白藜蘆醇對(duì)小細(xì)胞肺癌C-myc基因表達(dá)的調(diào)控研究

李王平 馬李杰 潘 蕾 金發(fā)光

白藜蘆醇(Resveratrol, Res)廣泛存在于葡萄，漿果，花生和葡萄酒中，并具有多種已知的治療作用，如抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗癌等作用[1-4]。實(shí)際上，Res可抑制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)并降低癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡[5-7]。myc是人類癌癥中最高度擴(kuò)增的致癌基因之一，包括C-myc，N-myc，L-myc，70%的人類癌癥都有myc 表達(dá)下調(diào)或上升，其中C-myc在肺癌組織中過(guò)度表達(dá)，而正常組織無(wú)表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)率增高[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)C-myc 蛋白分子中有誘導(dǎo)凋亡活性的結(jié)構(gòu)域，可雙向激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因和誘導(dǎo)凋亡的基因[10]。前期研究證實(shí)，Res可通過(guò)內(nèi)源性線粒體功能障礙途徑誘導(dǎo)SCLC H446細(xì)胞的凋亡并可調(diào)控Bcl-2、Bc1-xL、Bax等調(diào)亡調(diào)控因子[11]。因此，本文的目的評(píng)估白藜蘆醇對(duì)易在小細(xì)胞肺癌表達(dá)C-myc基因的調(diào)節(jié)作用，探討其在小細(xì)胞肺癌中的可能抑癌機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。FBS培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，白藜蘆醇購(gòu)自Sigma 公司，DMSO 購(gòu)自Invitrogen 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基公司，核蛋白/胞漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自貝博公司，HRP 標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天。主要儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)熱電公司)，光學(xué)顯微鏡、倒置拍攝顯微鏡(蔡司公司)，低速離心機(jī)(湘儀)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(賽默飛)，一體式化學(xué)發(fā)光成像儀(天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng))，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (羅氏) Western blot使用一抗為兔來(lái)源的抗C-myc抗體、兔來(lái)源的抗LaminA/L抗體)；相應(yīng)的二抗為(山羊抗兔和山羊抗鼠)。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法：(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3 ml/每孔，密度為 5×104cells/ml，每組梯度3個(gè)復(fù)孔，5% CO237 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；(2)實(shí)驗(yàn)分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設(shè)空白對(duì)照組，給藥后培養(yǎng)24 h；(3)實(shí)驗(yàn)分組2：將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至30 μg/ml，分別給藥處理0、3、6、12、24 h；(4) 實(shí)驗(yàn)分組3：將 NAC用完全培養(yǎng)基稀釋至2 mmol/L，預(yù)處理細(xì)胞1 h，將白藜蘆醇用完全培養(yǎng)基稀釋至35 μg/ml 再處理細(xì)胞24 h。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組(CK)、Res組(35 μg/ml)、NAC組(2 mmol/L)、 Res+NAC 組；(5)實(shí)驗(yàn)分組4：順鉑濃度為 5 μg/ml，Res濃度為35 μg/ml，給藥處理24 h，實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組(CK)、Res組(35 μg/ml)、順鉑組(5 μg/ml)、順鉑+Res 組；(6)收集各組細(xì)胞，抽提RNA和蛋白進(jìn)行Western blot、PCR檢測(cè)。

2. Western blot檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平： 根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞質(zhì)、核蛋白和總蛋白樣本。使用商用試劑盒通過(guò)BCA定量分析不同組的總蛋白量。12%SDS-PAGE分離等量的變性蛋白(20 μg)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%(W/V)脫脂牛奶封閉，加入的一抗(稀釋度為1︰2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。將膜與二抗室溫下孵育1 h。一體式化學(xué)發(fā)光儀記錄Western blot結(jié)果，拍攝照片。注：一抗分別為(小鼠來(lái)源的抗GAPDH抗體、兔來(lái)源的抗C-myc抗體、兔來(lái)源的抗LaminA/C抗體)；相應(yīng)的二抗為(山羊抗兔和山羊抗鼠)。運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，并將灰度分析整理在 Excel 工作簿中，并且作出對(duì)應(yīng)的柱狀圖。

3. Real-Time PCR檢測(cè)myc基因表達(dá)： 依照以下次序進(jìn)行：RNA的抽提、逆轉(zhuǎn)錄c DNA(方法按第一鏈c DNA合成試劑盒所示步驟進(jìn)行c DNA的合成)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，Real-time PCR所需引物使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，內(nèi)參為管家基因GAPDH)、Real time- PCR反應(yīng)體系(反應(yīng)液的配制按Real-time PCR反應(yīng)體系要求進(jìn)行)、PCR擴(kuò)增條件(94 ℃ 10 min，(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min)，最后于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)分析結(jié)果。

引物由上海生工公司合成，引物序列如下：

C-myc(Human)-RT-F：5′-CCGAAGGGAGAAGG

GTGT-3′

C-myc(Human)-RT-R：5′-CTGCGACGAGGAGG

AGAA-3′

Human GAPDH -RT-F：5′-AGAAGGCTGGGGCT

CATTTG-3′

Human GAPDH -RT-R：5′-AGGGGCCATCCACA

GTCTTC-3′

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為檢驗(yàn)水平。

結(jié) 果

一、Western blot結(jié)果

1. 不同濃度 Res 給藥時(shí)各觀察指標(biāo)蛋白的表達(dá)情況： Western blot 條帶觀察及灰度分析結(jié)果表明，與CK相比，不同濃度Res作用時(shí)，隨著Res給藥濃度的增加，胞漿蛋白和胞核蛋白中C-myc 表達(dá)均在Res濃度為 30 μg/ml 顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。并隨著濃度增高，進(jìn)一步下降，組間(Res濃度為30 μg/ml和40 μg/ml)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。P值：胞漿蛋白：20 μg/ml(P=0.3766)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)；胞核蛋白：20 μg/ml (P=0.37837)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)，見(jiàn)圖1、2。

2. Res給藥不同時(shí)間相關(guān)蛋白的表達(dá)： Western blot條帶結(jié)果及灰度分析結(jié)果表明，與CK組相比，隨著Res給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，胞漿蛋白中C-myc表達(dá)下降，同樣胞核中C-myc表達(dá)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，胞核與胞漿蛋白中C-myc表達(dá)呈同向變化。P值：胞漿蛋白： 3 h(P=0.16764)、6 h(P=0.09045)、12 h、24 h(P=0.00)；胞核蛋白：3 h(P=0.09631)、6 h(P=0.37860)、12 h、24 h(P=0.00)，見(jiàn)圖3、4。

3. NAC 預(yù)處理后對(duì)蛋白表達(dá)的影響： 從前面的 Res 濃度及作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Res對(duì)C-myc蛋白表達(dá)有明顯的調(diào)控作用。而與Res組相比，NAC預(yù)處理后再給予Res的Western blot條帶及灰度分析結(jié)果表明，給予NAC預(yù)處理后，可使Res給藥后，胞漿中C-myc表達(dá)上升，即起到拮抗Res效應(yīng)的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。胞漿蛋白：與CK比較Res(P=0.00)、Res+NAC(P=0.00222)、組間比較(P=0.00)；胞核蛋白：與CK比較Res(P=0.00)、Res+NAC(P=0.00)、組間比較(P=0.00201)，見(jiàn)圖5、圖6。

圖1 不同濃度Res作用時(shí)蛋白的表達(dá)變化(μg/ml) 圖2 不同濃度 Res作用時(shí)蛋白的表達(dá)灰度分析(μg/ml )

圖3 Res作用不同時(shí)間蛋白的表達(dá)變化(μg/ml) 圖4 Res作用不同時(shí)間蛋白的表達(dá)灰度分析 (μg/ml)

圖5 NAC預(yù)處理后對(duì)蛋白表達(dá)的影響 圖6 NAC預(yù)處理后對(duì)蛋白表達(dá)的影響

4. 順鉑與Res聯(lián)合作用對(duì)蛋白表達(dá)的影響： Western blot條帶及灰度分析結(jié)果顯示，順鉑對(duì)胞漿胞核中的C-myc蛋白表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用，與CK相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；順鉑與Res聯(lián)用后對(duì)胞漿中的C-myc蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)作用更加顯著，呈協(xié)同效應(yīng)，與Res相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。但與Res相比，順鉑聯(lián)合給藥后，胞核中C-myc的表達(dá)雖進(jìn)一步下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。P值：胞漿蛋白：Res(P=0.00)、順鉑(P=0.00)、順鉑+Res(P=0.00)、Res與順鉑+Res組間比較(P=0.00)；胞核蛋白：Res(P=0.01568)、順鉑(P=0.00905)、順鉑+Res(P=0.00)、Res 與順鉑+Res，組間比較(P=0.0659)，見(jiàn)圖7、8。

二、Real-time PCR結(jié)果

1. 不同濃度Res給藥時(shí)C-myc的表達(dá)變化： 與CK組相比，Res給藥后C-myc表達(dá)下降，并在30 μg/ml時(shí)發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，說(shuō)明Res對(duì)C-myc基因的調(diào)節(jié)與藥物濃度有關(guān)。P值：20 μg/ml(P=0.19172)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)，見(jiàn)圖9 。

2. Res給藥不同時(shí)間C-myc表達(dá)水平的變化： 隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，C-myc表達(dá)開始下降，在24 h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，與CK組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，說(shuō)明Res對(duì)C-myc基因的調(diào)節(jié)與藥物作用時(shí)間有關(guān)。P值：3 h(P=0.72209)、6 h(P=0.24021)、12 h(P=0.00544)、24 h(P=0.00)，見(jiàn)圖10。

3. NAC 預(yù)處理后C-myc表達(dá)的變化： Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果提示，Res給藥可引起C-myc表達(dá)水平下降，NAC預(yù)處理后再給予Res，可發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理對(duì)Res引起的C-myc表達(dá)下降能起到拮抗作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。P值：與CK比較Res(P=0.00)、NAC+Res(P=0.00)、組間比較(P=0.00)，見(jiàn)圖11。

4. 順鉑聯(lián)合用藥時(shí)C-myc表達(dá)變化： 順鉑和Res均可使C-myc表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；兩者聯(lián)合使用，可使其表達(dá)下調(diào)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，說(shuō)明兩者聯(lián)用可起到協(xié)同效果。P值：與CK比較Res(P=0.00)、順鉑(P=0.00)、順鉑+Res(P=0.00)、Res 與順鉑+Res比較(P=0.00)，見(jiàn)圖12。

圖7 順鉑聯(lián)合用藥時(shí)蛋白表達(dá)變化 圖8 順鉑聯(lián)合用藥時(shí)蛋白表達(dá)變化

圖9 不同濃度Res對(duì)C-myc表達(dá)水平的影響(μg/ml) 圖10 Res給藥不同時(shí)間C-myc表達(dá)水平變化(h) 圖11 NAC預(yù)處理后C-myc表達(dá)變化 圖12 順鉑聯(lián)合用藥時(shí)C-myc的表達(dá)變化

討 論

小細(xì)胞肺癌占肺癌種類的15%～20%，然而80%的小細(xì)胞肺癌診斷時(shí)已是廣泛期[12]。由于小細(xì)胞肺癌惡性程度高，倍增時(shí)間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，雖然對(duì)化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)，截止目前，小細(xì)胞肺癌的治療方法仍以放化療為主。一旦化療耐藥，小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間顯著縮短。小細(xì)胞肺癌的治療效果在過(guò)去的幾十年中沒(méi)有明顯改善，對(duì)于小細(xì)胞肺癌靶向治療及免疫治療的相關(guān)研究較為滯后。雖然已有一些針對(duì)小細(xì)胞肺癌靶向治療的臨床實(shí)驗(yàn)，但目前尚未有明確療效的報(bào)道，部分患者使用免疫調(diào)節(jié)劑，但療效欠佳[13]。早在1997年，Jang等[14]即發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的抗癌活性貫穿于癌癥的整個(gè)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，可減少自由基形成、抑制環(huán)氧合酶、過(guò)氧化氫酶、抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化和凋亡等。前期的研究結(jié)果同樣證實(shí)白藜蘆醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌H838和H520細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并提示其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)[11,15]。myc癌基因蛋白屬于一個(gè)所謂的“超級(jí)轉(zhuǎn)錄因子”家族，它可能調(diào)控著整個(gè)基因組至少15%的轉(zhuǎn)錄[16]。其主要下游效應(yīng)包括核糖體生物發(fā)生、蛋白翻譯、細(xì)胞周期進(jìn)展和代謝，有著廣泛的生物功能，如細(xì)胞增殖、分化、生存和免疫監(jiān)視等[17]。正常情況下，myc家族成員的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，但在人類癌癥中其功能經(jīng)常失調(diào)[18]。小細(xì)胞肺癌基因組存在較高的基因突變率，如myc，TP53，TP73，KRAS，RB1等，但目前的研究還未能發(fā)現(xiàn)有明確針對(duì)小細(xì)胞肺癌的靶向藥物[19-20]。一項(xiàng)體內(nèi)外試驗(yàn)認(rèn)為，SCLC基因中存在myc擴(kuò)增或高表達(dá)時(shí)，可能對(duì)Aurora激酶抑制劑 Barasertib有反應(yīng)[21]。因此研究小細(xì)胞肺癌與myc基因的關(guān)系，篩選可能有效的治療小細(xì)胞肺癌的藥物具有基礎(chǔ)研究及臨床研究?jī)r(jià)值。

本文通過(guò)Western blot和Real time-PCR兩種方法分別對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞的C-myc基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，采取不同濃度、不同作用時(shí)間，以及使用NAC和順鉑進(jìn)行干預(yù)對(duì)照的方式，論證白藜蘆醇對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞的C-myc基因表達(dá)是否有調(diào)控作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，H446細(xì)胞中C-myc基因蛋白的表達(dá)升高，說(shuō)明C-myc基因與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，與研究報(bào)道的C-myc在肺癌組織中過(guò)度表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)率增高的研究結(jié)論相符[9]。而給予白藜蘆醇后可降低H446細(xì)胞胞核蛋白和胞漿蛋白中C-myc基因的表達(dá)水平，其表達(dá)水平變化與Res的濃度和作用時(shí)間有關(guān)，呈現(xiàn)濃度依賴和時(shí)間依賴的特點(diǎn)。給予NAC預(yù)處理后，可拮抗Res給藥引起的C-myc基因的表達(dá)水平下降程度，而聯(lián)用順鉑后，則起到明顯的協(xié)同作用。

myc癌基因家族包括3個(gè)成員，C-myc，mycn和mycl，分別編碼C-myc、N-myc和L-myc[16]。目前對(duì)L-myc的作用仍不太清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，N-myc表達(dá)是在組織中是受限的，認(rèn)為N-myc可以替代小鼠中C-myc的作用[22-23]。而C-myc蛋白分子中有誘導(dǎo)凋亡活性的結(jié)構(gòu)域，可雙向激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因和誘導(dǎo)凋亡的基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)myc水平適度增加可以刺激細(xì)胞和機(jī)體的生長(zhǎng)，但過(guò)度激活時(shí)則誘導(dǎo)細(xì)胞自主凋亡，抗凋亡的Bcl家族成員在淋巴瘤和實(shí)體瘤中均可介導(dǎo)myc驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡，小鼠淋巴瘤模型證實(shí)p53可參與介導(dǎo)myc誘導(dǎo)的凋亡[24]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤在同時(shí)表達(dá)Bcl-2和C-myc，N-myc時(shí)，侵襲作用更加明顯[25-31]。以上研究均說(shuō)明myc基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且myc基因與調(diào)亡相關(guān)蛋白關(guān)系密切。前期研究證實(shí)了白藜蘆醇可誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的調(diào)亡，其作用機(jī)制與調(diào)亡調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)[11,27]。本文發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低C-myc基因的表達(dá)水平，并有時(shí)間和濃度依賴的特點(diǎn)。而與順鉑聯(lián)合，可增強(qiáng)順鉑對(duì)C-myc基因表達(dá)水平的影響，說(shuō)明白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)控C-myc基因的表達(dá)對(duì)H446細(xì)胞的增殖起到抑制作用，而其作用機(jī)制是否與調(diào)亡有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本文缺陷在于僅觀察了C-myc基因的表達(dá)變化，而未對(duì)L-myc和N-myc進(jìn)行同步觀察，以更加深層次了解myc基因在小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。此外，本文僅為細(xì)胞水平研究，尚待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。