TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷引起的細(xì)胞凋亡

段 銳 金發(fā)光

溺水是意外死亡常見的原因之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，在世界范圍內(nèi)，每年因溺水而死亡的人數(shù)高達(dá)4.5萬，目前仍然是一項重要的醫(yī)學(xué)和社會問題[1]。在溺水期間，氣道被堵塞且呼吸被抑制，缺氧是溺水后最主要的生理異常現(xiàn)象，由于呼吸暫停，溺水受害者最初表現(xiàn)為低氧血癥，但隨著時間的推移，會導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury, ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[2-4]。而具有高滲透壓的海水，可直接通過肺泡上皮引起嚴(yán)重的ALI或ARDS，并引起肺組織細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]，但海水淹溺肺損傷(seawater induced acute lung injury, SWD-ALI)引起肺組織細(xì)胞凋亡的機制尚不清楚，有待深入挖掘。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在多種生命活動中扮演重要角色，而Smad蛋白是TGF-β超家族的直接底物，Smad2可被TGF-β1直接激活，TGF-β1/Smad2信號通路與多種原因引起的肺損傷有關(guān)[6-7]，且參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程[8-9]，但在SWD-ALI引發(fā)細(xì)胞凋亡中的作用尚未見報道。于是本研究在細(xì)胞水平上初步探討TGF-β1/Smad2信號通路是否參與SWD-ALI引發(fā)的細(xì)胞凋亡過程。

材料與方法

一、藥物與試劑

TRIpure、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京BioTeke公司；SYBR Green購自北京Solarbio公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、SDS-PAGE電泳液(干粉)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL發(fā)光液購自中國wanleibio公司；PVDF膜購自美國Millipore；TGF-β1、p-Smad2、Smad2、Cleaved Caspase-3抗體購自中國wanleibio公司；Hoechst染色試劑盒購自中國Beyotime公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、MTT試劑購自中國wanleibio公司。

海水的制備：根據(jù)中國國家海洋局第三海洋研究所，海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水主要成分配制，pH 8.2，比重1.05，NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L；SB431542購自中國阿拉丁公司：稱取3.8 mg的SB431542溶于1 ml的DMSO中，配制成濃度為10 mM的母液，備用。

二、動物與細(xì)胞株

1. 實驗材料： A549人肺癌細(xì)胞系(由本實驗室保存)。

2. 實驗儀器： 超純水系統(tǒng)(香港Heal Force公司)；-70 ℃超低溫冰箱(安徽中科美菱公司)；超凈工作臺(蘇州凈化公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力申公司)；酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；熒光定量PCR儀(韓國BIONEER公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；雙垂直蛋白電泳儀(北京六一公司)；超速冷凍離心機(湖南湘儀公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

三、實驗方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理： A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，分成3組，即對照組、海水組和抑制劑組，其中對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，海水組細(xì)胞用濃度為40%的海水處理4 h，抑制劑組細(xì)胞用濃度為10 μm的SB431542預(yù)處理2 h后，加入濃度為40%的海水處理4 h，處理完畢后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

2. MTT檢測細(xì)胞活力： 取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔4×103個細(xì)胞，設(shè)置5個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為20%、40%、60%的海水，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下處理4 h。棄去各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，更換成濃度為0.5 mg/ml MTT混合液，于37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h，棄上清后，加入150 μl DMSO避光靜置10 min，溶解細(xì)胞內(nèi)形成的紫色結(jié)晶，然后在酶標(biāo)儀上測定其在570 nm處的OD值。

3. 細(xì)胞凋亡的檢測: ①流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況：將細(xì)胞按1×105的細(xì)胞量接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞加藥方式處理后，收集各組細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入10 μl Propidium Iodide混勻，于室溫避光孵育15 min，隨即應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測; ②Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡情況：將細(xì)胞按4×104的細(xì)胞量接種于12孔板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞加藥方式處理后，棄去上清，PBS洗滌2遍后，加入0.5 ml固定液，室溫固定15 min，棄固定液，PBS洗滌2遍后，均勻滴加0.5 ml Hoechst染色液，染色5 min，棄染色液，PBS洗滌2遍后，封片，于熒光顯微鏡(400×)下進(jìn)行觀察拍照。

4. Real-time PCR： 收集按照細(xì)胞加藥方式處理后的細(xì)胞，采用TRIpure法提取細(xì)胞中總RNA，使用紫外分光光度計測量RNA的濃度后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板，備用。取1 μl cDNA模板，加入待測基因上下游引物各0.5 μl、SYBR GREEN mastermix 10 μl和ddH2O 8 μl，于熒光定量儀進(jìn)行定量分析(反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min、94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，4 ℃保存)。

5. Western blot： 收集按照細(xì)胞加藥方式處理后的細(xì)胞，采用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白，用BCA法測量其濃度后，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉后。滴加一抗(TGF-β1 1︰500、Smad2 1︰500、p-Smad2 1︰400、Cleaved Caspase-3 1︰1 000)，于4 ℃條件下過夜孵育，滴加二抗(羊抗兔IgG-HRP 1︰5 000)，于37 ℃條件下孵育45 min(注：如是普通抗體，封閉液、一抗、二抗的孵育液為5%脫脂奶粉，如是磷酸化抗體，則封閉液、一抗、二抗的孵育液為1% BSA溶液)，再進(jìn)行ECL底物發(fā)光，然后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

結(jié) 果

一、不同濃度的海水對A549細(xì)胞活力的影響

分別用濃度為20%、40%、60%的海水處理A549細(xì)胞4 h后，采用MTT法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，隨著海水濃度的增加，A549細(xì)胞的活力逐漸下降，其中濃度為20%海水并未引起細(xì)胞活力顯著性下降，當(dāng)濃度大于40%時，細(xì)胞活力開始明顯下降，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。本結(jié)果中選用濃度為40%的海水進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 MTT法檢測細(xì)胞活力結(jié)果

二、海水引起A549細(xì)胞發(fā)生凋亡

當(dāng)用濃度為40%的海水處理A549細(xì)胞時，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(如圖4B所示，P<0.001)；采用Hoechst染色觀察凋亡情況，結(jié)果如圖2A、2B所示，海水處理后，A549細(xì)胞核呈現(xiàn)出致密濃染，顏色發(fā)白，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象；同時我們還采用了流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，對照組細(xì)胞的早期凋亡率為0.068，晚期凋亡率為0.006，而海水處理后，細(xì)胞的早期凋亡率變?yōu)?.064，晚期凋亡率變?yōu)?.220，總凋亡率顯著上升，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。以上結(jié)果提示SWD-ALI可引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡結(jié)果(400×)

三、TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷細(xì)胞凋亡過程

用海水處理A549細(xì)胞后，TGF-β1 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且用TGF-β1受體抑制SB431542處理后，TGF-β1的表達(dá)顯著下調(diào)(如圖3A、3B所示，P<0.001)，而Smad2 mRNA與蛋白表達(dá)水平無顯著性變化，但海水處理后，Smad2磷酸化蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且抑制劑處理后明顯被恢復(fù)(如圖3B所示)。另外發(fā)現(xiàn)海水使A549細(xì)胞發(fā)生顯著性凋亡，但用抑制劑處理后，由海水引起的凋亡現(xiàn)象被顯著緩解，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(如圖2所示，P<0.001)，同時抑制劑組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也顯著降低，趨于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(如圖3B所示，P<0.001)。以上結(jié)果提示SWD-ALI可通過激活TGF-β1/Smad2信號通路，促使細(xì)胞凋亡。

討 論

在意外死亡原因的排行榜上，溺水位列第二，主要發(fā)生在兒童和青少年群體中[10-11]，溺水后果的嚴(yán)重與否主要依賴于吸入水的成分與數(shù)量[12]，具有滲透壓的海水吸入是引起ALI的重要原因之一，其主要癥狀為肺水腫和嚴(yán)重的難治性低氧血癥[13-14]。探究其癥狀的機理是開發(fā)新的治療藥物的關(guān)鍵。

圖3 TGF-β1/Smad2信號通路相關(guān)指標(biāo)mRNA與蛋白表達(dá)水平；注：A：Real-time PCR檢測相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平

凋亡是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而由基因調(diào)控的程序性死亡，此過程是一個主動過程，它涉及一系列基因表達(dá)與調(diào)控的過程，是細(xì)胞的一種保護性措施。目前已知多種原因引起的肺損傷均會引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[15-16]，Han等[5]用海水建立SWD-ALI大鼠模型及細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)海水可激活凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8與Caspase-3；Li等[17]采用TUNEL法觀察SWD-ALI大鼠模型肺組織時，發(fā)現(xiàn)肺組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，且Caspase-3的表達(dá)水平上調(diào)；在本研究中，我們用海水處理A549細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，海水使細(xì)胞凋亡率顯著增加；Hoechst染色觀察發(fā)現(xiàn)海水使細(xì)胞核呈現(xiàn)出致密濃染，顏色發(fā)白，且數(shù)量增多；Western blot對凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)海水使該指標(biāo)表達(dá)水平顯著上調(diào)，以上實驗結(jié)果提示海水可引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，并與前人的報道相符合。由此可見，海水淹溺肺損傷(SWD-ALI)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡的現(xiàn)象比較常見，不可忽略，探索其發(fā)生的機制刻不容緩。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是由TGF-β超家族中重要的一員，參與多種生命活動，包括細(xì)胞生長、遷移、分化及凋亡等。研究表明，在百草枯引發(fā)的ALI中，TGF-β1被激活[18]；在脂多糖引起的ALI中，TGF-β1亦被激活[19]；同樣在本研究中，海水處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞中TGF-β1 mRNA與蛋白水平表達(dá)顯著上調(diào)，可見TGF-β1在ALI中具有重要作用。眾所周知，TGF-β1與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[9，20-21]，但TGF-β1在SWD-ALI引發(fā)的細(xì)胞凋亡中的作用還未見報道。Smad蛋白是TGF-β超家族的直接底物，可將TGF-β傳遞的信號攜帶進(jìn)入細(xì)胞核中，從而影響細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程[22-23]。而Smad2可被TGF-β1直接激活，TGF-β1活化后與Smad2磷酸化形式相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動[24-30]。同時，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad2信號通路參與地塞米松調(diào)節(jié)A549細(xì)胞凋亡的過程[8]，但TGF-β1/Smad2信號通路是否參與SWD-ALI引發(fā)細(xì)胞凋亡過程尚不清楚，本研究通過使用TGF-β1受體抑制劑SB431542預(yù)處理A549細(xì)胞后，再用海水進(jìn)行處理，流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色及Western blot等檢測均發(fā)現(xiàn)，由海水引起的凋亡現(xiàn)象被抑制劑顯著緩解，同時發(fā)現(xiàn)TGF-β1的異常上調(diào)也被緩解，而Smad2的表達(dá)無明顯變化，但其磷酸化形式的變化與預(yù)期結(jié)果一致。本次實驗結(jié)果與前人研究報道相一致，均表明TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡過程。

本文結(jié)果可為探索海水淹溺肺損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡的機制提供一定的理論基礎(chǔ)，同樣也可為臨床開發(fā)有效治療藥物提供新的思路。