC的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。但目前國內(nèi)關(guān)于HIF-1α、PD-L1表達(dá)水平與NSCLC患者術(shù)后淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)研究較少，為此我院對97例患者進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2015年12月至2017年12月于我院行肺葉切除術(shù)且未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者97例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》中對于NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②病例資料完整；③于我院行肺葉切除術(shù)且術(shù)后病理檢查提示無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和切緣陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型腫瘤；②嚴(yán)重的器官功能障礙；③抗腫瘤治療史；④合并其他肺部疾病。與患者及家屬簽訂知情同意書后納入研究。所有患者年齡范圍45～78歲，平均年齡(56.08±11.27)歲；平均病程(1.34±0.79)個(gè)月；TMN分期Ⅰ期44例、Ⅱ期53例；腺癌69例，非腺癌28例。

二、研究方法

1. 病灶組織固定切片： 對術(shù)中切除的病灶組織進(jìn)行甲醛固定后使用石蠟包埋，并按照厚度5 μm進(jìn)行連續(xù)切片備用。

2. 免疫組化染色： 對術(shù)中完成的切片進(jìn)行脫蠟并使用蒸餾水反復(fù)沖洗直至切片潔凈，使用山羊血清封閉室溫下30 min對切片進(jìn)行抗原修復(fù)，而后不同樣本分別滴加HIF-1α及PD-L1單抗共同孵育，滴加單抗后樣本于室溫下放置30 min后放入4 ℃環(huán)境中保存過夜，次日將樣本取出并于室溫下放置50 min復(fù)溫，而后磷酸鹽PBS進(jìn)行反復(fù)沖洗3次，分別滴加HIF-1α及PD-L1二抗，室溫下共同孵育30 min后使用PBS再次進(jìn)行沖洗3次(5 min/次)，徹底清潔切片周圍液體后滴加顯色劑DAB工作液于室溫下孵育5～10 min后使用蒸餾水沖洗3次，二手使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，隨后對切片進(jìn)行分化(鹽酸乙醇)及反藍(lán)(飽和碳酸鋰)處理，蒸餾水充分沖洗后對切片進(jìn)行脫水(95%乙醇)、透明處理(二甲苯)，并使用中性樹膠封片。

三、觀察指標(biāo)

影像學(xué)檢查、術(shù)中病理檢查符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》中對于肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判定標(biāo)準(zhǔn)[9]。采用半定量法，HIF-1α及PD-L1表達(dá)水平=染色陽性細(xì)胞數(shù)比例等級×染色強(qiáng)度等級[10]。①染色陽性細(xì)胞數(shù)比例判斷方法：于400倍鏡下選擇10個(gè)視野，觀察每個(gè)視野計(jì)數(shù)的100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)占比；②染色陽性細(xì)胞數(shù)比例等級判定標(biāo)準(zhǔn)：共分為4級，其中0級：陽性細(xì)胞<10%；1級：陽性細(xì)胞10%～25%；2級：陽性細(xì)胞26%～50%，3級：51%～75%；4級：76%～100%[11]；③染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) 0級：無著色；1級：淺棕色；2級：棕色；3級：深棕色[12]。表達(dá)水平<6為低表達(dá)，≥6為高表達(dá)。

分析所有患者中統(tǒng)計(jì)隨訪結(jié)束時(shí)所有患者淋巴轉(zhuǎn)移情況，比較轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移患者臨床資料[包括：年齡、性別構(gòu)成、BMI、TMN分期、病理分型、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)表達(dá)水平]、影像學(xué)資料(包括：腫瘤直徑、影像學(xué)特征、病灶位置)之間的差異。分析根據(jù)HIF-1α、PD-L1對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判定標(biāo)準(zhǔn)將所有患者根據(jù)兩種蛋白的表達(dá)量分別分為高表達(dá)和低表達(dá)組，并比較二組之間淋巴轉(zhuǎn)移情況之間的差異。

從患者出院開始進(jìn)行為期24個(gè)月的隨訪，主要通過電話及患者來院復(fù)查隨訪，CT復(fù)查按照《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》的標(biāo)準(zhǔn)，如隨訪期間患者自覺病情變化可隨時(shí)到院進(jìn)行檢查[9]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、納入研究患者的隨訪情況

截止2019年12月31日隨訪結(jié)束，92例患者完成隨訪，5例失訪，中位隨訪時(shí)間為22(14，24)個(gè)月；共發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)36例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率39.13%。

二、HIF-1α、PD-L1表達(dá)量對NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

按照 HIF-1α、PD-L1表達(dá)量將所有完成隨訪的患者進(jìn)行分組，HIF-1α高表達(dá)(n=27)，低表達(dá)(n=65)，患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為92.6%和26.9%，HIF-1α高表達(dá)的NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著高于低表達(dá)患者(log-rankχ2=63.052；P<0.001)。PD-L1高表達(dá)(n=28)和低表達(dá)(n=64)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為82.1%和21.3%，PD-L1高表達(dá)的NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著高于低表達(dá)患者(log-rankχ2=39.555；P<0.001)，具體見圖1，2。

圖1 HIF-1α表達(dá)量對于NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

圖2 PD-L1表達(dá)量對于NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

三、NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素Cox單因素分析

單因素Cox分析結(jié)果顯示， HIF-1α、PD-L1表達(dá)量、TMN分期、CEA、腫瘤直徑是NSCLC患者淋巴轉(zhuǎn)移的影響因素(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素分析

表2 影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Cox回歸分析結(jié)果

四、NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素Cox回歸分析

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以隨訪結(jié)束發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為因變量(1=是，0=否)；以 HIF-1α、PD-L1表達(dá)量(1=高表達(dá)，0=低表達(dá))TMN分期(1=Ⅱ期，0=Ⅰ期)，CEA(實(shí)測值)及腫瘤直徑(實(shí)測值)為自變量；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)間為時(shí)間軸進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示， HIF-1α高表達(dá)(HR=25.790,95%CI=10.005-30.287)、PD-L1高表達(dá)(HR=16.693，95%CI=12.014-20.356)、CEA(HR=1.058，95%CI=1.013-1.106)是NSCLC患者淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2。

討 論

淋巴轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC患者疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，對于臨床治療效果、遠(yuǎn)期生存率也有顯著的影響[13-14]。手術(shù)治療是目前多個(gè)指南中對于早期NSCLC患者必要治療方式，但對于術(shù)中淋巴結(jié)清掃及范圍的選擇在指南中仍需要主刀醫(yī)生進(jìn)行術(shù)中判斷，通過早期檢測并結(jié)合影像學(xué)證據(jù)可以為醫(yī)生選擇手術(shù)方式提供較好的參考，同時(shí)也為后期治療方案的優(yōu)化提供一定的幫助[15-16]。

以往研究顯示，HIF-1是體內(nèi)參與低氧代謝下細(xì)胞型號傳導(dǎo)的DNA結(jié)合型蛋白，而其中的α亞體被低氧狀態(tài)誘導(dǎo)激活，控制HIF-1的活性并調(diào)節(jié)其表達(dá)狀態(tài)[17-18]。PD-L1則是介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的重要因素，與PD-1結(jié)合后可通過ITSM募集SHP-2蛋白，促使T細(xì)胞抗原受體信號通路多個(gè)關(guān)鍵分子發(fā)生磷酸化，抑制T細(xì)胞的增殖及活性，PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的重要因素[19-20]。Zhao等[21]研究指出，EZH2抑制劑可以通過降低HIF-1α來抑制PD-L1的表達(dá)，說明二者與NSCLC的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。本文結(jié)果提示，NSCLC患者病灶內(nèi)的 HIF-1α、PD-L1表達(dá)量與其遠(yuǎn)期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)具有顯著的相關(guān)性。Samulitis等[22]研究提出，正常細(xì)胞中HIF-1α半衰期較短，而腫瘤細(xì)胞在快速大量的增殖過程中往往處于相對缺氧狀態(tài)，故HIF-1α極易被激活并維持較高的表達(dá)水平。由此可以認(rèn)為，當(dāng)NSCLC患者瘤細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)時(shí)HIF-1α?xí)弑磉_(dá)，而快速增殖狀態(tài)的癌細(xì)胞也更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。正常人體內(nèi)活化PD-L1表達(dá)的信號通路相對較多，已經(jīng)被證實(shí)的有ALK/STAT3、PI3K、IFN-γ/JAK2/IFN及MEK/ ERK/STAT1四個(gè)通路，而上述通路中多個(gè)關(guān)鍵蛋白，如STAT3、PI3K及IFN-γ等均與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系，故上述通路在誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞增殖的同時(shí)，還能激活細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)，降低免疫系統(tǒng)的抗癌反應(yīng)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散，并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[23-25]。

研究指出CT對于淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移的判斷并無顯著優(yōu)勢，而且由于早期NSCLC患者淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移灶增大不顯著，通過影像學(xué)特征判斷可能與炎性或肉芽腫性病灶混淆從而導(dǎo)致誤診的情況發(fā)生，這也充分說明了影像學(xué)檢測在判斷NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上的局限性[26-27]。本文顯示，HIF-1α、PD-L1表達(dá)量及CEA水平是影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，此結(jié)果再次說明了HIF-1α、PD-L1表達(dá)量對于NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。而Tomita等[28]研究顯示，CEA對于NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測及判定價(jià)值，而且CEA對NSCLC的影響力受到腫瘤直徑的影響，這與本文研究結(jié)果類似。雖然根據(jù)肺癌TMN分期標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤直徑是判定患者TMN分期的重要因素，同時(shí)多個(gè)研究結(jié)果顯示，分期較高的患者癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移性也相對較高，故發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性也較大[29-30]，但本文中多數(shù)患者為早期，腫瘤直徑也相對較小，由于其他因素的共同作用將TMN分期和直徑對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響抵消，同時(shí)本文為單中心小樣本量研究，結(jié)果可能存在一定偏倚，這也可能成為導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異的原因。

綜上，HIF-1α、PD-L1表達(dá)量與NSCLC患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)存在顯著相關(guān)行，對于NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有預(yù)測價(jià)值，有助于NSCLC患者疾病進(jìn)展的防治。